本發明涉及生物
技術領域：
，具體地，涉及用于檢驗臨床樣本中活菌體的熒光PCR引物探針組及試劑盒。
背景技術：
：作為一種臨床常見的疾病，細菌感染的危害性極大，嚴重威脅人類健康，甚至產生致命危害。其中無菌體液(血液、腦脊液、胸腹水、關節液)的感染病引起的后果更加嚴重，往往導致急危重癥和多器官功能衰竭，如果不能快速診斷，并給予正確治療，病死率極高。目前臨床上多應用培養技術來診斷細菌感染，此方法雖然特異性高，但存在如下不足：(1)苛養菌或培養條件特別的細菌臨床分離率低；(2)細胞內寄生的微生物或無法人工培養的微生物多培養陰性；(3)臨床標本送檢之前使用廣譜抗菌藥物也容易導致培養陰性；(4)大部分細菌培養需要2-3天才有結果，而一些類似真菌等緩慢生長的細菌則培養時間更長。隨著分子生物學技術的發展，應用PCR(PolymeraseChainReaction)特異性擴增病原體核酸的方法已經越來越被人們所重視，然而，目前的PCR檢測方法容易出現假陽性結果，出現這種結果有兩方面的原因：一方面是由于DNA分子本身具有穩定性，當細菌死亡裂解后DNA仍然可以長期滯留在體內，各種核酸擴增技術在檢測標本時均難以將活菌跟死菌區分開，只有活的微生物所反映出來的信息才有意義，因此當利用分子生物技術進行檢測和分析時，檢測和分析的主體是這些活的微生物；另一方面是檢測試劑，TaqDNAPolymerase是從克隆有ThermuaquaticusDNAPolymerase基因的大腸桿菌經誘導表達后分離純化的，由此造成的DNA污染始終都無法避免。另外，沒有內部質控易造成假陰性，這些都不利于臨床診斷。相關報道使用PCR方法檢測臨床標本中的細菌感染，比如中國專利申請號為201310068046.2的發明專利提供了一種從臨床標本中檢測結核菌感染的熒光定量PCR方法，該方法對每種細菌都設計一種特異性引物，而臨床病原體來源復雜，針對不同病原菌需要設計不同特異引物，限制了其臨床應用價值。如文獻“建立16srRNA的PCR-SBT法細菌鑒定及在敗血癥中的應用”(中華醫院感染學雜志2015年第25卷第10期)公開了一種利用16srRNA快速鑒定敗血癥患者體內的細菌的PCR方法，該方法采用的是普通PCR方法，敏感度比熒光定量低，且無內部質控，無法有效判定陰性結果是否為假陰性。技術實現要素：本發明的目的是解決現有的細菌感染檢測方法中存在的缺陷，提供一種快速檢驗臨床無菌體液中活菌的實時熒光PCR試劑盒。為達到以上目的，本發明提供了用于檢驗樣本中活菌體的熒光PCR引物探針組，其中，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探針。優選的，所述熒光PCR引物探針組還包括具有SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及含有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的探針。本發明還提供了一種樣本中活菌體的熒光PCR檢測方法，其中，所述檢測方法包括如下步驟：(1)用PMA孵育待測樣本和熒光PCR試劑，提取待測樣本的總DNA，；(2)以總DNA為模板，并使用本發明所述的引物探針組和PMA孵育后的熒光PCR試劑進行熒光PCR反應；(3)收集檢測通道熒光信號，得到檢測結果；在空白對照、陽性對照和陽性內對照成立的情況下，在熒光檢測通道中：a)若樣本有S型擴增，且CT值小于35，則判定樣本為陽性；b)若樣本有S型擴增，且CT值小于40并大于等于35，則判定為不確定樣本，需重新提取核酸后進行復檢；若復檢的樣本仍有S型擴增，且CT值小于40，則判定樣本為陽性，否則為陰性；c)若樣本無明顯S型擴增曲線，但報告有CT值，則判定為非特異性擴增。本發明還提供了一種熒光PCR檢測樣本中活菌體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括本發明所述的引物探針組。另一方面，本發明還提供了如上所述的熒光PCR引物探針組在制備熒光PCR檢測樣本中活菌體的試劑盒中的用途。在本發明中，試劑盒利用PMA降解熒光PCR試劑和樣本中死菌殘留的DNA，避免了由試劑原因造成的假陽性結果的出現。該試劑盒采用特異性的引物和探針，能有效提高敏感度，在診斷使用過抗菌藥物的患者標本和苛養菌感染時仍能檢出細菌感染，有效避免假陰性。另外，試劑中添加了內部質控，可有效避免試劑失效或操作等造成的假陰性結果。本發明的有益效果在于：1、本發明的試劑盒可以用于臨床無菌體液活菌的通用檢測，在早期檢驗中有較高的應用價值，并且在診斷使用過抗菌藥物的患者標本和苛養菌感染時，具有更好的優越性。2、本發明的細菌快速檢驗試劑盒靈敏度高，對細菌檢測的靈敏度為5.0×10cfu/mL。3、本發明采用的試劑經過PMA處理，完全排除了受試劑影響造成的假陽性。4、體系中加入陽性內質控，在一個反應體系中完成內部質量控制。5、完全簡化了反應體系的配制，也減少了PCR操作過程中可能導致的污染，節省了實驗時間，達到快速檢測的目的。本公開的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。具體實施方式以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。本發明提供了用于檢驗樣本中活菌體的熒光PCR引物探針組，其中，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探針。其中，探針的5’有FAM；3’端有BHQ-1。其中，優選地，還包括具有SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的探針。其中，探針的5’有VIC；3’端有BHQ-1。SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列為以pET28a質粒為模板設計的一對引物及探針，作為檢測的陽性內對照(IAC)。本發明還提供了一種樣本中活菌體的熒光PCR檢測方法，該方法包括如下步驟：(1)用PMA孵育待測樣本和熒光PCR試劑，提取待測樣本的總DNA；(2)以總DNA為模板，并使用本發明所述的引物探針組和PMA孵育后的熒光PCR試劑進行熒光PCR反應；(3)收集檢測通道熒光信號，得到檢測結果；在空白對照、陽性對照和陽性內對照成立的情況下，在熒光檢測通道中：a)若樣本有S型擴增，且CT值小于35，則判定樣本為陽性；b)若樣本有S型擴增，且CT值小于40并大于等于35，則判定為不確定樣本，需重新提取核酸后進行復檢；若復檢的樣本仍有S型擴增，且CT值小于40，則判定樣本為陽性，否則為陰性；c)若樣本無明顯S型擴增曲線，但報告有CT值，則判定為非特異性擴增。其中，每條引物的最終使用濃度各自為0.2-0.6μM，每條探針的最終使用濃度各自為0.1-0.3μM。疊氮溴化丙錠(PMA)是一類對DNA具有高度親和力光敏DNA染料，經PMA前處理后樣本暴露于強光下時，PMA與DNA分子共價結合，阻斷DNA分子PCR擴增。利用PMA特性，能夠選擇性去除試劑中死菌DNA擴增，有效避免假陽性。PMA的質量濃度是影響試驗結果的一個重要因素。質量濃度過低不能全部去除試劑中死菌DNA的干擾，出現“假陽性”結果。在本發明的一種優選的實施方式中，可以通過以下方法進行PMA孵育：將PMA溶解于DMSO溶液中，制備成儲備液，低溫避光保存。使用時，將PMA儲備液稀釋為PMA工作液。在本發明的一種實施方式中，所述DMSO溶液中DMSO的濃度可以為20％。樣本孵育用PMA儲備液中PMA濃度為500-1000μg/ml，試劑孵育用PMA儲備液中PMA濃度為5-20μg/ml。將待測樣本與樣本孵育用PMA溶液接觸混合，其中所述樣本孵育用PMA溶液包括：PMA，水，DMSO，孵育的條件包括LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照5-10min。孵育結束后，提取樣本的總DNA作為熒光PCR模板。進行樣本孵育的體系中PMA的工作濃度為10-20μg/ml。將熒光PCR試劑與試劑孵育用PMA溶液接觸混合，其中，試劑孵育用PMA溶液包括：PMA，水，DMSO，孵育的條件包括LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照1-3min。進行試劑孵育的體系中PMA的工作濃度為0.5-10μg/ml。孵育結束后，加入10x引物探針混合液2.5μl；DNA模板5μl進行熒光PCR反應。其中，優選地，熒光PCR反應的條件包括如下步驟：a：95℃4-6min；b：95℃15-30s，c：50-60℃15-60s，b-c循環40個反應。在本發明所提供的方法中，閾值設定原則為以剛好超過正常陰性對照的熒光信號最高點為閾值線，或根據儀器噪音情況進行調整。其中，所述待測樣本可以包括但不限于血液、腦脊液、胸腹水和關節液中的至少一種。本發明的樣本中活菌體的熒光PCR檢測方法不用于診斷。或者說，檢測結果與疾病是否發生沒有一一對應的相關性，不屬于診斷結果，但是檢測結果能夠作為中間信息，供臨床醫生參考。本發明還提供了一種熒光PCR檢測樣本中活菌體的試劑盒，其中，所述試劑盒包括本發明所述的引物探針組。其中，優選地，所述試劑盒還包括5×反應體系緩沖液、DNA聚合酶、10×引物探針混合物、PMA、陽性對照和超純水。在所述試劑盒中，可以將PMA溶解于DMSO溶液中，制成儲備液，所述DMSO溶液中DMSO的濃度可以為20％。樣本孵育用PMA儲備液中PMA濃度為500-1000μg/ml，試劑孵育用PMA儲備液中PMA濃度為5-20μg/ml。另一方面，本發明還提供了如上所述的熒光PCR引物探針組在制備熒光PCR檢測樣本中活菌體的試劑盒中的用途。以下，通過實施例進一步詳細說明本發明。實施例11、引物和探針合成：按照表1所示的序列，進行SEQIDNO.1-6的引物和探針合成。表1引物和探針序列表2、待測活菌和死菌懸液制備挑取E.coli單菌落接種于10ml的LB培養基中37℃，培養16h，高速離心(5000g，4℃，5min)收集菌體沉淀，經0.85％滅菌生理鹽水洗滌2次后，重懸于生理鹽水中。稀釋使菌體細胞數為107cfu/ml后測定活菌數，再取部分活菌懸液95℃水浴10min，制成死菌懸液。另外，將死菌懸液在LB平板上劃線，于37℃培養48h，以驗證滅活效果。3、快速檢驗臨床無菌體液細菌感染的熒光定量PCR試劑盒的組建該試劑盒由2×PCRMasterMix、DNA聚合酶、PMA工作液A(將PMA溶于20％的DMSO溶液中獲得樣本孵育用PMA儲備液，其中PMA濃度為500μg/ml的溶液)、PMA工作液B(將PMA溶于20％的DMSO溶液中獲得試劑孵育用PMA儲備液，其中PMA濃度為6.75μg/ml的溶液)、10×引物探針混合液(引物及探針終濃度各自為400nM)、去離子水構成。其中，2×PCRMasterMix(TaqDNAPolymerase2U；Tris-HCl40mM(pH8.3)；KCl40mM；Tween-200.04％；(NH4)2SO410mM；MgCl28mM；dNTPs0.6mM)。4、試劑盒的操作和結果判斷(1)取樣本490μL，向待檢樣本中加入PMA工作液A10μL(使孵育體系中PMA的工作濃度為10μg/ml)，充分混勻后置于LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照5min；(2)核酸提取。分別對PMA孵育后的活菌懸液和死菌懸液進行總DNA的提取，每種樣本提取得到的總DNA溶解于TE緩沖液中，濃度為1ng/μL。(3)PMA處理試劑。取12.5μl2×PCRMaster于1.5mL離心管中，加入PMA工作液B1μl(使孵育體系中PMA的工作濃度為0.5μg/ml)，充分混勻后置于LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照3min。(4)反應體系配制。PMA處理過的2×PCRMasterMix試劑13.5μl；10x引物探針混合液：2.5μl；DNA模板：2-5μl；超純水補至25μl。(5)PCR反應。a：95℃5minb：95℃15sc：55-60℃30sb-c循環40個反應。(6)結果分析與判定。調整閾值：閾值設定原則為以剛好超過正常陰性對照的熒光信號最高點為閾值線，或根據儀器噪音情況進行調整。質量控制：空白對照成立，且陽性內對照有擴增(VIC)，表明所有PCR反應均成立，排除假陰性的結果，否則視實驗無效。結果判斷：a)若樣本有S型擴增(FAM)，且CT值<35，則判定樣本為陽性；b)若有S型擴增(FAM)，且35≤CT值<40，判定為不確定樣本，需重新提取核酸后進行檢測；若復檢的樣本仍有S型擴增，仍可以判定樣本陽性。(7)試劑盒通用性試驗及特異性實驗選取臨床常見的感染細菌(均來自CMCC)進行檢測。選擇蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、單核增生性李斯特氏菌、霍亂弧菌、空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、嗜水氣單胞菌、溶血葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形菌、液化沙雷菌、銅綠假單胞菌、產堿假單胞菌、鮑氏不動桿菌、嗜麥芽寡養單胞菌、黑色消化球菌作為通用性評估用菌株，選擇人類基因組、念珠菌、隱球菌、腺病毒、乙型肝炎病毒作為特異性評估用菌株。應用本發明試劑盒檢測這些待檢細菌，陽性內對照均為陽性，證明檢測系統成立；空白僅有IAC的擴增；以人類基因組、念珠菌、隱球菌、腺病毒、乙型肝炎病毒組成的混合模板無FAM通道擴增；各細菌均有FAM通道特異性擴增曲線。本實施例中以多種DNA為模板，進行了試劑盒的通用性及特異性試驗，全部為有效擴增，對PCR產物克隆后測序，測序結果顯示，各PCR檢測到的序列與已知各細菌序列一致，表明該方法具有較好的通用性及特異性。(8)試劑盒的最低檢出限試驗評估用檢測樣本：選擇大腸桿菌作為特定檢測的菌株，模板梯度稀釋成105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL，5.0×10CFU/mL，10CFU/mL的檢測樣本，進行操作和結果判斷，試劑盒檢測(不含IAC)的最低檢出限試驗結果(每個濃度做三個重復)如下表2所示：表2試劑盒最低檢出限試驗結果模板濃度105CFU/mL104CFU/mL103CFU/mL102CFU/mL5.0×10CFU/mL10CFU/mL實驗結果+/+/++/+/++/+/++/+/++/+/+-/-/-本實施例中以大腸桿菌DNA做模板，進行了試劑盒的最低檢出限試驗，檢測最高稀釋度為5.0×10CFU/mL，表明該方法具有較高的敏感性。實施例2本實施例用于說明處理試劑時PMA的使用濃度。利用實施例1的方法進行檢測，區別僅在于，在用PMA孵育熒光PCR試劑時，分別加入PMA工作液至PMA工作濃度分別為0、0.1、0.25、0.5、1、5、10μg/ml。選擇大腸埃希氏菌DNA(0.2ng/μl)作為對照組模板，結果顯示，當PMA工作濃度≥0.5μg/ml時，空白對照無擴增且對照組有擴增，可以排除試劑中死菌DNA的干擾。實施例3本實施例用于說明處理試劑時的曝光時間。利用實施例1的方法進行檢測，區別僅在于，PMA孵育熒光PCR試劑的光照時間分別為1、2、3、4、5、7.5、10min。空白對照模板為水，對照組模板為大腸埃希氏菌DNA(0.2ng/μl)。結果顯示，曝光時間超過3min后，隨著曝光時間的延長，Ct值變化不明顯，說明光照3min，可使加入PMA分子全部分解，3min為最佳曝光時間。實施例4本實施例用于說明處理樣本時PMA使用濃度。(1)抑制死菌PCR反應最小PMA濃度確定按照實施例1制備大腸埃希氏菌死菌菌懸液(105cfu/ml)取500μL，分別經PMA處理后，曝光10min，孵育體系中PMA工作濃度分別為0、1、2.5、5、10、15、20μg/ml。(2)不抑制活菌PCR反應最大PMA濃度確定按照實施例1制備大腸埃希氏菌活菌菌懸液(105cfu/ml)取500μL，分別經PMA處理后，曝光10min，孵育體系中PMA工作濃度分別為0、10、15、20、30、40、50μg/ml。利用實施例1的方法提取DNA，PCR擴增，分析結果。PMA工作濃度≤1μg/mlPMA對Ct值沒有明顯影響，當PMA工作濃度達到10μg/ml時，死菌細胞的PCR擴增完全被抑制。當PMA工作濃度≤20μg/ml時，對活細胞DNAPCR擴增的Ct值沒有明顯影響；當PMA工作濃度>20μg/ml時，擴增受到抑制。因此，當PMA工作濃度10μg/ml時，不僅有效抑制死菌擴增還遠遠小于可以抑制活細胞擴增的PMA工作濃度(20μg/ml)。實施例5本實施例用于說明處理樣本時的曝光時間。光照時間對活菌檢測準確率具有重要影響，光照時間不足，PMA不能完全分解，在后續提取過程中會與裂解活菌DNA分子結合，使PCR反應受到影響。按照實施例1制備大腸埃希死菌菌懸液(105cfu/ml)取500μL，分別經PMA(終濃度10μL/ml)處理后，分別曝光1、2、3、4、5、7.5、10min。結果顯示，曝光時間超過5min后，隨著曝光時間的延長，Ct值變化不明顯，說明光照5min，可使加的入PMA分子全部分解，5min為最佳曝光時間。以上詳細描述了本公開的優選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節，在本公開的技術構思范圍內，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。、另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合、為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內容。當前第1頁1 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