本發明屬于水稻基因工程領域，具體涉及一種水稻類病斑基因，以及該基因編碼的蛋白質。
背景技術：
：植物類病變是指植物在沒有受到任何明顯逆境脅迫、物理損害或者病原物侵害的情況下，植株上自發形成類似于某種病原物侵染后產生的壞死斑的現象。許多類病斑突變體在類病斑形成之前或者形成之后均表現出對病原物抗性的增強。能穩定遺傳的水稻類病斑突變體均符合經典的孟德爾遺傳規律，水稻中已報道了近200份類病變突變體，其類病斑性狀大部分受隱性單核基因控制。目前已有10個控制類病斑性狀的基因被克隆，主要是編碼剪接因子3b亞基的SPL5、編碼E3泛素連接酶的SPL11等(孫惠敏等.上海農業學報.2014年第3期)。水稻的抗病性高低與親本材料的血緣背景直接相關，已克隆的類病斑基因大多源于粳稻背景，而秈稻中鮮有報道，這也限制了類病斑材料在提高秈稻抗病性上的應用。技術實現要素：本發明人在對秈稻品種蜀恢498進行EMS(甲基磺酸乙酯)誘變時，意外發現一個秈稻背景的類病斑突變體材料a344，經過研究發現該水稻類病斑性狀由單隱性基因控制，而且進一步研究發現，該基因發生點突變后會顯著提高水稻對白葉枯病的抗性。本發明是在上述意外發現的基礎上完成的。本發明目的在于提供一種控制水稻類病斑性狀的蛋白質。本發明另一目的在于提供編碼上述蛋白質的基因。該基因能提高水稻對白葉枯病的抗性。本發明第三目的在于提供含有上述基因的表達載體。本發明第四目的在于提供上述基因在提高水稻抗白葉枯病上的用途。本發明第五目的在于提供利用上述基因培育抗白葉枯病的水稻品種的方法。為實現上述目的，本發明的技術方案如下：本發明提供了一種控制水稻類病斑性狀的蛋白質，命名為A344，是如下(1)或(2)：(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(2)將序列表中SEQIDN0.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸添加、取代或缺失而衍生的、且與控制水稻類病斑性狀相關的蛋白質。本發明還提供了編碼上述蛋白質的基因，命名為A344，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列組成；(b)與序列表中SEQIDNO.1限定的核苷酸序列具有至少90％的同源性，且編碼具有控制水稻類病斑性狀相關蛋白質功能的核苷酸序列；(c)對序列表中SEQIDNO.1限定的核苷酸序列中的一個或幾個核苷酸經過添加、取代或缺失而衍生的、且編碼具有控制水稻類病斑性狀相關蛋白質功能的核苷酸序列。本發明還提供了含有上述基因的表達載體。所述的表達載體是指質粒、宿主細胞或植物表達載體。所述的宿主細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞；本發明還提供了上述基因在提高水稻抗白葉枯病上的應用。利用上述基因培育抗白葉枯病水稻品種的方法，將上述基因轉化到水稻品種中。本發明具有的優點或有益效果：(1)、本發明類病斑基因的抗水稻白葉枯病效果好，且涉及的類病斑突變體和克隆的基因均來源于秈稻，可用于提高秈稻的抗白葉枯病，為秈稻的抗白葉枯病育種提供了一個新的途徑；(2)、本發明運用基因敲除新技術，成功獲得了粳稻背景下的類病斑材料，提供了利用該基因培育抗白葉枯病的粳稻品種的新方法。(3)、本發明基因由單隱性基因控制，轉基因或雜交后代鑒定和選擇比較簡單，便于應用。附圖說明圖1、為分蘗初期蜀恢498和突變體a344植株表型對比照片；其中1為蜀恢498；2為突變體a344。圖2、分蘗初期蜀恢498和突變體a344的新葉和老葉表型對比照片，其中1為新葉；2為老葉。圖3、蜀恢498和突變體a344接種P2后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖4、蜀恢498和突變體a344接種J3后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖5、蜀恢498和突變體a344接種8248后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖6、蜀恢498和突變體a344接種P7后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖7、蜀恢498和突變體a344接種PXO99后的抗性對比照片：其中1為IR24；2為IRBB21；3為蜀恢498；4為突變體a344。圖8、本發明類病斑候選基因精細定位示意圖。圖9、引物I7擴增后的電泳圖譜；其中1為花B；2為突變體a344；3為交換單株。圖10、引物I8擴增后的電泳圖譜；其中1為花B；2為突變體a344；3為交換單株。圖11、引物AA34擴增后的電泳圖譜；其中1為DNAMarker；2為突變體a344。圖12、引物P1028擴增后的電泳圖譜；其中1為DNAMarker；2為陽性大腸桿菌轉化子。圖13、引物P1092擴增后的電泳圖譜；其中1為DNAMarker；2為陽性轉基因植株。圖14、Crisper-A344載體示意圖。圖15、轉Crisper-A344敲除陽性植株的葉片類病斑表型對比圖片：其中1為陰性對照；2為Cas9-1；3為Cas9-2；4為Cas9-3；5為Cas9-4。具體實施方式實施例1本發明類病斑突變體a344分離與遺傳分析試驗(一)試驗材料類病斑突變體a344，花B和蜀恢498均來自于四川農業大學水稻研究所雜種優勢利用實驗室。其中類病斑突變體a344來源于以蜀恢498所構建EMS(甲基磺酸乙酯)誘變庫，經在四川溫江和海南陵水與蜀恢498進行多代回交后發現，該類病斑表型能穩定遺傳。(二)試驗方法類病斑突變體a344，花B和蜀恢498均種在四川農業大學水稻研究所溫江試驗田。利用突變體a344與花B、以及突變體a344與蜀恢498分別構建F2群體，統計F1和F2群體的分離比。(1)類病斑表型分析：與野生型蜀恢498相比，突變體a344從分蘗期開始葉片出現壞死斑點(見圖1),其中全展新葉上的斑點由葉尖向葉片基部蔓延，而老葉上的斑點則是從葉片基部向葉尖擴散(見圖2)。(2)遺傳分析：利用突變體a344分別與蜀恢498和花B雜交獲得F1，F1代植株均具有正常的葉片表型和生育期，F2代中的野生型和類病斑表型的分離比(見表1)，經卡方檢驗，符合孟德爾單基因隱性突變的分離比3:1，說明突變體a344的類病斑表型是受一對隱性核基因控制。表1突變體a344的遺傳分析試驗結果注：X20.05,1＝3.84實施例2本發明類病斑突變體a344對白葉枯病抗性鑒定對比試驗(一)試驗材料1、水稻材料(1)、突變體a344、蜀恢498均來源于四川農業大學水稻研究所雜種優勢利用實驗室。(2)、高感白葉枯病品種IR24和高抗白葉枯病品種IRBB21均來自于四川農業大學水稻研究所重大病害研究室。2、水稻白葉枯病菌的生理小種：J9、8248、P2、P6、J3或J7，均來自于四川農業大學水稻研究所重大病害研究室。(二)試驗方法1、水稻白葉枯病菌的培養取甘油保存的水稻白葉枯病菌，均勻地涂抹在固體培養基上，28℃倒置暗培養4天備用。所述的固體培養基配方(200ml)：蔗糖2g，L-谷氨酸鈉0.2g。將蔗糖和L-谷氨酸鈉混勻后，用NaOH調至PH＝7.0，再加入蛋白胨2g，混合后于滅菌高壓鍋121℃滅菌20分鐘。冷卻后倒成平板，4℃儲存。2、接種和觀察突變體a344、蜀恢498、高感白葉枯病品種IR24和高抗白葉枯病品種IRBB21均種在四川農業大學水稻研究所溫江試驗田。取培養好的白葉枯菌用水稀釋成吸光度OD600值為1.0的懸浮菌液。選擇夏季高溫傍晚且3小時后不下雨的時候接種，利于病菌侵染及發病。對處于分蘗盛期的植株采用剪葉法接種，在白葉枯感病品種IR24、抗病品種IRBB21、突變體a344和蜀恢498中隨機選取10株植株，每個單株選取3片全展新葉進行接種。3周后參照水稻的白葉枯病情分級標準(見表2)，測量病斑面積。表2水稻的白葉枯病情分級標準病級抗性反應抗性評價0病斑面積小于5.0％高抗1病斑面積占葉面積5.1-12.0％抗3病斑面積占葉面積12.1-25.0％中抗5病斑面積占葉面積25.1-50.0％中感7病斑面積占葉面積50.1-75.0％感9病斑面積大于葉面積75.1％高感結果與蜀恢498的病斑面積相比(見圖3至圖7)，突變體a344受6個生理小種浸染后的病斑面積均明顯減小(見表3)，其中對生理小種P6和J7的抗性達到高抗水平。表3四種材料對水稻白葉枯病的抗性反應結果實施例3:突變體a344候選基因的定位試驗按照如下方法進行：1.候選基因的定位(1)近等基因池構建從突變體a344與花B雜交得到的F2群體中，隨機選取30份有類病斑表型的單株葉片和10份正常單株葉片，每10株的葉片等量混合提取DNA建池，包括3個隱性池和1個顯性池在內的共計4個池，用于突變體a344與花B基因組之間的多態性檢測。從a344與蜀恢498雜交得到的F2群體中，隨機選取70份有類病斑表型的單株葉片，每10株的葉片等量混合提取DNA建池，共計7個池用于突變位點的共分離分析。葉片DNA采用改進CTAB法提取。(2)引物合成和基因定位先利用平均分布于水稻12條染色體上的543對SSR引物(具體序列詳見http://www.gramene.org/bd/markers)，通過PCR擴增，篩選出突變體a344與花B基因組之間的多態性引物98對；隨后用篩選出的多態性引物檢測近等基因池，以及突變體a344與花B構建的F2群體中隱性單株，進行基因初步定位；在已初定位的區間內，依據http://www.gramene.org網站公布的9311和日本晴DNA序列之間的差異序列，設計Indel引物I7和I8(見表4)，電泳圖譜見圖9和圖10，繼續檢測近等基因池和突變體a344與花B構建的F2群體中隱性單株，進行精細定位；最后，利用AA34引物(見表4)對檢測突變體a344、蜀恢498以及兩者雜交得到F2群體中的7個隱性池，進行突變位點的共分離分析(電泳圖譜見圖11)。表4本試驗所用的PCR引物引物名稱前引物(5'-3')后引物(5'-3')片段長度(bp)I7CACTCCACCCAATCTCCTCTTCTGTTCTACTTCTCTACCT110I8GAGTCCTCCATGCTCTTAACCCAACAGAATCCTCACTA120AA34GGATCTGTCTTGCGTGTATGCTTGTTGGATGGTATCA150其中PCR反應體系(20uL)：Tap酶(5U/μL)0.2uL，Primer(10mmol/L)2uL，dNTP(2.5mmol/L)2uL，DNA模板(20-100ng/μL)2uL，10×Buffer(25mM)2uL，ddH2O11.8uL。PCR反應程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35個循環；72℃8min，20℃2min。在3.0％的瓊脂糖凝膠、恒壓120-150V條件下電泳2-3h左右，用凝膠成像系統成像并保存記錄。(3)連鎖圖譜的構建將帶型為突變體a344的單株標記為0，帶型為雜合的單株記為1，帶型為親本的單株記為2，未出帶的單株記為3，通過用MAPMARKER3.0軟件對F2分離群體中分子標記和突變性狀的分離數據進行連鎖分析，再將重組值轉化為遺傳圖距(centMorgan,cM)。(4)候選基因初定位結果首先利用比較均勻分布在水稻12條染色體上的543對SSR引物，分析突變體a344與花B之間多態性，從中篩選出了98對平均分布水稻12條染色體上的多態性引物。然后利用該98對多態性引物在近等基因池和F2群體中46個隱性單株進行篩選，結果(見圖8)發現第4號染色體的長臂端兩個SSR標記RM5478和RM1112均與候選基因有連鎖關系，遺傳距離分別為1.5cM和1.3cM。(5)候選基因精細定位和基因預測通過在該區段內繼續開發Indel標記I7和I8，最終將候選基因精細定位在第4號染色體I8與I7之間的46Kb區段內(見圖8)。對該區間內的7個候選基因測序分析，在突變體a344中發現編碼pelota蛋白的LOC_Os04g56480基因的編碼區核苷酸序列的第350位由G變為T(見SEQIDNO.3)，導致該核苷酸編碼的色氨酸(W)變為亮氨酸(L)(見SEQIDNO.4)，使該蛋白功能受影響。通過在該基因內部設計一對包含突變位點的特異性引物AA34對a344與蜀恢498雜交構建的F2群體中具有類病斑表型的植株進行共分離檢測(圖11)。測序結果顯示，構建的7個隱性池均表現為該位點的突變。因此，結合精細定位和測序結果，LOC_Os04g56480基因很可能是候選目的基因。實施例4：候選基因的敲除驗證試驗(一)試驗材料本試驗所用大腸桿菌DH5α和農桿菌EHA105菌株均來自于四川農業大學水稻研究所雜種優勢利用實驗室。(二)試驗方法1、Crisper-A344基因敲除載體構建以野生型中A344基因的核苷酸序列為模板，選擇合適的區域，設計敲除的靶位點，利用BGK03載體參照試劑盒(杭州百格生物公司)構建Crisper-A344載體。具體構建流程如下(圖5)：(1)設計并合成下述引物對以形成gRNA靶點序列F：5'-TGTGTGCCAGAGCACGTATTGAAACAT-3'(SEQIDNO.11)R：5'-AAACATGTTTCAATACGTGCTCTGGCA-3'(SEQIDNO.12)(2)制備引物二聚體將合成的上述引物對加水溶解至10μM，按下列反應體系混合后，在PCR儀95℃加熱3分鐘，然后以約0.2℃/秒緩慢降至20℃。所述的聚合體系為：退火Buffer18ul,gRNA靶點引物各1ul，加ddH2O,補足至20ul。(3)將引物二聚體構建至BGK03載體。按下列反應體系在冰上混合各個組分，混勻后20℃反應1小時后轉化大腸桿菌備用。所述的反應體系：BGK03載體2ul，Oligo二聚體1ul，酶混合液1ul，加ddH2O,補足至10ul。2、大腸桿菌轉化(1)從-80℃冰箱中取出一管制備好的大腸桿菌感受態細胞，置于冰上融化；(2)每100ng連接產物加入100μL感受態細胞懸浮液，混勻后在冰上放置30min；(3)42℃熱激30s，迅速取出立即置于冰上2min；(4)加入500μL不含抗生素的LB液體培養基，37℃200r/min培養1小時左右活化菌液；(5)將活化的菌液以5000r/min離心1min，在無菌條件下倒掉大部分上清夜，用移液槍輕輕的重懸沉淀的菌，使其懸浮在100μL左右的LB液體培養基中，在超凈臺上把菌液轉移并涂到含有抗生素的LB篩選平板上；(6)將涂有菌液的LB板子正面向上放置十分鐘左右，待菌液完全被LB固體培養基吸收后將涂板的培養基倒置，37℃的恒溫箱中過夜培養；(7)挑取單菌落，利用P1028引物進行菌液PCR檢測；PCR擴增產物(見圖12)為900bp。所述的P1028引物對為：P1028-F:5'-TACACAGGCCATCGGTCCAGA-3'(SEQIDNO.13)P1028-R:5'-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'(SEQIDNO.14)。其中PCR反應程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35個循環；72℃8min，20℃2min。(8)將陽性克隆加入3ml含有卡那霉素(50mg/L)的LB培養液中，置于37℃搖床上，200r/min培養約10h，保存菌液并提取質粒。3、大腸桿菌質粒的提取按照OMEGAPlasmidExtractionKit產品說明書進行，將提取的質粒DNA收集到干凈的離心管中，-20℃保存。4、質粒序列的測定和序列分析將陽性克隆質粒送到成都擎科科技股份有限公司進行測序。用DNAMAN軟件對測序結果進行序列比對，確證gRNA序列的正確性。5、農桿菌轉化(1)農桿菌化學轉化法按照一個質粒：50ul感受態細胞從-80拿出來時快速放手心化凍；加0.4-1ug構建好的CRISPER-A344質粒于50ul感受態細胞中，冰上放置30分鐘；液氮中冷凍2分鐘；37℃水浴2min,溶化細胞；立即加入5倍體積的無抗LB培養基，28℃搖床培養2-3hr(170rpm)；7000rpm離心2分鐘，懸浮細胞在100ulLB培養基中；涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培養2-3天；用潮霉素分子標記P1028引物進行菌液PCR檢測，將能擴增出目的條帶的陽性農桿菌單克隆，加入甘油作為保護劑后置于-80C保存備用。(2)農桿菌浸染法轉化水稻1)愈傷組織的誘導：日本晴種子先用75％酒精消毒1分鐘，用無菌水漂洗3次，再用40％的次氯酸鈉漂洗30分鐘，再用無菌水沖洗5次，放置于帶濾紙的培養皿中濾干，用鑷子接種于NMB培養基上，于28℃光培養7天。每7天繼代一次。繼代2～3次后，挑取從種子上生長出的良好愈傷組織，把它們繼代于預培養基上，28℃暗培養4天。2)農桿菌菌株的活化：將-80C保存的30ul農桿菌加入3mL含有利福平和卡那霉素的YEP液體培養基中，于28℃下振蕩培養14h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mL的YEP液體培養基中28℃再振蕩培養4h。3)共培養轉化：將活化好的菌液在5000rpm下離心收集菌體，用含有100μM/L乙酰丁香酮的AAM液體培養基30mL重懸菌體，將預先挑好的愈傷組織浸于菌液中20min，吸去多余的菌液，平鋪于共培養固體培養基上，28℃暗培養2d。4)愈傷脫菌培養與愈傷抗性篩選：將共培養2d后的愈傷組織用無菌水沖洗至水澄清，然后用含頭孢霉素(500mg/L)的無菌水振蕩30min殺菌，將愈傷組織用無菌濾紙或吸水紙徹底吸干，然后接種于選擇培養基上培養3周左右。5)轉基因植株的分化與生根：將上述新長出的抗性愈傷組織接種到分化培養基上，光照培養1-2個月，然后將長出的3cm左右高的幼苗轉到生根培養基上進行生根培養，當苗長至約10cm時，取葉片提DNA利用潮霉素分子標記P1028引物鑒定陽性植株苗，最終獲得4株轉基因陽性植株。6)將陽性轉基因植株室內煉苗后，再移栽于大田。(3)轉基因水稻的檢測應用改進的CTAB法提取水稻DNA，用P1092引物對按照下述PCR條件擴出轉基因植株中的敲除后的序列，PCR產物(見圖13)片段大小為559bp。所述的P1092引物對為：P1092-F：5'-ATTAGACCCAACTGCAAGTGCT-3'(SEQIDNo:15)P1092-R：5'-TCAGGAAAGCCTGTAGGCAAAT-3'(SEQIDNo:16)其中PCR反應體系(20uL)：Tap酶(5U/μL)0.2ul，Primer(10mmol/L)2ul，dNTP(2.5mmol/L)2ul，DNA(20-100ng/μL)2ul，10×Buffer(25mM)2ul，ddH2O11.8ul。PCR反應程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35個循環；72℃8min，20℃2min。(4)PCR產物的回收目的DNA片斷膠回收操作步驟參照OmegaGelExtractionKit產品說明書進行，取2μL膠回收產物置于1％瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，檢測后送公司測序。對測序結果分析發現，4棵轉基因植株中的A344基因分別發生了單堿基A/G/T的插入。將含有gRNA靶點序列的核苷酸片段，連接到BGK03載體上，構成基因敲除載體Crisper-A344(見圖14)。轉化到農桿菌EHA105,以農桿菌介導法轉化日本晴。結果與日本晴對照相比，轉基因陽性植株的葉片均表現為類病斑(見圖15)，通過測序結果(SEQIDNO.3-6)表明轉基因植株中A344基因的編碼區均提前翻譯終止，產生無功能的蛋白質(SEQIDNO.7-10)。經A344基因的敲除實驗驗證，說明A344是控制水稻該類病斑表型的基因。當前第1頁1 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