硫代二酮哌嗪類化合物及其應用的制作方法

本發明涉及微生物醫藥技術領域，具體的說是從海洋真菌Penicillium brocae的發酵菌絲體中分離純化的硫代二酮哌嗪類化合物及其應用。

背景技術：

海洋微生物次級代謝產物具有豐富的結構多樣性和顯著的生物活性，是藥物先導化合物的重要來源。硫代二酮哌嗪類化合物是一類主要由真菌產生的具有生物活性的化合物，其分子結構中都含有帶硫橋的二酮哌嗪母核，具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫抑制等。研究發現，硫代二酮哌嗪可以作為缺氧誘導因子(HIF-1α)抑制劑阻止HIF-1α與轉錄共激活因子(CBP/p300)的結合，成為靶向抗腫瘤藥物研究的熱點化合物之一。

前期研究發現，海洋紅樹林植物白骨壤莖的內生真菌Penicillium brocae MA-231在PDB培養基靜置發酵培養中，可以代謝產生一系列硫代二酮哌嗪衍生物，表現出較強的抗腫瘤活性，具有潛在藥用價值，進一步研究發現該菌株在優化培養條件下可以代謝產生結構豐富多樣、抗腫瘤活性顯著的硫代二酮哌嗪類化合物。

技術實現要素：

本發明的目的在于從海洋真菌Penicillium brocae的發酵菌絲體中分離純化的硫代二酮哌嗪類化合物及其應用。。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種硫代二酮哌嗪類化合物，硫代二酮哌嗪類化合物分子式是C₁₈H₁₈O₅N₂S₂，如式I所示：

一種硫代二酮哌嗪類化合物的應用,所述式I所示硫代二酮哌嗪類化合物在制備卵巢癌藥物中的應用。

一種硫代二酮哌嗪類化合物的應用,所述式I所示硫代二酮哌嗪類化合物在在制備抑制金黃色葡萄球菌感染的藥物中的應用。

本發明所具有的優點：

本發明從采自海南新盈紅樹林白骨壤莖中分離獲得一株青霉屬 真菌Penicillium brocae，該菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年1月17日，保藏號為：CGMCC NO.8736，對其進行培養條件優化，從其查氏培養基搖床發酵產物中發現一個結構新穎的具有顯著抗腫瘤活性的硫代二酮哌嗪類化合物，目前尚未見對該化合物的化學結構及抗腫瘤、抗菌活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關的藥物。

經體外抗腫瘤活性試驗，該化合物對卵巢癌細胞A2780的敏感株和順鉑耐藥株均有顯著抑制活性，其半數抑制濃度(IC₅₀)分別為664.2和660.6nM。另外，抗菌活性測試發現該化合物對金黃色葡萄球菌也具有較強選擇性抑制活性，其最小抑制濃度(MIC)為0.25μg/mL。可用于制備治療上述癌癥和金黃色葡萄球菌感染引起的疾病的藥物。

附圖說明

圖1A為不同濃度下式I所示化合物對卵巢癌細胞A2780敏感株抑制活性的變化。

圖1B為不同濃度下式I所示化合物對卵巢癌細胞A2780順鉑耐藥株抑制活性的變化。

具體實施方式

以下具體實施例用來進一步說明本發明，但本發明絕非限于這些例子。

在如下的實施例中所指的化合物化學結構是(結構式中的阿拉伯數字式化學結構中的碳原子的標位)：

實施例1.化合物發酵生產及分離精制：

本發明所用海洋真菌Penicillium brocae分離自海南紅樹林植物白骨壤莖中，純化后培養在查氏培養基上，查氏培養基配方為：葡萄糖36g,甘露醇24g，硝酸鈉3.5g，磷酸二氫鉀1.5g，硫酸亞鐵0.02g，硫酸鎂0.7g，谷氨酸鈉3g，酒石酸鈉1.5g，海鹽17.5g，蒸餾水1000ml。

采用發酵罐大量發酵菌株Penicillium brocae MA-231，菌絲體用丙酮-水(80-20(v/v))超聲破碎提取3-4天，合并提取液后旋蒸除去丙酮，水相用乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液再進行濃縮，獲得菌絲體粗提物。

粗提物進行減壓硅膠柱(200-300目)層析，并用梯度為20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度為20:1至1:1(v/v)二氯甲烷-甲醇作為溶劑依次進行梯度洗脫(流速200ml/min)。收集二氯甲烷-甲醇20:1(v/v)得到的洗脫組分，進行反相柱層析(以甲醇-水作為洗脫液梯度洗脫，洗脫梯度范 圍為甲醇-水20:80到80:20，v/v，流速為1.5ml/min)，收集甲醇-水60：40(v/v)洗脫得到的組分，再用硅膠柱層析純化，以100:1至10:1(v/v)的二氯甲烷-甲醇洗脫(流速3ml/min)，收集二氯甲烷-甲醇50:1(v/v)洗脫得到的組分即得純化目標化合物。

其結構鑒定為如(I)所示，

該化合物具有以下理化和波譜特性：

淡黃色無定形粉末，[α]_D²⁵－100.0(c 0.22,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)204(3.65),269(3.14)nm；核磁共振氫譜和碳譜如表I；ESI質譜m/z 407[M+H]⁺,高分辨ESI質譜m/z 407.0728[M+H]⁺，C₁₈H₁₉O₅N₂S₂計算值為407.0730。

表I化合物的核磁共振氫譜和碳譜(500MHz，in CDCl₃)數據

a)本表信號歸屬基于DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC及HMBC圖譜解析結果，碳信號的多重度利用DEPT方

法確定

實施例2.抗腫瘤活性。

采用方法為MTT，腫瘤細胞株為卵巢癌細胞A2780敏感株和順鉑耐藥株。

操作步驟如下：準確稱量上述實施例中制備的純品化合物樣品，用二甲基亞砜(DMSO)配制成所需濃度的溶液。

取對數生長期的腫瘤細胞，細胞密度調至2×10⁵個細胞/毫升，按每孔200微升接種于96孔細胞培養板中，于37℃通入5％二氧化碳的培養箱中培養4小時。樣品分別設定5個濃度梯度10^-8，10^-7，10^-6，10^-5和10^-4mol/L，每個濃度設三個平行樣，每孔加樣品液或空白液各2微升，培養48小時， 然后每孔加濃度為5毫克/毫升的MTT液10微升，繼續培養4小時，出去上清液。每孔加入DMSO各100微升，在微量震蕩器上震蕩10分鐘，至結晶完全溶解后，酶標儀測定每孔570納米出的吸光值(OD值)。取三孔平均OD值，按IR％＝(OD_空白對照-OD_樣品)/OD_空白對照×100％式計算樣品對細胞增殖的抑制率(IR％)。結果參見圖1。

由圖1實驗結果顯示化合物對卵巢癌細胞A2780的敏感株和順鉑耐藥株均有顯著抑制活性，其半數抑制濃度(IC₅₀)分別為664.2和660.6nM。實施例3.抗菌活性。

采用最小抑菌濃度(MIC)法檢測式I所示化合物抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的活性。

實驗過程如下：采用無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的樣品溶液分別加到無菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至11孔加樣品溶液，每孔5μL，第12孔不加樣品作為生長對照。

將相當于0.5麥氏比濁度的指示菌懸液，經LB液體培養基(蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000ml)稀釋1000倍后，取95μL依次加入到96孔板中，使得第1至11孔的樣品終濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。輕輕震蕩混勻后，將96孔板密封置于37℃培養箱中，培養24小時。

在600nm波長下使用酶標儀測定每孔的吸光值，以在小孔內完全抑制指示菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陰性對照孔內指示菌明顯生長時試驗才有意義。

實驗結果顯示該化合物對金黃色葡萄球菌具有較強的抑制活性，其MIC為0.25μg/mL。

上述實驗結果證明本發明所涉及的化合物對卵巢癌細胞和金黃色葡萄球菌具有很強的抑制活性，可作為抗腫瘤制劑或抗菌劑，并有望以任何可接受的鹽或添加臨床可接受的輔料或載體如賦形劑、稀釋劑的形式在制備相關藥物中得到應用。