快速恒溫檢測創傷弧菌的方法、引物及試劑盒和應用與流程

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速恒溫檢測創傷弧菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術：

創傷弧菌(Vibrio vulnificus)，又稱海洋弧菌，是在海水和一些海洋食品中發現的一種嗜鹽性革蘭氏陰性致病菌。人類通常是因為生食受污染的海產品，或者傷口接觸受污染的海水或海洋動物而感染該細菌，可引起原發性敗血癥、創傷感染和急性胃腸炎等癥狀，其中引起的敗血癥性休克的死亡率高達50％以上。在我國，創傷弧菌感染多發生于沿海地區，被列為食品污染源中八大高危微生物之一。此外，由創傷弧菌引起的最初癥狀并無明顯特異性，因此對該菌的預防和檢測尤為重要。

目前，針對創傷弧菌的檢測主要通過病原分離與生化鑒定完成，但存在檢測周期長，操作繁瑣，不易鑒別相近物種等缺點。近年來隨著核酸分子檢測技術的發展，以特異性基因為靶標建立的常規PCR或real-time PCR技術已成功應用于創傷弧菌的實驗室診斷，具有靈敏度高，檢測時間短等優點，但該方法必須配備昂貴的儀器設備，需專門的操作人員。因此，并不適合廣泛應用于基層檢測部門尤其是企業生產線內部進行的實時實地檢測。為確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的創傷弧菌。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區域設計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應結果，以及靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作便捷、成本低等優點。

引物設計是LAMP技術中最為關鍵的一步，常規做法是將某待檢測生物的公認的特異性基因導入LAMP引物設計的在線網站(http://primerexplorer.jp/e)，設定相關參數生成引物組。也就是說，用戶首先必須確保該靶基因為待測物種的特異序列。以發明專利CN 103160604A和ZL201310556940.4為例，它們分別針對文獻報道的創傷弧菌的特異基因——vvhA基因和TolC基因序列，采用LAMP技術進行創傷弧菌檢測。然而，所謂“公認的特異性基因”往往基于滯后的知識，并未基于不斷增長的微生物基因組數據進行必要的更新，導致基于該靶基因序列獲得的引物在實際應用中不一定能確保其特異性和/或通用性。本發明用表1展示了現有技術中存在的引物通用性不夠的問題。也就是說，現有技術方法中所使用的創傷弧菌檢測序列實際上并非所有創傷弧菌菌株共有，即，有可能漏檢創傷弧菌的部分菌株。類似的問題也存在于特異性的確認，即，有可能將非創傷弧菌錯誤地認定為創傷弧菌。因此，行業內亟需一種能夠確保特異性和通用性的創傷弧菌檢測方法，同時滿足基層檢測部門對快速、便捷的需求，能夠方便地在企業生產線內部開展實時實地檢測。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題在于克服現有LAMP技術引物設計中存在的引物通用性和特異性不足的缺陷，充分利用目前公共數據資源中豐富的微生物基因組序列信息以及相應的序列分析工具，設計用于特異性識別創傷弧菌的引物組，并在此基礎上形成高靈敏度、高特異性檢測試劑盒。本發明基于GenBank數據庫中的微生物基因組數據資源(截至2013年8月5日數據)進行創傷弧菌LAMP引物的設計，提供了一種快速恒溫擴增檢測創傷弧菌的方法、引物組及試劑盒。采用本發明的檢測方法檢測創傷弧菌，具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結果判定簡單，操作便捷，成本低的優點。

本發明提出一種快速檢測創傷弧菌菌株的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)從待測樣品中提取基因組DNA；

(2)以所述基因組DNA為模板，以能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物，在酶反應體系下，進行恒溫擴增反應；

(3)通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在創傷弧菌。

本發明恒溫檢測創傷弧菌菌株的方法，從待測樣品中提取基因組DNA，以其為模板，以創傷弧菌特異性擴增引物組為引物，進行恒溫擴增反應，然后，通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在創傷弧菌。其中，所述酶反應體系包括但不限于DNA聚合酶反應體系。

本發明中，所述創傷弧菌基因組特異性堿基序列為GI號為320154846的創傷弧菌的112393～113296bp位序列。

本發明中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組為所述基因組(GI號為320154846)的112393～113296bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分。其中，所述創傷弧菌基因組特異性堿基序列是指僅為創傷弧菌基因組所特有的，而其它微生物基因組所不包含的堿基序列。

其中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異堿基序列的引物組包括但不限于選自以下各引物組A～C之任意一組，或選自與該引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為55％及以上的引物組之任意一組。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-GAAGTGTATCACCAGTTTAGC-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-AACTATACGTTGACCGCTT-3’(SEQ ID NO：2)；

上游內引物FIP_A：5’-ACATGCTTGTCGTCTTTCACCTAAAGATGAGATGATCGCCA-3’(SEQ ID NO：3)；

下游內引物BIP_A：

5’-CAGTATTACCAAATCATTCATCCGCTTGAGTACAGGCATCGTTA-3’(SEQ ID NO：4)；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-TGGCTTAACGATAGCTACGC-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-TGGATTTGCTCCAAGACTGG-3’(SEQ ID NO：6)；

上游內引物FIP_B：5’-CGTCTCACACCAGCAACGCATCGAAACACAAAGAGCACCG-3’

(SEQ ID NO：7)；

下游內引物BIP_B：

5’-CGTTGGTTTAAGCCCAATCGATCGCGTTGAGTTTGCACACATGG-3’(SEQ ID NO：8)；

引物組C：

上游外引物F3_C：5’-TCTTGGCGATTGATGATGA-3’(SEQ ID NO：9)；

下游外引物B3_C：5’-TGATTCAATGCCCCCTATA-3’(SEQ ID NO：10)；

上游內引物FIP_C：5’-AGCGATTGATGAATCAGGCGTGCGGTCATCAAATTCTAAC-3’

(SEQ ID NO：11)；

下游內引物BIP_C：5’-AGCTCGTTATCCACTAGTTGATGCACACTCAGGAAAAGCAATA-3’

(SEQ ID NO：12)。

本發明中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異堿基序列的引物組還可以包括與前述各引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為55％及以上的引物組，該引物組包括但不限于以下引物組D～F之任一引物組：

引物組D：

上游外引物F3_D：5’-CAAGTGGAAGTGTATCACC-3’(SEQ ID NO：13)(與引物F3_A 5’-GAAGTGTATCACCAGTTTAGC-3’同源性61.9％)；

下游外引物B3_D：5’-GGAATAATGTACGACTCCTG-3’(SEQ ID NO：14)；

上游內引物FIP_D：5’-ATGCTTGTCGTCTTTCACCGCTCTAAAGATGAGATGATCGC-3’

(SEQ ID NO：15)；

下游內引物BIP_D：5’-GTTGCCTCGAAATGCATTAACTCTCTTGCGGATGAATGATT-3’

(SEQ ID NO：16)；

引物組E：

上游外引物F3_E：5’-CAACGTATAGTTACCTAGCCGC-3’(SEQ ID NO：17)；

下游外引物B3_E：5’-CGGGTCAGTGGATTTGCTC-3’(SEQ ID NO：18)(與引物B3_B 5’-TGGATTTGCTCCAAGACTGG-3’同源性55％)；

上游內引物FIP_E：5’-CGCACAAACACAAAGAGCACCTTGGCTTAACGATAGCTACGC-3’

(SEQ ID NO：19)；

下游內引物BIP_E：

5’-GAGACGACGTTGGTTTAAGCCCAACGTTGAGTTTGCACACATGG-3’(SEQ ID NO：20)；

引物組F：

上游外引物F3_F：5’-TCGAAACACAAAGAGCACCG-3’(SEQ ID NO：21)；

下游外引物B3_F：5’-AATCGCCAAGAGCCGATG-3’(SEQ ID NO：22)(此引物互補鏈與引物F3_C 5’-TCTTGGCGATTGATGATGA-3’同源性57.9％)；

上游內引物FIP_F：5’-GGGTGAATCGATCGATTGGGCTTAGGTGCTCTTTGTGTTTGTGC-3’

(SEQ ID NO：23)；

下游內引物BIP_F：5’-GACCATGTGTGCAAACTCAACGCGAAATCCGGCGGTTTCCA-3’

(SEQ ID NO：24)。

本發明方法中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組可以包含或不包含環引物。所述環引物可以是一條或多條，包括引物LF和/或LB。所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組C’，E’，F’之任意一組；或選自與所述引物組C’，E’，F’序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為55％及以上的引物組之任意一組：

引物組C’：

上游外引物F3_C：5’-TCTTGGCGATTGATGATGA-3’；

下游外引物B3_C：5’-TGATTCAATGCCCCCTATA-3’；

上游內引物FIP_C：5’-AGCGATTGATGAATCAGGCGTGCGGTCATCAAATTCTAAC-3’；

下游內引物BIP_C：

5’-AGCTCGTTATCCACTAGTTGATGCACACTCAGGAAAAGCAATA-3’；

上游環引物LF_C：5’-ATTACGAAACCACGGGCAAC-3’(SEQ ID NO：25)；

引物組E’：

上游外引物F3_E：5’-CAACGTATAGTTACCTAGCCGC-3’；

下游外引物B3_E：5’-CGGGTCAGTGGATTTGCTC-3’；

上游內引物FIP_E：5’-CGCACAAACACAAAGAGCACCTTGGCTTAACGATAGCTACGC-3’；

下游內引物BIP_E：

5’-GAGACGACGTTGGTTTAAGCCCAACGTTGAGTTTGCACACATGG-3’；

下游環引物LB_E：5’-GATCGATTCACCCGCGTGCT-3’(SEQ ID NO：26)；

引物組F’：

上游外引物F3_F：5’-TCGAAACACAAAGAGCACCG-3’；

下游外引物B3_F：5’-AATCGCCAAGAGCCGATG-3’；

上游內引物FIP_F：

5’-GGGTGAATCGATCGATTGGGCTTAGGTGCTCTTTGTGTTTGTGC-3’；

下游內引物BIP_F：5’-GACCATGTGTGCAAACTCAACGCGAAATCCGGCGGTTTCCA-3’；

上游環引物LF_F：5’-AACGTCGTCTCACACCAGCAA-3’(SEQ ID NO：27)；

和/或，下游環引物LB_F：5’-GAGCAAATCCACTGACCCGCT-3’(SEQ ID NO：28)。

在具體實施方案中，例如，上述引物組F’中，可以只包含一條上游環引物，或只包含一條下游環引物，或同時包含一條上游環引物和一條下游環引物。

本發明方法中，在一具體實施方案(含環引物)中，所述恒溫擴增的酶反應體系為：1×Bst DNA聚合酶反應緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。在另一具體實施方案(不含環引物)中，所述恒溫擴增的酶反應體系為：1×Bst DNA聚合酶反應緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。環引物有助于提高反應效率。例如，1×Bst DNA聚合酶反應緩沖液可以選用1×Thermopol反應緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應緩沖液中的MgSO₄和酶反應體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發明方法中，所述恒溫擴增反應的反應程序為①60～65℃孵育10～90min，優選地為10～60min；②80℃終止反應2～20min。本發明不限制通過其他適宜反應程序來實現本發明檢測方法。

本發明方法中，檢測方法包括但不限于電泳檢測、濁度檢測或顯色檢測等。所述電泳檢測，優選為凝膠電泳檢測法，可以是瓊脂糖凝膠，也可以是聚丙烯酰胺凝膠。電泳檢測結果中，如電泳圖呈現特征性階梯狀條帶，則待測樣品呈創傷弧菌陽性，含有創傷弧菌；如電泳圖不呈現特征性階梯狀條帶，則待測樣品呈創傷弧菌陰性。所述濁度檢測，是用肉眼觀察或濁度儀檢測濁度，檢測管出現明顯混濁，則待測樣品呈創傷弧菌陽性，含有創傷弧菌；如未見混濁，則待測樣品為創傷弧菌陰性。也可以經離心后肉眼觀察反應管底是否有沉淀，若反應管底有沉淀，則待測樣品呈創傷弧菌陽性，含有創傷弧菌；如反應管底沒有沉淀，則待測樣品呈創傷弧菌陰性。

所述顯色檢測，是在反應管中加入顯色劑，包括但不限于鈣黃綠素(50μM)或SYBR Green I(30-50×)，或羥基萘酚藍(即HNB，120-150μM)。當采用鈣黃綠素或SYBR Green I作為顯色劑時，如反應后顏色為橙色，則待測樣品為創傷弧菌陰性；如反應后顏色為綠色，則待測樣品為創傷弧菌陽性，含有創傷弧菌。當采用羥基萘酚藍作為顯色劑時，如反應后顏色為紫羅蘭色，則待測樣品為創傷弧菌陰性；如反應后顏色為天藍色，則待測樣品為創傷弧菌陽性。所述顯色檢測，除了上述通過肉眼觀察反應結果外，也可以通過檢測儀器進行實時或終點檢測反應結果，通過合理的設定陰性反應的閾值，當待測樣品反應的結果低于或等于該閾值時，則待測樣品為創傷弧菌陰性；當待測樣品反應的結果大于該閾值時，則待測樣品為創傷弧菌陽性。所述檢測儀器包括但不限于熒光分光光度計、熒光定量PCR儀、恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀和Genie II等溫擴增熒光檢測系統等。

所述顯色檢測中，若采用鈣黃綠素或羥基萘酚藍作為顯色劑，可以在恒溫擴增反應之前加入，也可以在恒溫擴增反應完成之后加入，優選地為恒溫擴增反應之前加入，可以有效的減少反應污染的可能性。若采用SYBR Green I作為顯色劑，則在恒溫擴增反應完成之后加入。若采用鈣黃綠素作為顯色劑，則在酶反應體系中加入50μM鈣黃綠素的同時，加入0.6-1mM[Mn²⁺]，例如，0.6-1mM的MnCl₂。

本發明還提供了用于恒溫檢測創傷弧菌菌株的方法中的引物。所述引物包括能擴增創傷弧菌基因組特異堿基序列的引物組，其包括但不限于，所述引物的序列為GI號為320154846的創傷弧菌基因組的112393～113296bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分。

其中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下各引物組之任意一組，或選自與所述各引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為55％及以上的任一引物組。其中，所述引物組包括但不限于以下引物組A～C之任意一個引物組。所述與前述引物組序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為55％及以上的引物組包括但不限于以下引物組D～F之任意一個引物組。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-GAAGTGTATCACCAGTTTAGC-3’

下游外引物B3_A：5’-AACTATACGTTGACCGCTT-3’

上游內引物FIP_A：5’-ACATGCTTGTCGTCTTTCACCTAAAGATGAGATGATCGCCA-3’；

下游內引物BIP_A：

5’-CAGTATTACCAAATCATTCATCCGCTTGAGTACAGGCATCGTTA-3’；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-TGGCTTAACGATAGCTACGC-3’；

下游外引物B3_B：5’-TGGATTTGCTCCAAGACTGG-3’；

上游內引物FIP_B：5’-CGTCTCACACCAGCAACGCATCGAAACACAAAGAGCACCG-3’；

下游內引物BIP_B：

5’-CGTTGGTTTAAGCCCAATCGATCGCGTTGAGTTTGCACACATGG-3’；

引物組C：

上游外引物F3_C：5’-TCTTGGCGATTGATGATGA-3’；

下游外引物B3_C：5’-TGATTCAATGCCCCCTATA-3’；

上游內引物FIP_C：5’-AGCGATTGATGAATCAGGCGTGCGGTCATCAAATTCTAAC-3’；

下游內引物BIP_C：

5’-AGCTCGTTATCCACTAGTTGATGCACACTCAGGAAAAGCAATA-3’；

引物組D：

上游外引物F3_D：5’-CAAGTGGAAGTGTATCACC-3’；

下游外引物B3_D：5’-GGAATAATGTACGACTCCTG-3’；

上游內引物FIP_D：5’-ATGCTTGTCGTCTTTCACCGCTCTAAAGATGAGATGATCGC-3’；

下游內引物BIP_D：5’-GTTGCCTCGAAATGCATTAACTCTCTTGCGGATGAATGATT-3’；

引物組E：

上游外引物F3_E：5’-CAACGTATAGTTACCTAGCCGC-3’；

下游外引物B3_E：5’-CGGGTCAGTGGATTTGCTC-3’；

上游內引物FIP_E：5’-CGCACAAACACAAAGAGCACCTTGGCTTAACGATAGCTACGC-3’；

下游內引物BIP_E：

5’-GAGACGACGTTGGTTTAAGCCCAACGTTGAGTTTGCACACATGG-3’；

引物組F：

上游外引物F3_F：5’-TCGAAACACAAAGAGCACCG-3’；

下游外引物B3_F：5’-AATCGCCAAGAGCCGATG-3’；

上游內引物FIP_F：

5’-GGGTGAATCGATCGATTGGGCTTAGGTGCTCTTTGTGTTTGTGC-3’；

下游內引物BIP_F：5’-GACCATGTGTGCAAACTCAACGCGAAATCCGGCGGTTTCCA-3’。

本發明用于所述恒溫檢測創傷弧菌方法中的引物中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組還可以包含或不包含一條或多條環引物；所述環引物為LF和/或LB。所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下引物組C’，E’，F’之任意一組；或選自與所述引物組C’，E’，F’序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為55％及以上的引物組之任意一組：

引物組C’：

上游外引物F3_C：5’-TCTTGGCGATTGATGATGA-3’；

下游外引物B3_C：5’-TGATTCAATGCCCCCTATA-3’；

上游內引物FIP_C：5’-AGCGATTGATGAATCAGGCGTGCGGTCATCAAATTCTAAC-3’；

下游內引物BIP_C：

5’-AGCTCGTTATCCACTAGTTGATGCACACTCAGGAAAAGCAATA-3’；

上游環引物LF_C：5’-ATTACGAAACCACGGGCAAC-3’；

引物組E’：

上游外引物F3_E：5’-CAACGTATAGTTACCTAGCCGC-3’；

下游外引物B3_E：5’-CGGGTCAGTGGATTTGCTC-3’；

上游內引物FIP_E：5’-CGCACAAACACAAAGAGCACCTTGGCTTAACGATAGCTACGC-3’；

下游內引物BIP_E：

5’-GAGACGACGTTGGTTTAAGCCCAACGTTGAGTTTGCACACATGG-3’；

下游環引物LB_E：5’-GATCGATTCACCCGCGTGCT-3’；

引物組F’：

上游外引物F3_F：5’-TCGAAACACAAAGAGCACCG-3’；

下游外引物B3_F：5’-AATCGCCAAGAGCCGATG-3’；

上游內引物FIP_F：

5’-GGGTGAATCGATCGATTGGGCTTAGGTGCTCTTTGTGTTTGTGC-3’；

下游內引物BIP_F：5’-GACCATGTGTGCAAACTCAACGCGAAATCCGGCGGTTTCCA-3’；

上游環引物LF_F：5’-AACGTCGTCTCACACCAGCAA-3’；

和/或，下游環引物LB_F：5’-GAGCAAATCCACTGACCCGCT-3’。

在具體實施方案中，上述引物組F’中，可以只包含一條上游環引物，或只包含一條下游環引物，或同時包含一條上游環引物和一條下游環引物。在一具體實施方案中，所述引物分別為FIP、BIP、F3、B3、LF和LB所示的引物或與前述引物序列或其互補鏈序列中單條引物同源性為55％及以上的引物。

本發明還提供一種用于上述恒溫檢測創傷弧菌菌株方法中的試劑盒，其包括所述能擴增創傷弧菌基因組特異堿基序列的引物組。本發明試劑盒中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組，包括但不限于以基因組(GI號:320154846)的112393～113296bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分作為所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物組A、引物組B、引物組C之任意一個引物組等。還包括但不限于以與前述引物序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為55％及以上的引物組作為引物；包括但不限于引物組D、引物組E、引物組F等。

本發明試劑盒中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組可以包含或不包含一條或多條環引物；環引物作為可選組分。所述環引物為LF和/或LB。包含環引物LF和/或LB的引物組包括但不限于引物組C’，E’，F’等。在具體實施方案中，本發明試劑盒中可以包含0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB環引物。在一具體實施方案中，引物組的序列分別為FIP、BIP、F3、B3、LF和LB所示的引物、或與前述序列或其互補鏈序列單條引物同源性為55％及以上的引物。

本發明試劑盒中，還包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP溶液、Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)和甜菜堿中的一種或多種。在一具體實施方案中，本發明試劑盒酶反應體系包含1×Bst DNA聚合酶反應緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L的甜菜堿。例如，1×Bst DNA聚合酶反應緩沖液可以選用1×Thermopol反應緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應緩沖液中的MgSO₄和酶反應體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發明試劑盒中，還包含陽性對照模板。在一具體實施方案中，所述陽性對照模板包括但不限于創傷弧菌的全基因組DNA、部分基因組DNA，或包含創傷弧菌全基因組DNA或部分基因組DNA的載體。

本發明試劑盒中，還包含陰性對照模板，所述陰性對照模板包括但不限于雙蒸水。

本發明試劑盒中，還包含顯色劑，顯色劑包括但不限于鈣黃綠素，SYBR Green I或羥基萘酚藍。當顯色劑為鈣黃綠素時，試劑盒中還包含[Mn²⁺]，例如，MnCl₂。

本發明試劑盒中，還包含雙蒸水。

本發明試劑盒中，還包含核酸抽提試劑。

本發明還提出了一種載體，所述載體包含選自引物組A～C、D～F、C’、E’、F’之任意一組引物。該載體由于包含了具有創傷弧菌特異性的DNA序列，因此可應用于微生物分類學、比較基因組學、進化等研究領域，以及微生物檢測等應用領域。該載體可以是但不限于質粒載體(如pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript M13、Ti質粒等)、病毒載體(如λ噬菌體等)和人造染色體載體(如細菌人造染色體BAC、酵母人造染色體YAC等)。例如，包含引物組A之任意一條引物的載體pBR322-A、……包含引物組D之任意一條引物的載體pBR322-D、……包含引物組F’之任意一條引物的載體pBR322-F’等。包含引物組A之任意一條引物的載體λ噬菌體-A、……包含引物組D之任意一條引物的載體λ噬菌體-D、……包含引物組F’之任意一條引物的載體λ噬菌體-F’等。

本發明還提出了選自引物組A～C、D～F、C’、E’、F’之任意一組的引物在恒溫檢測創傷弧菌中的應用。

本發明還提出了所述試劑盒在恒溫檢測創傷弧菌中的應用。

本發明還提出了所述載體在恒溫檢測創傷弧菌中的應用。

本發明為食品安全檢測技術領域提供了一種簡單快速靈敏的檢測創傷弧菌的方法、引物/引物組、檢測試劑/試劑盒，對我國的食品安全具有較大意義。本發明有益效果包括：采用本發明創傷弧菌檢測方法具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短、結果判定簡單、操作便捷、成本低等優點。與目前常用檢測方法相比，本發明采用的恒溫擴增法，可以在恒溫條件下進行，只需采用簡單的恒溫裝置，不需要PCR實驗中的昂貴儀器，不需要對擴增產物進行電泳檢測等步驟，因而，非常適于廣泛應用于社會各界包括基層食品安全檢測部門推廣使用，即使在分子生物學專業知識和技能基礎相對不足的環境下也可充分應用。基于本領域常識可將上述各優選條件進行任意組合，均屬本發明保護范圍。

附圖說明

圖1表明本發明實施例7創傷弧菌恒溫檢測方法的特異性。

圖2表明本發明實施例8創傷弧菌檢測方法的靈敏度。

具體實施方式

結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內容不局限于以下實施例。在不背離發明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。

實施例1-6創傷弧菌恒溫反應體系和檢測方法

按照以下(1)～(3)步驟進行檢測：

(1)基因組DNA的提取

用于檢測的創傷弧菌菌種來源中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號CICC10383(＝ATCC27562)。取1mL細菌培養物使用北京天根生物工程公司的細菌核酸提取試劑盒提取基因組DNA，DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.8，濃度為210.8ng/μL。

(2)以待測創傷弧菌基因組DNA為模板，分別采用自配的試劑盒(見表2，表3)，并按照表3中所述條件，配制反應體系，以創傷弧菌特異性擴增引物組為引物，進行恒溫擴增反應。實施例1～6中的引物分別為引物組A，C’，D，E’，F’，F。

(3)按照表3中所述條件，通過電泳檢測、濁度檢測或顯色檢測，進行擴增結果確認。

由表3可以看出，本發明檢測方法及其所采用的引物組及反應體系能夠很好地對創傷弧菌特異性片段進行擴增并得到檢測結果。此外，當采用檢測儀進行檢測時，縮短反應時間至10min時也有很好的檢測效果(如實施例6)。因此，本發明可以應用于檢測樣本中是否含有創傷弧菌。

按上述實施例方法，分別用引物組B～C，引物組E，也能夠很好地對創傷弧菌特異性片段進行擴增并得到檢測結果。

實施例7創傷弧菌特異性檢測

收集非創傷弧菌28株(表4和圖1中的1～25，27～29)，將這些菌株與創傷弧菌菌株(表4和圖1中的26)分別進行培養，取1mL菌液，采用試劑盒IA，提取細菌DNA，并參照實施例1的反應體系和條件，分別進行LAMP擴增(引物組為A)和加入顯色劑觀察。

其檢測結果如表4和圖1所示，圖1中，1～25分別為金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、表皮葡萄球菌、馬紅球菌、蠟樣芽孢桿菌、蕈樣芽孢桿菌、單核增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、腸沙門氏菌腸亞種、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大腸埃希氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、產腸毒素大腸埃希氏菌、腸產毒性大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌、阪崎克羅諾桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌和假結核耶爾森氏菌，27～29分別為副溶血弧菌、弗氏弧菌和霍亂弧菌，NTC：陰性對照，26：創傷弧菌。圖1中，僅有創傷弧菌菌株擴增反應后的產物呈現為亮綠色，為陽性結果，如第26號管所示。而其他非創傷弧菌菌株及陰性對照擴增反應后的產物均呈現為橙色，為陰性結果，如第1～25、27～29號管以及NTC陰性對照管所示。

由圖1和表4結果可以看出，本發明檢測試劑盒及檢測方法具有良好的創傷弧菌菌株特異性，即，只有創傷弧菌菌株擴增陽性，其他非創傷弧菌菌株為陰性。

配制檢測試劑盒，試劑盒中采用的引物分別為引物組B～C，引物組D～F，引物組C’，E’，F’，按上述特異性檢測方法，分別得到同樣的檢測結果，即，非創傷弧菌菌株及陰性對照擴增反應后的產物為陰性結果，創傷弧菌菌株擴增反應后的產物為陽性結果。

此外，按照表1中所述方法，分別對引物組A～C，引物組D～F，引物組C’，E’，F’的特異性進行理論分析，結果發現，在各條引物最多允許三個錯配的情況下，各引物組最多同時有兩條引物比對到非創傷弧菌上，表明各引物組的特異性均較好。

實施例8靈敏度檢測

按實施例1的方法提取細菌CICC 10383的DNA，采用試劑盒IB，并按照10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg梯度加入反應體系，其他反應條件參照表3實施例1的方法分別進行LAMP擴增(引物組為A)和加入顯色劑觀察。如圖2所示，1-7分別為10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg，NTC：陰性對照。圖2中10ng、1ng處理的反應產物呈現為亮綠色，為陽性結果，100pg、10pg、1pg、100fg和10fg處理以及陰性對照的反應產物呈現為橙色，為陰性結果。檢測結果表明，每個反應管中最低含1ng的DNA時可被檢出。

按上述檢測方法，其他步驟及條件同上，分別用引物組B～C，引物組D～F，引物組A’，C’，D’，每個反應管中低至1ng～100fg的DNA仍可被檢出。

實施例9通用性檢測

按照表1中所述方法，分別對引物組A～C，引物組D～F，引物組C’，E’，F’的通用性進行理論分析，結果發現，各引物組的引物區域與三株創傷弧菌1號染色體(GI號分別為320154846，326423644和37678184)的完全匹配，理論上可以用于上述三株創傷弧菌菌株的檢測，表明各引物組的通用性均較好。

表1創傷弧菌的現有檢測方法中引物的通用性和特異性分析

注：a)每個創傷弧菌菌株有兩條染色體，將專利中引物F3和B3間的序列與創傷弧菌的3個菌株的6個染色體基因組序列進行Bowtie比對，確定檢測區域在GI號320154846#1/320157827#2基因組中的位置，#1代表該菌株的第一條染色體的基因組序列，#2代表該菌株的第二條染色體的基因組序列。b)將檢測區域序列在公共數據庫資源中進行Blast比對，引物區域完全匹配為通用性好。c)將檢測區域序列在公共數據庫資源中進行Blast比對，引物區域匹配程度越高，特異性越差；若引物不能同時比對到非創傷弧菌株上，表明特異性好。

表2恒溫檢測創傷弧菌的試劑盒種類及主要組成成分

表3實施例1-6本發明恒溫檢測創傷弧菌的方法中的反應條件及檢測結果

表4試驗所用菌株及檢測結果

注：a)CGMCC：中國普通微生物菌種保藏中心，CICC：中國工業微生物菌種保藏管理中心，CMCC：中國醫學細菌菌種保藏管理中心。b)+：陽性結果，-：陰性結果。