一種誘導色綠藻高效合成蝦青素的方法與流程

本發明涉及藻類生物發酵培養技術，特別涉及一種通過誘導色綠藻高效合成蝦青素的方法。
背景技術：
：蝦青素(Astaxanthin)被稱為“超級抗氧化劑”，抗氧化能力是其它類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素、玉米黃素、葉黃素和角黃素等的10倍多，具有清除自由基、阻止脂質過氧化的強大能力，在預防動脈硬化、帕金森綜合癥、視網膜黃斑變性等年齡相關性疾病方面具有重要作用；對于維護眼睛和中樞神經系統健康，增強免疫系統功能、強化肌體能量代謝、抗癌、抗感染等具有多重功效。目前蝦青素的生產方法主要有三種，分別為從蝦蟹殼內提取、化學合成以及紅發夫酵母或雨生紅球藻等生物法生產。此外，還有采用轉基因植物技術培養番茄積累蝦青素的報道。生物法，尤其是雨生紅球藻培養法生產蝦青素是目前天然蝦青素最主要的生產方法，從中得到的蝦青素均為3S,3’S構型，抗氧化活性高，無毒副作用，被FDA(美國食品和藥物管理局)和EFSA(歐洲食品安全局)批準作為營養強化劑，在保健食品、醫藥、化妝品等領域中有著廣泛的市場。但是，由于雨生紅球藻是自養培養，存在生長速率慢、培養周期長，面臨著成本高、生產效率低且不穩定、易生物污染等技術瓶頸的制約。因此，僅僅依靠雨生紅球藻的培養來生產天然蝦青素，遠遠不能滿足國際市場需求。色綠藻(Chromochloriszofingiensis)是一種單細胞綠藻，被認為是天然蝦青素的新來源。研究表明，雖然色綠藻和雨生紅球藻同屬于單細胞綠藻，但二者的細胞生理生化特性存在很大差別，蝦青素的合成機制也是截然不同的。因而，雨生紅球藻生產蝦青素的工藝不能直接轉用于色綠藻，需根據色綠藻的細胞特性和蝦青素代謝調控機制進行有針對性的研究開發，這也是利用色綠藻產業化生產蝦青素的首要任務。技術實現要素：針對現有技術存在的缺陷，本發明提供一種誘導色綠藻高效合成蝦青素的方法。本發明為達到其目的，采用的技術方案如下：一種誘導色綠藻高效合成蝦青素的方法，包括如下步驟，S1，活化培養：將色綠藻細胞接種培養基中活化培養以獲得種子液；具體的，可將色綠藻細胞活化培養至對數生長期，將處于對數生長期的培養液作為種子液；S2，誘導培養：將S1獲得的種子液接種至誘導培養基中進行光誘導培養，所用光源為白光或藍光，光源強度為60～330μmolm-2s-1，光暗周期為12:12(h)～24:0(h)，所述誘導培養基包括如下濃度的各組分：9～30g/L葡萄糖、0～0.75g/L硝酸鈉，誘導培養基的pH值為6.0～7.0。優選的，步驟S2中，將所述種子液接種至誘導培養基并使種子液稀釋至色綠藻細胞密度為2～3.5g/L。本申請發明人在研發過程中發現，采用優選的起始密度，誘導后可以獲得較高的蝦青素產率；過高的細胞密度，會導致每個細胞受到的光輻射強度過低，影響色素合成；過低的細胞密度，會導致每個細胞受到的光輻射強度過高，抑制色素合成；采用該優選的細胞密度，可以保證色綠藻細胞的光輻射強度適當。優選的，步驟S2中，所述誘導培養基中，硝酸鈉的濃度為0～0.2g/L。優選的，步驟S2中，所述光源強度為300±30μmolm-2s-1，光暗周期為24:0(h)(即連續光照)；進一步優選的，步驟S2中，所述光源為白光。采用該優選方案，有助于色綠藻胞內蝦青素的誘導合成，蝦青素含量高、產量和產率高。在此基礎上更進一步優選的，誘導培養基中，氮源濃度為0～0.1g/L。優選的，步驟S2中，將接種有種子液的誘導培養基分裝到透明微孔板或類似薄層培養容器(例如透明管道反應器)中，并置于微孔板振蕩器上進行光誘導培養。相比于傳統的三角瓶和發酵罐式光反應器而言，透明微孔板或類似薄層培養容器具有透光性好、裝置簡易、操作簡便、運行成本低、節省空間和時間短等優勢。該優選方案，有利于色綠藻高效積累蝦青素，提高產量和產率。作為一種較為優選的方案，步驟S2中，將所述種子液接種至誘導培養基并使種子液稀釋至色綠藻細胞密度為2～3.5g/L，誘導培養基中硝酸鈉的濃度為0～0.1g/L，將接種有種子液的誘導培養基分裝至透明微孔板或類似薄層培養容器中，并置于微孔板振蕩器上進行光誘導培養，光誘導培養所用光源為白光，光源強度為300±30μmolm-2s-1，光暗周期為24:0(h)。采用該優選方案，有助于色綠藻胞內蝦青素的誘導合成，蝦青素含量高、產量和產率高，且培養獲得的色綠藻細胞內次級類胡蘿卜素特別是蝦青素的比例占總色素的比例較高。作為一種具體實施方式，步驟S1中，對色綠藻細胞進行活化培養所用的培養基選自Basal、Bristol、BG-11、BBM、Kuhl中的至少一種。作為一種具體實施方式，所述步驟S2中，所述誘導培養基中還包括如下濃度的各組分：0.175g/L磷酸二氫鉀、0.075g/L磷酸氫二鉀、0.025g/L七水硫酸鎂、0.0025mg/L五水硫酸銅、5mg/L氯化鐵、0.025g/L二水氯化鈣、0.169mg/L一水硫酸錳、0.025g/L氯化鈉、0.287mg/L七水硫酸鋅、0.00124mg/L七水鉬酸銨、0.061mg/L硼酸。本發明提供的技術方案具有如下有益效果：本發明方法與現有的色綠藻積累蝦青素的培養方式相比，可大大提高色綠藻胞內蝦青素的產量和產率，方法簡便，能耗低，有效降低生產成本，在利用色綠藻進行天然蝦青素的積累方面具有重要應用價值。另外，采用本發明所提供的方法誘導色綠藻培養獲得的藻粉中，蝦青素與角黃素比例遠高于2:1，食用安全，未來在食品和營養強化劑應用領域具有廣闊的市場前景。附圖說明圖1.起始細胞密度對色綠藻生物量濃度和蝦青素產量的影響；圖2.150μmolm-2s-1白光下硝酸鈉濃度對色綠藻生物量濃度和蝦青素產量的影響；圖3.150μmolm-2s-1藍色LED光下硝酸鈉濃度對色綠藻生物量濃度和蝦青素產量的影響；圖4.150μmolm-2s-1藍色LED光和白光下硝酸鈉濃度對色綠藻細胞內色素百分含量的影響；圖5.300μmolm-2s-1藍色LED光和白光下色綠藻生物量濃度、比生長速率以及蝦青素含量、產量和產率；圖6.300μmolm-2s-1藍色LED光和白光對色綠藻細胞內色素百分含量的影響。具體實施方式下面結合附圖對本發明的技術方案做進一步說明：實施例1起始細胞密度對色綠藻生物量濃度和蝦青素產量的影響1.1菌種活化及種子液制備將實驗室中保存的色綠藻C.zofingiensis藻種轉接到裝有改良Bristol培養基的斜面上進行培養，培養溫度為26℃，光照為10μmolm-2s-1，并觀察色綠藻生長情況。用接種環將色綠藻藻苔接種到裝有改良Bristol液體培養基的三角瓶中進行培養，在溫度為26℃、光照為10μmolm-2s-1的恒溫振蕩搖床中，培養3～5天用作種子液。其中所述的改良Bristol培養基(pH6.5)成分如下表1所示(單位為mg/L)：組分含量(mg/L)組分含量(mg/L)組分含量(mg/L)葡萄糖9000NaNO3750KH2PO4175K2HPO475MgSO4·7H2O25CuSO4·5H2O0.0025FeCl35CaCl2·2H2O25MnSO4·H2O0.169NaCl25ZnSO4·7H2O0.287(NH4)6Mo7O24·7H2O0.00124H3BO30.061////1.2不同起始細胞密度下的誘導培養將培養好的色綠藻種子液在3800×g下離心2min，棄去上層培養基，并用無菌水重新懸浮后，再次離心去除上清液，將收集的色綠藻細胞采用改良的Bristol培養基進行稀釋重懸，控制色綠藻的細胞密度分別為0.5、1.0、1.9、2.9g/L，分裝到透明微孔板中，并置于微孔板振蕩器中，一起放置于光照培養箱中進行誘導培養以積累蝦青素。誘導培養基采用改良Bristol培養基，其和表1中的配方相比，不同僅在于：葡萄糖為30g/L，NaNO3為0.6g/L(碳氮比高于200)，pH為6.5。培養條件為：轉速為50～500r/m，溫度為26℃、光源采用藍色的LED硬燈條(光源的波長范圍為460±10nm)串聯并排放置，控制微孔板表面的光照強度為80±20μmolm-2s-1以上，分別培養12天。培養結束后，測定色綠藻培養液的生物量濃度；離心收集細胞，離心洗滌多次后收集藻泥，真空凍干獲得藻粉，分析藻粉內色素含量。1.3起始細胞密度對色綠藻C.zofingiensis胞內蝦青素產量的影響經檢測，不同起始細胞密度的色綠藻，在藍光誘導條件下生物量和蝦青素產量參見圖1。不同起始密度下藍光誘導后胞內蝦青素含量差異不大，基本保持在2.05mg/g以上。其中當起始細胞密度為1.9～2.9g/L時，蝦青素含量均達2.38mg/g以上，產量基本在15.95～22.41mg/L之間。從圖1可知，色綠藻起始細胞密度對于蝦青素產率有較大影響，當細胞密度在1.9～2.9g/L時，可以獲得較高的蝦青素產率，基本在1.3～1.8mg/L/d之間。實施例2～5白光誘導下氮源濃度對色綠藻C.zofingiensis積累蝦青素的誘導效果實施例2-5按照如下步驟操作：2.1、藻種活化及種子液制備將實驗室中保存的色綠藻C.zofingiensis藻種按1.1所述的培養方法，培養3～5天用作種子液。2.2在白光和不同氮源濃度下積累蝦青素的誘導培養將培養好的色綠藻種子液按1.2所述的方法，收集色綠藻細胞。采用含有不同氮源濃度的改良Bristol培養基進行稀釋、重懸，并控制細胞密度為3g/L左右，其中實施例2～5分別依次采用氮源濃度為0、0.1、0.2、0.3g/L的改良Bristol培養基，葡萄糖均為10g/L，其他組分與表1中相同。將接種后含有不同氮源濃度的誘導培養基，分裝到透明微孔板中，置于微孔板振蕩器中，一起放置于光照培養箱中，進行色綠藻C.zofingiensis培養積累蝦青素。培養條件為：轉速為50–500r/m，溫度為26℃、采用白色熒光燈并排放置作為光源，控制微孔板表面的光照強度為150±30μmolm-2s-1以上，分別培養12天。對實施例2-5中色綠藻的生物量和胞內色素含量進行檢測分析：培養結束后，將色綠藻培養液離心收集藻泥，凍干獲得干藻粉并分析胞內色素含量。2.3實驗結果結果可參見圖2。由圖2可知，實施例4，在氮源濃度為0.2g/L條件下，蝦青素產量和產率均較高，分別為29.56mg/L、2.60mg/L/d。實施例2，在完全無氮培養時，色綠藻細胞內蝦青素含量較高，為4.75mg/g。實施例2～5的結果表明，白光條件下，氮源的增加有助于生物量的增加，而色綠藻細胞內蝦青素的含量隨著氮源濃度的增加卻有極顯著降低(p＜0.01)，蝦青素的產量和產率也不會因氮源濃度增加而持續增加。因此，在白光下，低濃度氮源(0-0.2g/L)不僅可以保證胞內蝦青素含量不會明顯降低，同時可獲得較高的蝦青素產量和產率。實施例6～9藍光條件下不同氮源濃度誘導色綠藻C.zofingiensis積累蝦青素實施例2-5按照如下步驟操作：3.1菌種活化及種子液制備將實驗室中保存的色綠藻C.zofingiensis菌種按1.1所述的培養方法，培養3～5天用作種子液。3.2在藍光和不同氮源濃度下積累蝦青素的誘導培養將培養好的色綠藻種子液按1.2所述的方法，收集色綠藻細胞。采用含有不同氮源濃度的改良Bristol培養基進行稀釋、重懸，并控制細胞密度為3g/L左右，其中實施例6～9分別依次采用氮源濃度為0、0.1、0.2、0.3g/L的改良Bristol培養基，葡萄糖均為10g/L，其他組分與表1中相同。將接種色綠藻細胞的含有不同氮源的誘導培養基，分裝到不同的透明微孔板中，并置于微孔板振蕩器中，一起放置于光照培養箱中進行色綠藻C.zofingiensis培養積累蝦青素。培養條件為：轉速為50–500r/m，溫度為26℃、采用藍色LED硬燈條作為光源，控制微孔板表面的光照強度為150±30μmolm-2s-1以上，分別培養12天。對實施例6-9色綠藻的生物量和胞內色素含量進行檢測分析：培養結束后，色綠藻培養液離心收集藻泥，凍干獲得干藻粉并進行色綠藻胞內色素含量分析。3.3實驗結果結果可參見圖3。由圖3可知，實施例6在完全無氮培養時，色綠藻細胞內蝦青素含量、蝦青素產量和產率均較高，分別為5.53mg/g、27.97mg/L和2.33mg/L/d。在藍光條件下，在低氮源濃度或無氮條件下(0-0.2g/L)具有較佳的蝦青素產量和產率。對實施例2-9中誘導培養所得色綠藻細胞內色素組成進行分析，結果見圖4。圖4中“W”代表白光條件下的色素組成，“B”代表藍光條件下的色素組成。由圖4可知，在實施例2-9中，色綠藻胞內次級類胡蘿卜素均占到所有色素的81.88～94.09％之間。實施例2-9的蝦青素/角黃素比值均大于2：1，但，相對于白光而言，藍光條件下培養，蝦青素/角黃素比值較高，可達7.5，表明采用藍光可更有效調控色綠藻胞內色素的組分及其比例。實施例10-13在高光強度下白光和藍光誘導色綠藻積累蝦青素實施例10-13按照如下步驟進行：4.1菌種活化及種子液制備將實驗室中保存的色綠藻C.zofingiensis菌種按1.1所述的培養方法，培養3～5天用作種子液。4.2在白光和藍色LED高光強照射下積累蝦青素的誘導培養將培養好的色綠藻種子液按1.2所述的方法，收集色綠藻細胞。采用含有不同氮源濃度的改良Bristol培養基進行稀釋、重懸，并控制細胞密度為3g/L左右，其中實施例10-13分別采用氮源濃度為0、0.1、0、0.1g/L的改良Bristol培養基，葡萄糖均為10g/L，其他組分與表1中相同。將接種色綠藻細胞的含有不同氮源的誘導培養基分裝到不同的透明微孔板中，并置于微孔板振蕩器中，一起放置于光照培養箱中，進行色綠藻C.zofingiensis培養積累蝦青素。培養條件為：轉速為50–500r/m，溫度為26℃，實施例10-11(對應于圖5、圖6中“藍光/無氮”、“藍光/低氮”)采用藍色的LED硬燈條作為光源，實施例12-13(對應于圖5、圖6中“白光/無氮”、“白光/低氮”)采用白色熒光燈管作為光源，控制微孔板表面的光照強度均為300±30μmolm-2s-1以上，分別培養12天。對色綠藻的生物量和胞內色素含量進行檢測分析：培養結束后，將色綠藻培養液離心收集藻泥，凍干獲得干藻粉并進行色綠藻胞內色素含量分析。4.3實驗結果通過檢測高光誘導條件下細胞生物量和蝦青素產量的變化規律，結果可參見圖5。由色綠藻細胞內蝦青素積累量可知，高強度白光相對于高強度藍光而言，更有利于色綠藻胞內蝦青素的誘導合成。在無氮條件下，高強度白光可以高效誘導合成蝦青素，獲得較高的蝦青素含量為7.11mg/g，其占色綠藻胞內色素的質量百分比可達到69.1％，這是目前已知的色綠藻胞內蝦青素的最高含量；在低氮條件下(0.1g/L氮源)，蝦青素含量略有降低，為6.51mg/g，但是由于生物量相對較高，因而在此條件下培養色綠藻，可以獲得較高的蝦青素產量和產率，分別為38.9mg/L和3.2mg/L/d。相對于之前的色綠藻生產蝦青素的水平而言，采用本實施例的方法，色綠藻胞內蝦青素的生產效率有顯著提升，這也是目前已知的野生型色綠藻生產蝦青素的最高水平。綜合以上結果表明，采用過高強度的藍光，會在一定程度上抑制蝦青素的合成，但是高強度的白光脅迫誘導，則可以進一步提高色綠藻胞內蝦青素的積累量。參見圖6，實施例12可以將次級類胡蘿卜素占總色素的比例提高到最高96.33％，同時蝦青素比例也從最高65.83％提高到69.11％。實施例12～13，角黃素的比例基本維持在11.1～11.6％之間，相應的蝦青素/角黃素比值在5.97～6.13之間。實施例10～11的高強度藍光條件下，蝦青素/角黃素比值在7.3～8.1之間。由于人類日常飲食中的三文魚等魚類體內含有角黃素，過量攝入角黃素具有潛在的眼部病變和皮膚著色等可能風險。聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)提出，對于角黃素每日攝入量需控制在0.03mg/kgbw/day(毫克/公斤體重/天)。蝦青素的每日攝入量為0.06mg/kgbw/day(毫克/公斤體重/天)，因此控制蝦青素和角黃素比值在2：1以上是口服安全的。本發明所提供的方法，采用色綠藻培養獲得的藻粉中蝦青素與角黃素比例遠高于該值，食用安全，未來在食品和營養強化劑應用領域具有廣闊的市場前景。實施例10～11的高強度藍光條件下，蝦青素的產量和產率不如實施例12-13的高強度白光誘導，但是蝦青素/角黃素比值卻高于實施例12-13，高達7.3～8.1之間；而在實施例2-9中，藍光條件下，蝦青素/角黃素比值也高于白光條件下的誘導結果，說明可以利用藍光培養來調控色綠藻胞內角黃素含量以及蝦青素/角黃素比值。本發明實施例中采用的檢測方法可參照如下說明進行：(一)色綠藻胞內蝦青素的HPLC檢測方法1)色綠藻藻粉中蝦青素的提取：準確稱取凍干藻粉10mg，置于裝有陶瓷珠的凍存管中，加入含有0.1％(w/v)BHT的二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，該混合溶劑中二氯甲烷：甲醇的體積比為3:1，高速振蕩1分鐘，然后置于液氮中迅速冷卻，離心收集上清液；沉淀再次加入含有0.1％(w/v)BHT的二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，振蕩，置于液氮中冷卻，離心收集上清液，重復該步驟直至藻泥呈無色為止。合并所有上清液，用氮氣吹干后，用色譜純的甲醇和MTBE的混合溶劑(二者的體積比為1:1)溶劑定容到1mL，用于HPLC法測定色綠藻胞內色素含量。2)HPLC法測定蝦青素含量采用配備PDA檢測器和YMCTMC30色譜柱(4.6mm×150mm,3μm)的液相色譜儀進行分析，洗脫液為色譜級甲醇(流動相A)、甲基叔丁基醚MTBE(流動相B)和水(流動相C)。梯度洗脫程序為：0-6min，95％→80％A、5％→20％B、0％C；6-12min,80％→60％A、20％→38％B、0→2％C；12-28min，60％→50％A、38％→48％B、2％C；28-33min，50％A、48％B、2％C；33-35min，50％→95％A、48％→5％B、2％→0％C；35-38min，95％A、5％B、0％C。柱溫箱溫度為30℃，洗脫液流速為0.8mL/min，進樣量為20μL，PDA檢測器波長設置在300-700nm進行全波長掃描以測定色素吸收光譜圖，同時在480nm波長下測定胞內色素的含量。色素的定性分析采用色素標準品(蝦青素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、角黃素、玉米黃質)的保留時間和特征吸收光譜圖進行分析，定量分析采用色素標準品制作的外標法標準曲線進行計算，對于酮基葉黃素和胡蘿卜素類色素則采用類似的葉黃素標準曲線進行定量分析。(二)色綠藻生物量濃度的測定方法色綠藻培養過程中的生物量濃度測定方法采用干重法進行測定。將取樣獲得的藻液，量取一定體積置于事前稱重的離心管中，在6000r/m轉速下離心1min收集藻細胞沉淀，然后加入純水振蕩懸浮后，重復離心洗滌2次，除去上清液，將含有藻泥的離心管置于60℃烘箱中烘干至恒重，測定藻粉的差重，并換算獲得色綠藻培養液中的生物量濃度。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發明技術方案的范圍內。當前第1頁1 2 3