一種茶堿誘導性RNA干擾開關系統及其基因調節方法和用途與流程

本發明涉及基因調控技術領域，尤其涉及一種茶堿誘導性RNA干擾開關系統及其基因調節方法和用途。

背景技術：

核酸開關，常被定義為“具有功能性的非編碼RNA區域”，通過選擇性結合代謝產物來控制相關基因表達，出現在多種類型細菌的轉錄和轉錄后水平調節網絡上。一系列對核酸開關的開發應運而生，包括基因治療方面。受益于合成生物學的進步，這些天然的核酸開關可被改造成可識別任何指定信號來調節任何指定相關基因表達的工具。

人工核酸開關的多功能性拓展了基因研究的開展方式，其中茶堿適體是最常見最被廣泛應用的調節基因表達裝置之一，在不同的平臺中充當開啟或關閉的開關裝置調節蛋白表達。茶堿誘導性的miRNA或shRNA同樣在以往的研究中強調過。然而，現在仍未開發茶堿誘導性的“RNAi-ON”開關。

技術實現要素：

本發明提供一種茶堿誘導性RNA干擾開關系統及其基因調節方法和用途，該RNA干擾開關系統根據茶堿濃度依賴性能夠激活或抑制RNA干擾通路來控制靶基因的表達。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種茶堿誘導性RNA干擾開關系統，該RNA干擾開關系統至少包括一RNA干擾關閉器件，該RNA干擾關閉器件本身是一人工miRNA前體或者經轉錄成為一人工miRNA前體，上述人工miRNA前體包括miRNA前體部分以及融合到上述miRNA前體部分的環狀區域的茶堿RNA適體部分，上述茶堿RNA適體部分可以被茶堿結合以阻礙RNA干擾作用的發生。

進一步地，上述RNA干擾開關系統還包括一RNA干擾開啟器件，該RNA干擾開啟器件包括上述RNA干擾關閉器件和靶向靶基因的shRNA，上述RNA干擾關閉器件中的miRNA的成熟體能夠與上述shRNA骨架的環狀區域匹配結合使得shRNA前體轉錄被抑制，以便通過添加茶堿來激活RNA干擾作用的發生。

進一步地，上述靶基因是與癌癥發生相關的基因。

進一步地，上述與癌癥發生相關的基因是TINCR基因。

進一步地，上述人工miRNA前體對應的DNA序列本身是或者包括SEQ ID NO：5所示的序列。

進一步地，上述shRNA對應的DNA序列本身是或者包括SEQ ID NO：9所示的序列。

根據本發明的第二方面，本發明提供一種基于茶堿誘導性RNA干擾開關系統的基因調節方法，該基因調節方法包括將第一方面的茶堿誘導性RNA干擾開關系統導入細胞內，在茶堿的存在下，激活或抑制RNA干擾作用的發生，從而控制靶基因的表達。

進一步地，上述方法對RNA干擾作用的激活或抑制作用具有茶堿濃度依賴性。

進一步地，上述方法中，上述人工miRNA前體對應的DNA序列本身是或者包括SEQ ID NO：5所示的序列；上述shRNA對應的DNA序列本身是或者包括SEQ ID NO：9所示的序列。

根據本發明的第三方面，本發明提供第一方面的茶堿誘導性RNA干擾開關系統在制備由癌癥發生相關的靶基因引起的疾病的藥物中的用途。

本發明提供一種新穎的RNA調節器(茶堿誘導性RNA干擾開關系統)，根據茶堿濃度依賴性它能夠激活或抑制RNA干擾通路來控制靶基因的表達。申請人尤其是以新發現的膀胱癌相關非編碼RNA TINCR作為靶基因，驗證茶堿誘導性RNA干擾開關系統的功能，發現該開關系統在膀胱癌細胞中能夠定量控制非編碼RNA TINCR的表達量來抑制膀胱癌細胞的進展。

附圖說明

圖1顯示si-TINCR轉染膀胱癌細胞5637和SW780后，TINCR表達水平被顯著性抑制。

圖2顯示(A,B)轉染siRNA TINCR后EdU檢測膀胱癌細胞增殖的代表性圖片。(C)分別在轉染si-TINCR后，發現5637及SW780膀胱癌細胞增殖受到顯著性地抑制。(D,E)轉染si-TINCR后0，24，48，72小時，膀胱癌細胞T24、5637顯著抑制癌細胞的生長。(F)轉染siRNA TINCR后，ELISA法檢測細胞凋亡法發現膀胱5637和SW780癌細胞中caspase 3酶的活性顯著性提高。(G,H)siRNA TINCR后流式細胞儀檢測膀胱癌細胞凋亡的代表性圖片。(I)轉染siRNA TINCR后，膀胱癌細胞中早期凋亡細胞數顯著性提高。

圖3顯示茶堿誘導性RNA干擾開關系統的設計與描述。(A)關閉器件：茶堿的RNA適體被整合到人工miRNA的環狀區域，當結合茶堿時RNA干擾將會被抑制。RNA轉錄的二級結構、適體結構域、miRNA成熟體結構域和分階段的公式如圖所示。(B)開啟器件：由茶堿調控的人工miRNA能夠抑制shRNA對TINCR沉默作用。miRNA前體、shRNA前體、適體結構域、miRNA成熟體結構域和分階段的公式如圖所示。s表示miRNA或shRNA在正常生理條件下正常表達率；n表示RNA干擾的抑制參數，即miRNA或shRNA在細胞內降解率；λ表示miRNA或shRNA靶位點與RISC復合體的親和力；K表示lncRNA結合RISC復合體后降解率；[x]表示茶堿濃度x。

圖4顯示體外驗證茶堿誘導性RNA干擾開關系統。(A)0-4mM茶堿下TINCR在膀胱癌細胞的表達量。(B,C)CCK8結果提示在0-2mM茶堿對膀胱癌細胞生長具有很小的影響。(D)轉染人工miRNA之后TINCR在膀胱癌細胞的表達量，amiRNA-TINCR在5637和SW780中能夠有效地敲低TINCR。(E,F)轉染突變茶堿適體的RNA干擾開關對照系統后，在0/2mM茶堿下膀胱癌細胞TINCR的表達量。(G-J)轉染茶堿誘導性RNA干擾開關對照系統后，在不同茶堿濃度下膀胱癌細胞TINCR的表達量。

圖5顯示體外茶堿誘導性RNA干擾關閉器件對膀胱癌細胞增殖及凋亡的影響。(A,B)轉染關閉器件后EdU檢測膀胱癌細胞增殖的代表性圖片。(C)EdU試驗提示在2mM茶堿情況下，關閉器件可抑制由沉默TINCR引起的膀胱癌細胞增殖抑制。(D,E)CCK8試驗提示在2mM茶堿情況下，關閉器件可抑制由沉默TINCR引起的細胞生長抑制。(F)ELISA試驗提示在2mM茶堿情況下，關閉器件可抑制由沉默TINCR引起的caspase 3酶活性的提高。(G,H)轉染關閉器件后流式細胞儀檢測膀胱癌細胞凋亡的代表性圖片。(I)流式凋亡細胞試驗提示在2mM茶堿情況下，關閉器件可抑制由沉默TINCR引起的細胞早期凋亡。

圖6顯示體外茶堿誘導性RNA干擾開啟器件對膀胱癌細胞增殖及凋亡的影響。(A,B)轉染開啟器件后EdU檢測膀胱癌細胞增殖的代表性圖片。(C)EdU試驗提示在2mM茶堿情況下，開啟器件可激活由沉默TINCR引起的膀胱癌細胞增殖抑制。(D,E)CCK8試驗提示在2mM茶堿情況下，開啟器件可激活由沉默TINCR引起的細胞生長抑制。(F)ELISA試驗提示在2mM茶堿情況下，關開啟器件可激活由沉默TINCR引起的caspase 3酶活性的提高。(G,H)轉染關閉器件后流式細胞儀檢測膀胱癌細胞凋亡的代表性圖片。(I)流式凋亡細胞試驗提示在2mM茶堿情況下，開啟器件可激活由沉默TINCR引起的細胞早期凋亡。

具體實施方式

下面通過具體實施方式結合附圖對本發明作進一步詳細說明。

在本發明中，所謂的“RNA干擾開關系統”是指特別設計的核苷酸序列，其結構特征表現為，包括一RNA干擾關閉器件，該RNA干擾關閉器件本身是一人工miRNA前體或者經轉錄成為一人工miRNA前體，上述人工miRNA前體包括miRNA前體部分以及融合到上述miRNA前體部分的環狀區域的茶堿RNA適體部分，上述茶堿RNA適體部分可以被茶堿結合以阻礙RNA干擾作用的發生。

同時，本發明的RNA干擾開關系統還可以包括一RNA干擾開啟器件，該RNA干擾開啟器件包括上述RNA干擾關閉器件和靶向靶基因的shRNA，上述RNA干擾關閉器件中的miRNA的成熟體能夠與上述shRNA骨架的環狀區域匹配結合使得shRNA前體轉錄被抑制，以便通過添加茶堿來激活RNA干擾作用的發生。

需要說明的是，根據本發明的構思，本發明的RNA干擾開關系統并不局限于實施例中給出的具體核苷酸序列，而是只要具有本發明中所描述的結構特征就能夠廣泛地適用于各種RNA干擾的關閉和開啟。

本發明中，靶基因可以是與癌癥發生相關的基因，例如TINCR基因。因此，通過本發明的RNA干擾開關系統能夠關閉或開啟與TINCR基因相關的RNA干擾。因此，本發明的RNA干擾開關系統在制備由癌癥發生相關的靶基因(例如TINCR基因)引起的疾病的藥物中有重要用途。

以下通過實施例詳細說明本發明的技術方案和技術效果。應當理解，實施例僅是示例性的，不能理解為對本發明保護范圍的限制。

I.技術與方法

1.siRNA、質粒構建

本次實驗中所有的siRNA和質粒由中國上海吉瑪有限公司合成。siRNA的序列如下：si-TINCRB(正義鏈):5'-GAUCCCGAGUGAGUCAGAAUU-3'(SEQ ID NO：1)；si-NC(正義鏈，陰性對照):5'-UUCUCCGACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO：2)。茶堿誘導性RNA干擾開關系統序列和對照系統序列設計后通過化學合成得到，表1所示的序列插入到siCHECK^TM-2載體的Xhol/Notl位點，表2所示的序列插入到pGPU6-GFP-Neo載體的BbsI/BamHI位點。

表1

表2

注：本發明中所涉及的核苷酸序列以表1和表2中的記載為準。

2.細胞培養和轉染

膀胱癌細胞(5637，SW780)和SV40永生化人尿路上皮細胞(SV-HUC-1)購自中國上海市中國科學院細胞研究中心。5637細胞系用1640培養基(Invitrogen,CA)，SW780細胞系用DMEM培養基(Invitrogen,CA)，SV-HUC-1用F12K培養基(Invitrogen,CA)，以上培養基均加入10％的胎牛血清(Invitrogen)和1％的雙抗，貼壁生長，37℃和5％CO2條件下培養，0.05％胰酶消化傳代。對于瞬時轉染實驗，根據Lipofectamine3000說明書，當細胞密度達到70-80％后，使用Lipofectamin3000試劑及質粒的混合液處理細胞。

3.RNA提取和實時定量PCR

總RNA提取按照TRIzol RNA提取試劑(Life Technologies)操作說明進行，Nanodrop測定總RNA的含量和濃度。總RNA按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)逆轉錄試劑盒操作說明逆轉錄成cDNA。實時定量PCR按照SYBR Premix Ex Taq II(Takara)試劑操作說明利用ABI VIVI7熒光定量PCR系統(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)執行。

相關引物如下：

TINCR正向引物:5’-TGTGGCCCAAACTCAGGGATACAT-3’(SEQ ID NO：11),反向引物:5’-AGATGACAGTGGCTGGAGTTGTCA-3’(SEQ ID NO：12)；

GAPDH正向引物:5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'(SEQ ID NO：13),反向引物:5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’(SEQ ID NO：14)。

PCR循環參數如以下所示：95℃保持15分鐘,接著40個循環：94℃保持15秒，55℃保持30秒和72℃保持 30秒。每次試驗至少重復三次。內參對照基因為GAPDH基因，所有數據均參照GPADH的表達作歸一化處理。

4.細胞增殖實驗

細胞增殖實驗根據Cell Counting Kit-8,CCK-8試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnologya)和ethynyl-2-deoxyuridine,EdU試劑盒(Ribobio)操作說明進行。CCK-8法檢測細胞增殖：(1)細胞轉染換液后標記為0H，向其中加入培養基體積1/10的CCK-8；(2)將孔培養板繼續放置于5％CO2和37℃的培養箱內繼續培養約1-4小時，取出孔板用Multiscan GO在450nm波長處檢測OD值，并記錄實驗結果。(3)24H、48H和72H時CCK-8處理方法同上，注意CCK-8孵育時間一致。EdU法檢測細胞增殖：(1)用細胞培養基按 1000：1的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量 50μM EdU培養基；(2)每孔加入 500μl50μM EdU培養基孵育 2小時，棄培養基；(3)PBS清洗細胞 1～2次，每次 5分鐘；(4)細胞固定化；(5)Apollo染色；(6)DNA染色。每次試驗至少重復三次。

5.細胞凋亡實驗

細胞凋亡實驗根據按照Caspase-3酶聯免疫吸附試劑盒(Cusabio)和Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(Transdetect)操作說明進行。Caspase-3酶聯免疫吸附實驗：(1)配液；(2)溫育；(3)加酶標工作液；(4)顯色；(5)檢測OD值。流式細胞儀檢測凋亡細胞實驗：細胞轉染換液后48h，根據操作說明，收集細胞，使用FITC-Annexin V和PI染料雙重顏色，再通過流式流式細胞儀進行分選。每次實驗進行至少三次。

6.統計學分析

本實驗中設計到數據均使用SPSS22.0統計軟件進行統計學分析。兩組間采用獨立樣本t檢驗方法統計,多組間比較均采用獨立樣本方差分析(ANOVA)檢驗方法統計,檢驗水準以P<0.05表示差別具有統計學意義。

II.實驗結果

1.靶向TINCR的siRNAs對膀胱癌細胞增殖、凋亡的影響

為了驗證TINCR在膀胱癌的功能，我們利用siRNA敲低兩個膀胱癌細胞系的內源性TINCR表達水平進行檢測。分別在膀胱癌細胞5637和SW780兩個細胞系中轉染si-TINCR和si-NC,轉染 48小時后,采用qRT-PCR檢測細胞中TINCR基因的mRNA表達量。圖1顯示,與對照組相比,實驗組TINCR的表達量在SW780和 5637細胞中均顯著地降低,差異均具有顯著差異。然后我們分別用CCK-8及EdU細胞增殖法檢測TINCRsiRNA對膀胱癌細胞生長的影響。圖2A-F結果顯示,敲低TINCR過后兩個膀胱癌細胞系生長均受到抑制。與此同時我們分別用caspase3酶ELISA和流式細胞術檢測膀胱癌細胞的凋亡情況。圖2G-I結果顯示，相比對照組，實驗組的caspase 3酶的活性和早期凋亡細胞均顯著地升高。以上數據說明了敲低TINCR表達水平能夠抑制膀胱癌細胞增殖及促進其發生凋亡。

2.茶堿誘導性RNA干擾系統的構建

第一步我們先構建出茶堿誘導性RNA干擾關閉器件，該器件能夠轉錄出人工miRNA的前體，而茶堿適體將插入到miRNA前體的骨架的環狀區域，而前體配體調控子能夠選擇性識別miRNA前體的末端環狀區，從而阻止剪切復合體的加工，令miRNA的成熟體生成受到抑制。依據此，我們將茶堿RNA適體融合到miRNA前體環狀區域。在茶堿誘導性RNA干擾關閉器件中，通過添加茶堿能夠阻礙RNA干擾作用同時去除其對TINCR的抑制作用(圖3A)。

然后我們通過組合RNA干擾關閉器件和靶向TINCR的shRNA來構建茶堿誘導性RNA干擾開啟器件，器件中的miRNA成熟體能夠與shRNA骨架的環狀區域匹配結合。開啟器件的設計是依據空間位阻效應，被miRNA結合后的shRNA前體轉錄將被抑制。因此在茶堿誘導性RNA干擾開啟器件中，通過添加茶堿能夠激活RNA干擾作用同時產生對TINCR的抑制作用(圖3B)。

最后我們為了闡明兩個器件功能的重要參數，我們建立了相關數學模型。通過一系列不同的公式來闡述茶堿濃度與lncRNA敲低效率之間的關系，盡可能細化到每個進程。該模型指出隨著濃度輸入提高，基因的表達量將大幅度改變，而兩者關系體現出非線性和飽和性，正是多種生物學現象的重要特點。

3.體外茶堿誘導性RNA干擾開關系統對TINCR表達量的作用

為了驗證開關系統的有效性，根據相關研究我們設置了一系列的茶堿濃度梯度對系統進行驗證。首先通過CCK8試驗檢測不同茶堿濃度對細胞生存的影響，通過實時定量PCR檢測不同茶堿濃度對TINCR表達的影響。結果提示在0-2mM濃度范圍內，茶堿對細胞生存和TINCR表達影響很小。當茶堿濃度達到4mM，TINCR表達量仍未收影響，但此時膀胱癌細胞生長受一定限制(圖4A-C)。接著我們通過實時定量qPCR驗證靶向TINCR的人工miRNA的功能，與對照組相比，amiRNA-TINCR能夠有效地敲低TINCR(圖4D)。分別轉染開啟、關閉及相關對照器件之后，如果圖4G-J所示，在0-2mM茶堿誘導下，茶堿誘導性RNA干擾開啟和關閉器件均能夠定量調節TINCR的表達企且在2mM達到最大誘導效果。因此后續驗證工作我們將采用2mM茶堿為工作濃度。為了進一步確定系統是通過茶堿適體發揮作用，我們構建了另一套突變茶堿適體的誘導RNA干擾開關對照系統，如圖4E-F突變茶堿適體的誘導性RNA干擾開關對照系統不具備與茶堿的應答功能。

4.體外驗證茶堿誘導性RNA干擾開關系統對膀胱癌細胞增殖及凋亡的作用

膀胱癌細胞5637和SW780分別轉染茶堿系統后，在含有0或2mM茶堿的培養基中培養。轉染關閉器件后，兩種濃度處理對比下，EdU試驗和CCK8試驗顯示0mM茶堿下膀胱癌細胞生長被顯著抑制，流式細胞凋亡試驗和ELISA試驗顯示0mM茶堿下膀胱癌細胞凋亡細胞數增多(圖5)。再次驗證敲低TINCR能夠抑制膀胱癌細胞生長和促進其發生凋亡，同時說明RNA干擾能夠被器件所抑制。與此相反，轉染開啟器件后，EdU試驗和CCK8試驗顯示2mM茶堿下膀胱癌細胞生長被顯著抑制，流式細胞凋亡試驗和ELISA試驗顯示2mM茶堿下膀胱癌細胞凋亡細胞數增多(圖6)，證實RNA干擾能夠被器件所激活。總體而言，茶堿誘導性RNA干擾開關系統提供了一個具有精確濃度依賴性的平臺來調節膀胱癌細胞增殖和凋亡。

結論

在本次研究中，我們的結果證實了茶堿誘導性RNA干擾開關系統能夠根據茶堿的濃度開啟或者關閉RNA干擾的作用，可對靶基因進行精確且定量調控。通過這種方法我們能夠更全面地更簡便地對基因進行調節，受益于合生生物學技術的進步，各種強大的應用將會陸續呈現在基礎生物學和應用生物學領域中。

以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。