本發明提供了一種能夠大規模生產艾塞那肽的合成方法，特別是有助于減少消旋和缺失肽及緩解β折疊的形成，屬于多肽合成技術領域。
背景技術：
糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病。持續高血糖與長期代謝紊亂等可導致全身組織器官，特別是眼、腎、心血管及神經系統的損害及其功能障礙和衰竭。嚴重者可引起失水，電解質紊亂和酸堿平衡失調等急性并發癥酮癥酸中毒和高滲昏迷。全世界糖尿病患者超過1.5億，其中II型糖尿病人超過了一半。
艾塞那肽，適應癥為本品用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，適用于單用二甲雙胍、磺酰脲類．以及二甲雙胍合用磺酰脲類，血糖仍控制不佳的患者。
艾塞那肽的序列如下：
His1-Gly2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Leu10-Ser11-Lys12-Gln13-Met14-Glu15-Glu16-Glu17-Ala18-Val19-Arg20-Leu21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39-NH2
目前艾塞那肽的合成主要有三種方法：
A：利用基因重組技術獲得艾塞那肽的序列，在專利CN1635117A、CN1693459A中公開了該種方法制備艾塞那肽的技術；
B：采用液相合成或固液結合的方法合成，但由于液相合成的工藝比較繁瑣，后處理麻煩，涉及到的關鍵工藝點太多，因此不利于序列比較長的多肽的合成。本方法在專利CN1018 35794A中有公開提及；
C：采用固相合成的方法，由于液相合成每個步驟都要進行分離提純，對于39個殘基的多肽來說，合成周期長，且中間工藝的關鍵參數太多，不易控制，很容易造成工藝的不穩定，因此大多還是采用固相合成的方法合成艾塞那肽。如國內專利中的CN101538324、CN101357 938。但是由于逐步偶聯氨基酸的過程中，由于每個氨基酸的特性不同，其存在不同程度的副反應，尤其是常規Fmoc保護的氨基酸，在連接過程中，有關物質的性質與目標肽的性質十分接近，導致最終純化分離困難影響收率和產品質量。
技術實現要素：
本發明針對常規合成中的不足，采用特殊結構的氨基酸或二肽、三肽小片段，降低了合成過程中難分離雜質的產生概率，可以用以大規模的生產。
術語說明：
Linker：在多肽與樹脂間插入的連接臂，起到連接多肽和改善樹脂性質的作用。
偶聯試劑：能引起氨基酸羧基和氨基縮合形成酰胺鍵的試劑。
β-折疊：多肽的二級結構，肽鍵平面折疊成鋸齒狀，相鄰肽鏈主鏈的N-H和C=O之間形成有規則的氫鍵，在β-折疊中，所有的肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與β-折疊的長軸呈垂直關系。
裂解液：多肽合成完成后，將多肽側鏈保護基團切斷以及肽鏈從樹脂上釋放的試劑。
本發明的技術方案如下：
艾塞那肽的合成步驟：
1）以MBHA/AM resin為起始原料，以linker、氨基酸或二肽、三肽為主要原料進行合成。
2）以DIC/HoBt、DIC/HoAt為縮合試劑進行縮合延長肽鏈，20%哌啶/DMF溶液或0.1M 的HoBt 20%哌啶/2%DBU/DMF溶液為脫保護試劑脫除Fmoc基團。
重復氨基酸偶聯，脫Fmoc，氨基酸偶聯，脫Fmoc的過程得到艾塞那肽的肽樹脂：
His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide AM resin/MBHA resin
所述的各Fmoc-氨基酸、二肽、三肽用量與樹脂用量的摩爾比為：2~6:1；氨基酸與縮合試劑預活化在冰水浴的條件下預活化5~15min，反應溫度控制在20-35℃，反應時間控制在30-150mins。
上述步驟得到的肽樹脂經裂解液裂解后，經甲基叔丁基醚沉淀得到艾塞那肽粗肽。
切割液比例為：TFA：ETD：H2O=（87.5~95）：（10~2.5）：（2.5~5）；樹脂與切割液的比例為6~15ml/g肽樹脂，裂解液在-10~-20℃下預冷30mins，裂解時間在2.5~4hrs，裂解溫度在20~40℃。
本發明優選TFA：EDT：H2O=90：5：5，裂解液在-20℃下預冷30mins，裂解時間為180mins，裂解溫度控制在30℃，裂解液與樹脂比例選擇為8ml/g肽樹脂，過濾后的裂解液與甲基叔丁基醚比例為1:6（v/v）。
將得到的艾塞那肽粗品經制備色譜純化凍干后得到艾塞那肽成品。
Fmoc-His-Gly-OH.HCl的制備為：
將原料Fmoc-His(Trt)-OH溶于無水DCM中，再加入1.5eq的EDCI，HoSu在氮氣保護下，攪拌22hrs，然后水洗，飽和食鹽水洗，有機相用無水硫酸鈉干燥得到Fmoc-His(Trt)-Osu，將得到的Fmoc-His(Trt)-Osu用THF溶解，滴加到含有1.2eq的H-Gly-OH的碳酸氫鈉水溶液中，反應3hrs，過濾，旋蒸。然后用磷酸水溶液調節Ph到3~4，DCM萃取，后有機相酸洗，水洗，飽和食鹽水洗滌，干燥后得到Fmoc-His(Trt)-Gly-OH用4N 的鹽酸乙酸乙酯處理2.5hrs，旋干后，過層析柱得到Fmoc-His-Gly-OH.HCl。
本發明的有益效果是：該方法以AM/MAHA樹脂為起始樹脂，然后通過Rink amide linker作為連接橋，再依次連接氨基酸或二肽，三肽片段的方法得到艾塞那肽的肽樹脂，本發明通過Fmoc-(Hmb)Leu21-OH的引入有效緩解了肽鏈Ser11-Val19間的β折疊的情況，并通過Fmoc-Pro36-Pro37-Pro38–OH片段的引入有效減少了逐步連接Pro36-Pro37-Pro38過程中De-Pro的雜質。最后采用Fmoc-His-Gly-OH的引入減少了（D-His1）以及（De-Gly2）、（+Gly)的雜質，從而降低了分離純化時的難度，大大提高了產品收率和純度。
具體的實施方式：
以下通過實例來說明本發明，但是，這些實例只是為了更加詳細具體的說明本發明的具體操作，而不是對本發明進行限制。
實施例1
將原料Fmoc-His(Trt)-OH（62g，100mmol）溶于無水DCM(200ml)中，再加入EDCI(28.8g，150mmol)，HoSu(17.3g，150mmol)在氮氣保護下，攪拌22hrs，然后水洗(60ml*3)，飽和食鹽水洗(60ml*3)，有機相用無水硫酸鈉干燥得到Fmoc-His(Trt)-Osu(68.5g，收率：95.6%)。將得到的Fmoc-His(Trt)-Osu（95.6mmol）用THF(100ml)溶解，滴加到含有H-Gly-OH(9.75g，114.7mmol)的碳酸氫鈉(15.2g，143.4mmol)水溶液(50ml)中，反應3hrs，過濾，旋蒸。然后用5%磷酸水溶液調節pH值到3~4，DCM萃取，隨后有機相經酸洗，水洗，飽和食鹽水洗滌，干燥后得到的Fmoc-His(Trt)-Gly-OH用4N 的鹽酸乙酸乙酯(100ml)處理2.5hrs，旋干后，經層析柱純化，得到Fmoc-His-Gly-OH.HCl(34.1g，78.39mmol)，收率82%；
實例2全保護的艾塞那肽肽樹脂的制備
（1）稱取AM resin（9.4g，5mmol，sub：0.53mmol/g）加入到帶夾套的玻璃反應器中，加入100mlDCM溶脹2hrs，再抽濾，并用2%DIEA/DCM溶液洗滌2次，DMF洗滌兩次，加入Rink amide linker(5.4g，10mmol)，HoBt(1.35g，10mmol)，再用適量DMF溶解后，加入DIC(1.58ml，10mmol)，在循環水溫30℃的夾套反應器中反應2.5hrs，反應終點用茚三酮檢測液進行檢測，呈陰性，說明反應完全。
反應完全后，用脫保護液脫保護，Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro -Pro-Ser(tBu)-AM resin 段用20%哌啶/DMF溶液脫保護30mins，His-Gly-Glu(OtBu)-Gly- Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)段脫保護用0.1M 的HoBt 20%哌啶/2%DBU/DMF溶液脫保護30mins。
每步氨基酸的偶聯按照[0024]中連接方式偶聯，但每次偶聯試劑及氨基酸需要在冰水浴中預活化15min左右，再進行連接。
依次偶聯的氨基酸為：
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-(Hmb)Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-His-Gly-OH。
制得艾塞那肽的全保護肽樹脂如下：
His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide AM resin。
實例3全保護的艾塞那肽肽樹脂的制備
稱取AM resin（28.3g，15mmol，sub：0.53mmol/g）加入到帶夾套的玻璃反應器中，加入300mlDCM溶脹2hrs，再抽濾，并用2%DIEA/DCM溶液洗滌2次，DMF洗滌兩次，加入Rink amide linker(16.19g，30mmol)，HoBt(4.06g，30mmol)，再用適量DMF溶解后，加入DIC(4.75ml，30mmol)，在循環水溫30℃的夾套反應器中反應2.5hrs，反應終點用茚三酮檢測液進行檢測，呈陰性，說明反應完全，其余氨基酸的連接按照Rink amide linker 的偶聯方式進行連接，但每次都是對氨基酸在冰水浴條件進行預活化15min左右，再進行偶聯得到艾塞那肽全保護肽樹脂：
His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide AM resin。
實例4全保護的艾塞那肽肽樹脂的制備
稱取MBHA resin（10g，5mmol，sub:0.5mmol/g）加入到帶夾套的玻璃反應器中，加入100mlDCM溶脹2hrs，再抽濾，并用2%DIEA/DCM溶液洗滌2次，DMF洗滌兩次，加入Rink amide linker(5.4g，10mmol)，HoBt(1.35g，10mmol)，再用適量DMF溶解后，加入DIC(1.58ml，10mmol)，在循環水溫30℃的夾套反應器中反應2.5hrs，反應終點用茚三酮檢測液進行檢測，呈陰性，說明反應完全，其余氨基酸的連接按照Rink amide linker 的偶聯方式進行連接，但每次都是對氨基酸在冰水浴條件進行預活化15min左右，再進行偶聯得到艾塞那肽全保護肽樹脂：
His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide MBHA resin。
實例5全保護的艾塞那肽肽樹脂的制備
稱取MBHA resin（30g，15mmol，sub:0.5mmol/g）加入到帶夾套的玻璃反應器中，加入300mlDCM溶脹2hrs，再抽濾，并用2%DIEA/DCM溶液洗滌2次，DMF洗滌兩次，加入Rink amide linker(16.19g，30mmol)，HoBt(4.06g，30mmol)，再用適量DMF溶解后，加入DIC(4.75ml，30mmol)，在循環水溫30℃的夾套反應器中反應2.5hrs，反應終點用茚三酮檢測液進行檢測，呈陰性，說明反應完全，其余氨基酸的連接按照Rink amide linker 的偶聯方式進行連接，但每次都是對氨基酸在冰水浴條件進行預活化15min左右，再進行偶聯得到艾塞那肽全保護肽樹脂：
His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide AM resin。
實例6 艾塞那肽粗肽的制備
裂解液的配制：配置裂解液100ml，其中三氟乙酸90ml，EDT(1，2-乙二硫醇）5ml，純水5ml，搖勻后-20℃冷卻30min備用。
將實例2中的全保護艾塞那肽樹脂10g(-20℃預冷30min)，加入到250ml帶有磁子的圓底燒瓶中，將[034]中的裂解液取出搖勻，量取80ml加入到燒瓶中，裂解溫度在30min上升到30℃，并維持30±2℃攪拌2.5hrs。用砂芯漏斗過濾并用少量切割液洗滌樹脂。將合并的濾液緩慢導入冷甲基叔丁基醚（-20℃預冷2hr）540ml，倒入過程要保持甲基叔丁基勻速攪拌，出現白色沉淀，用布氏漏斗過濾，并用冷甲基叔丁基醚洗滌濾餅3次，真空抽干得到粗肽4.82g（收率：92.1%）
實例7 艾塞那肽粗肽的制備
裂解液的配制：配置裂解液100ml，其中三氟乙酸90ml，EDT(1，2-乙二硫醇）5ml，純水5ml，搖勻后-20℃冷卻30min備用。
將實例3中的全保護艾塞那肽樹脂10g(-20℃預冷30min)，加入到250ml帶有磁子的圓底燒瓶中，將[037]中的裂解液取出搖勻，量取80ml加入到燒瓶中，裂解溫度在30min上升到30℃，并維持30±2℃攪拌2.5hrs。用砂芯漏斗過濾并用少量切割液洗滌樹脂。將合并的濾液緩慢導入冷甲基叔丁基醚（-20℃預冷2hr）540ml，倒入過程要保持甲基叔丁基醚勻速攪拌，出現白色沉淀，用布氏漏斗過濾，并用冷甲基叔丁基醚洗滌濾餅3次，真空抽干得到粗肽4.75g（收率：91.8%）
實例8 艾塞那肽粗肽的制備
裂解液的配制：配置裂解液500ml，其中三氟乙酸450ml，EDT(1，2-乙二硫醇）25ml，純水25ml，搖勻后-20℃冷卻30min備用。
將實例4中的全保護艾塞那肽樹脂50g(-20℃預冷30min)，加入到1L帶有磁子的圓底燒瓶中，將[040]中的裂解液取出搖勻，量取400ml加入到燒瓶中，裂解溫度在30min上升到30℃，并維持30±2℃攪拌2.5hrs。用砂芯漏斗過濾并用少量切割液洗滌樹脂。將合并的濾液緩慢導入冷甲基叔丁基醚（-20℃預冷2hr）2.7L，倒入過程要保持甲基叔丁基勻速攪拌，出現白色沉淀，用布氏漏斗過濾，并用冷甲基叔丁基醚洗滌濾餅3次，真空抽干得到粗肽24.8g（收率：93.3%）
實例9 艾塞那肽粗品的純化
稱取艾塞那肽的粗品用10%的醋酸水溶液溶解，溶液用0.45μm的微孔過濾膜過濾，待用。
高效液相色譜法進行純化的條件，色譜柱以粒徑為10μm，孔徑為300?的C18鍵合硅膠為固定相。經過2步純化一步換鹽得到艾塞那肽的成品。純度為99。47%，[D-His1]雜質，[De-Gly2]雜質，[+Gly2]雜質均小于0.1%。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。