本發明涉及藥物化學及有機合成領域，具體說是一類具抗腫瘤活性去甲斑蝥素衍生物及其制備方法。
技術背景
斑蝥素分子中含有氧雜降冰片烯結構，而很多有此類結構的化合物都具備藥理活性，氧雜降冰片烯結構在斑蝥素類抗腫瘤活性中發揮的作用值得探索。其可有效抑制包括：肝癌，肺癌，喉癌，食管癌，胰腺癌，結腸癌，口腔癌，膀胱癌，乳腺癌和白血病等多種癌癥細胞，對肝癌的治療效果尤為突出。斑蝥素不僅具有廣泛的抗癌譜且不易產生耐藥性、抗癌效率較高等優點，而且具有抗病毒，升高白細胞和改善胰功能等作用。
與斑蝥素相比，去甲基斑蝥素（NCTD）是在斑蝥素的基礎上少了2,3位上的兩個甲基，這使得其毒性大大降低，基本上消除了斑蝥素對泌尿系統的刺激這一副作用，且并不影響NCTD的活性。并且實驗發現：NCTD是目前唯一具有升高白細胞作用的抗腫瘤藥物。因至今沒有對斑蝥素系統的藥物化學及藥物作用機制的研究是其未獲FDA批準，以至于斑蝥素類藥物一直受FDA限制，但由于其優良的抗腫瘤活性，一直被臨床應用和研究。特別在中國，斑蝥素類藥物一直作為臨床抗腫瘤藥物在使用，對其依賴性強，市場潛力巨大。
為降低斑蝥素的毒性，對斑蝥素分子進行結構改造衍生化等研究工作備受關注，去甲斑蝥素等就是其較好的衍生物的代表，而且其分子含有氧雜降冰片烯結構，而氧雜降冰片烯結構化合物和含氮化合物大多分別具有良好的藥用活性，以期通過兩類結構的良好結合得到具有更好藥理活性分子。因此，本發明在斑蝥素構效關系研究的基礎上，以呋喃與丁炔二酸二甲/乙酯為原料，經D-A反應后首先構建去甲斑蝥素的母環—氧雜冰片烯，再以7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸二甲/乙酯和含氮化合物為原料，探索胺對氧雜冰片烯的加成反應制備去甲斑蝥素衍生物。
技術實現要素：
本發明提供了一種以丁炔二酸二甲/乙酯與呋喃為原料制備中間體7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸二甲/乙酯，再利用胺對氧雜冰片烯的Aza-Michael加成反應制備一類具抗腫瘤活性的去甲斑蝥素衍生物（I）的綠色合成方法。
本發明所合成的去甲斑蝥素衍生物（I）的結構如下所示：
其中：R1、R2、R3選自氫原子、鹵素原子、甲氧基、三氟甲基、硝基、烷基或芳基中的一種。
本發明制備去甲斑蝥素衍生物（I）的方法包含以下步驟：
（1）丁炔二酸二甲/乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸甲/乙酯；
（2）中間體（I）與胺類化合物（）在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到去甲斑蝥素衍生物（I）。
制備路線為：
本發明步驟1中間產物的NMR數據如下：
Yellow oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.18 (2H, t, J = 0.9 Hz), 5.63 (2H, t, J = 1 Hz), 4.26-4.20 (4H, m), 1.28 (6H, t, J = 7.1 Hz).
Yellow oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.21 (2H, t, J = 1.0 Hz), 5.68 (2H, t, J = 1 Hz), 3.08 (6H, s).
本發明的有益效果是：
（1）設計合成了新的具有抗腫瘤活性的去甲斑蝥素衍生物，結構新穎，填補了本領域的空白，為制備選擇性抑制腫瘤細胞、毒性小的斑蝥素衍生物打下基礎，具有潛在產業化開發價值以及對研究抗癌藥物的重要貢獻；
（2）本發明的兩個初始原料均簡單易得，經兩步簡單反應，工藝條件溫和，實驗操作簡單，綠色高效，具有良好的工業化市場前景。
具體實施實例
實例1 2-4-苯基哌嗪基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與4-苯基哌嗪在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2-4-苯基哌嗪基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield: 83%, yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3447, 2333, 1731, 1597, 1452, 1263, 1127, 1136, 1060, 860, 755, 568 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.27-7.23 (2H, m), 6.91-6.83 (3H, m), 6.59-6.57 (1H, m), 6.25-6.23 (1H, m), 5.31 (1H, s), 5.24 (1H, s), 4.23-4.09 (4H, m), 3.42 (1H, s), 3.08-2.93 (8H, m), 1.32 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.1 Hz). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.1, 169.9, 151.3, 140.7, 135.0, 129.2, 120.0, 116.2, 81.2, 80.2, 78.2, 61.2, 61.0, 53.3,50.2, 48.2, 14.6, 14.4;HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C22H28N2O5Na+[(M+Na)+], 423.1890; found, 423.1885.
實例2 2-4-甲基哌嗪基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與4-甲基哌嗪在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2-4-甲基哌嗪基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield: 59%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3447, 3136, 2838, 2345, 1733, 1455, 1378, 1266, 1127, 1056, 859, 808, 558 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ6.54-6.51 (1H, m), 6.19-6.16 (1H, m), 5.23-5.17 (2H, m), 4.22-4.08(4H, m), 3.35-3.34 (1H, m), 2.82-2.74 (4H, m), 2.30-2.19 (7H, m), 1.30-1.23 (6H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ 170.1, 169.8, 140.5, 134.7, 81.0, 79.9, 77.9, 60.9, 60.7, 55.8, 53.0, 46.0, 14.3, 14.2; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C22H28N2O5[M+Na+], 423.1890; found, 423.1885.
實例3 2-哌啶基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與哌啶在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2-哌啶基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield: 89%; White solid; m.p. 81-82 oC; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3448, 3134, 2332, 1728, 1452, 1265, 1126, 1061, 860, 568 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.54-6.53 (1H, m), 6.20-6.18 (1H, m), 5.29 (1H, s), 5.18 (1H, s), 4.22-4.11 (4H, m), 3.36 (1H, s), 2.72-2.67 (4H, m), 1.46-1.36 (6H, m), 1.32-1.26 (6H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.3, 170.3, 140.6, 135.2, 81.3, 80.2, 80.1, 79.1, 61.0, 60.9, 53.0, 50.6, 49.3, 27.0, 24.6, 14.6, 14.3; HRMS (TOF ES+): m/zcalcd for C17H25NO5Na+ [(M+Na)+], 346.1624; found, 346.1622.
實例4 2-嗎啉基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與嗎啉在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2-嗎啉基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield: 97%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3447, 3134, 2332, 1730, 1453, 1262, 1122, 1061, 860, 553 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.57 (1H, dd, J = 5.8, 1.6 Hz), 6.21 (1H, dd, J = 5, 1.7 Hz), 5.24 (2H, d, J = 9.5 Hz), 4.26-4.12 (4H, m), 3.59 (4H, t, J = 4.5 Hz), 3.38 (1H, s), 2.87-2.81 (2H, m), 2.74-2.71 (2H, m), 1.60 (1H, s), 1.34-1.26 (7H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.1, 169.8, 140.8, 134.9, 81.2, 79.8, 78.2, 67.8, 61.2, 60.9, 53.2, 49.7, 48.7, 14.6, 14.4; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C16H23NO6Na+[(M+Na)+], 348.1417; found, 348.31407.
實例5 2-N-乙基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與乙胺在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2-N-乙基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield: 42%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3447, 2980, 2357, 1733, 1457, 1377, 1257, 1126, 1061, 859, 709, 558 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.71 (1H, dd, J = 5.8, 1.7 Hz), 6.35 (1H, dd, J = 5.8, 1.8 Hz), 5.07-5.06 (1H, m), 4.79-4.78 (1H, m), 4.16-4.07 (4H, m), 3.06 (1H, d, J = 4.3 Hz), 2.82-2.76 (1H, m), 2.66-2.60 (1H, m), 1.78 (1H, s), 1.24 (6H, t, J = 7.1 Hz), 1.15 (3H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.6, 170.4, 137.7, 132.8, 85.5, 80.3, 75.6, 61.1, 60.8, 55.9, 39.8, 15.6, 14.2, 14.0.
實例6 2-N-丁基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與丁胺在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2-N-乙基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield: 54%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3381, 2357, 1734, 1664, 1460, 1259, 1127, 860, 550 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.72 (1H, dd, J = 5.8, 1.6 Hz), 6.35 (1H, dd, J = 5.8, 1.8 Hz), 5.08-5.06 (1H, m), 4.79-4.78 (1H, m), 4.16-4.06 (4H, m), 3.05 (1H, d, J = 4.3 Hz), 2.80-2.73 (1H, m), 2.58-2.52 (1H, m), 1.84 (1H, s), 1.53-1.46 (2H, m), 1.38-1.33 (2H, m) 1.26-1.22 (6H, m), 0.90 (3H, t, J = 7.28 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.8, 170.6, 137.8, 133.0, 85.6, 80.4, 75.7, 61.3, 60.9, 60.0, 45.3, 32.5, 20.5, 14.3, 14.1, 14.0; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C16H25NO5Na+ [(M+Na)+], 334.1624; found, 334.1625.
實例7 2-N-烯丙基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與烯丙胺在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2- N-烯丙基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield: 57%; colorless oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3323, 2985, 1734, 1659, 1606, 1459, 1376, 1254, 1170, 1062, 914, 859, 786, 710, 554 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.74 (1H, dd, J = 5.8, 1.7 Hz), 6.34 (1H, dd, J = 5.8, 1.8 Hz), 5.98-5.88 (1H, m), 5.23-5.18 (1H, m), 5.11-5.07 (2H, m), 4.80-4.79 (1H, m), 4.16-4.08 (4H, m), 3.46-3.41(1H, m), 3.24-3.19 (1H, m), 3.08 (1H, d, 4.3 Hz), 2.00 (1H, s), 1.26-1.22 (6H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ 170.5, 170.4, 137.9, 136.0, 132.8, 116.7, 85.8, 80.4, 75.5, 61.3, 60.9, 55.9, 48.5, 14.2, 14.1; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C15H22NO5[(M+1)+], 296.1498; found, 296.1501.
實例8 2-N-苯基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與苯胺在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2- N-苯基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield 54%; White solid; m.p. 107-108 ℃; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3385, 2974, 2331, 1735, 1604, 1511, 1449, 1377, 1321, 1254, 1062, 1011, 859, 749, 689, 551 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.20-7.16 (2H, m), 6.84-6.80 (4H, m), 6.46 (1H, dd, J = 5.8, 1.9 Hz), 5.15-5.14 (1H, m), 5.06-5.05 (1H, m), 4.41 (1H, s), 4.20-4.09 (4H, m), 3.19 (1H, d, J = 4.4Hz), 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.15 (3H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.6, 169.8, 144.9, 138.3, 132.3, 129.1, 119.5, 115.8, 86.5, 80.6, 72.4, 61.9, 61.2, 58.2, 14.1, 14.0.
實例9 2-N-對甲苯基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與對甲苯胺在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2- N-對甲苯基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield 57%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3386, 2356, 1730, 1519, 1454, 1257, 1126, 1061, 858, 814, 567 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.00 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.79 (1H, dd, J = 5.8, 1.6 Hz), 6.74-6.71 (2H, m), 6.46 (1H, dd, J = 5.8, 1.8 Hz), 5.13-5.12 (1H, m), 5.04 (1H, s), 4.26 (1H, s), 4.19-4.09(4H, m), 3.18 (1H, d, J = 4.4 Hz), 2.25 (3H, s), 1.29 (3H, t, J = 7.13 Hz), 1.17 (6H, t, J = 7.13 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.7, 170.40, 142.5, 138.1, 132.5, 129.6, 129.1, 116.4, 86.3, 72.8, 61.9, 61.2, 58.1, 20.6, 14.2, 14.1; HRMS (TOF ES+): m/z calcd for C19H24NO5 [(M+1)+], 346.1468; found, 346.1649.
實例10 2-N-間甲氧基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯的制備
以丁炔二酸二乙酯與過量呋喃無溶劑和無催化劑的條件下，加熱回流得中間產物7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二酸乙酯。中間體再與間甲氧基苯胺在無溶劑、室溫的綠色化學合成條件下，經薄層色譜點板檢測反應完全后，減壓旋去溶劑，PE與EA做洗脫劑柱層析分離提純，制備得到2-N-間甲氧基-7-氧雜二環[2.2.1]庚烷-2,5-二烯-2,3-二乙酯。化合物數據為： Yield 57%; yellow oil; IR (KBr) (νmax, cm-1) 3448, 2356, 1656, 1456, 1265, 1125, 1062, 860, 554 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.09-7.05 (1H, m), 6.80 (1H, dd, J = 5.9, 1.7 Hz), 6.45 (1H, dd, J = 5.8, 1.9 Hz), 6.42-6.36 (3H, m), 5.14-5.13 (1H, m), 5.06-5.05 (1H, m), 4.44 (1H, s), 4.19-4.10 (4H, m), 3.75 (3H, s), 3.19 (1H, d, J = 4.4 Hz), 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.16 (3H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ170.5, 169.7, 160.6, 146.3, 138.2, 132.3, 129.8, 108.5, 104.6, 102.0, 86.5, 80.6, 72.4, 61.9, 61.2, 58.3, 55.2, 14.1, 14.0.
下面通過藥效學實驗來進一步說明其藥物活性。
實驗例：采用MTT法評價化合物對腫瘤細胞株的生長抑制作用
實驗方法：
1、收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入198μL，鋪板使待測細胞調密度至1000-10000/孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）；
2.、5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，設3個副孔，細胞貼壁后加藥2μL；
3.、5%CO2，37℃孵育24小時，倒置顯微鏡下觀察；
4、每孔加入20μL MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h；
5、終止培養，小心吸去孔內培養液；
6、每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值；
7、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）；
抑制率=1-（給藥組OD值均值-空白組OD值均值）/（陰性組OD值均值-空白組OD值均值）。
實驗結果：去甲斑蝥素衍生物對褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）的生長具有顯著的抑制作用。該化合物抑制細胞生長的IC50值為27.517μM。
由上述實驗例表明，本發明的去甲斑蝥素衍生物對腫瘤細胞株褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）的生長具有顯著的抑制作用。由此證明，本發明的去甲斑蝥素衍生物具有抗腫瘤活性，具有用于治療或預防癌癥的用途。這為深入研究和開發新的抗腫瘤藥物開辟了新的途徑和方向。