一種尼羅羅非魚偽雌魚的高效誘導及微衛星分子標記鑒定方法與流程

本發明屬于水產遺傳育種領域，具體涉及一種尼羅羅非魚偽雌魚的高效誘導及微衛星分子標記鑒定方法。

背景技術：

羅非魚的雌魚與雄魚生長存在明顯的差異。為了避免過度繁殖，同時利用雄魚的生長優勢，最為實際有效的解決措施是對羅非魚進行性別控制生產雄性魚苗，養殖全雄魚。

在羅非魚當中存在兩套不同的主要性別決定系統，尼羅羅非魚及莫桑比克羅非魚等性別主要由LG1和23號連鎖群上^[6,7]上的XX/XY系統決定，而其他一些如藍羅非魚性別主要由LG3上的ZW/ZZ系統決定^[2,3]。除了性染色體，常染色體上的小因子也能夠影響主要的性別決定系統。然而除此之外，羅非魚的性別還受到環境中的溫度和環境激素的影響。在卵孵化10日后開始的高溫處理將導致群體中的雄性比率增高^[8]。有研究認為溫度對于羅非魚性別發育的影響可能與表觀遺傳學上的變化相關，Cyp19a，Foxl2，amh，Sox9a，Sox9b等基因在性別分化和決定中起關鍵作用^[8,9]。雌性激素的使用會導致羅非魚的雌性化，XY個體性逆轉，生理性別表現為雌性，此過程可能與調控cyp19a1b，foxl2，amh，DMRT1等基因的表達相關^[11,12]。

為了得到全雄魚，在生產過程當中，通常使用雄激素處理使雌魚發育成雄魚。羅非魚受精后0-18天是性別分化至關重要的時期。在此時期，胚胎對激素非常敏感^[15]。采用口服雄性激素如甲基睪丸酮處理羅非魚魚苗，誘導遺傳上的雌魚轉換為功能上的雄魚是雄性羅非魚生產的主要方式之一。但是近年來研究發現，甲基睪丸酮的后期消解較為緩慢，隨著甲基睪丸酮濃度增大，在羅非魚魚苗體內殘留的時間延長。若無法確保激素在魚體內全部代謝完，則可能對人體造成危害，存在食品安全問題^[17]。與此同時，激素的使用也造成一些環境問題，影響水產品的安全性，造成陰陽魚和不育雌魚的產生及形態異常，內分泌紊亂，激素水平改變等負面影響。生產無公害羅非魚水產品，保障羅非魚養殖業可持續健康發展的首要條件就是解決羅非魚養殖的質量控制問題。使用環保安全的方法，生產綠色無公害的水產品有利于我國羅非魚養殖的良性發展。

培育超雄羅非魚是解決羅非魚全雄苗種生產問題的重要途徑之一。實驗證實尼羅羅非魚的偽雌魚(即遺傳雄性生理表型為雌性的個體)是可存活的，并且與正常的XX雌性一樣是可育的，可以用于全雄魚的生產。其中，高效誘導偽雌魚及其快速準確鑒定技術是全雄羅非魚生產的技術基礎。然而，由于魚類的性染色體構成處于原始狀態，所以在形態上難以區分Y和Z，X染色體。由于缺乏準確判斷羅非魚遺傳性別的手段，使用傳統的選擇育種獲取全雄魚存在育種周期長，費時費力的問題。高效誘導偽雌魚及其鑒定技術是需要解決的核心問題。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種尼羅羅非魚偽雌魚的高效誘導方法，該方法能夠將群體中遺傳雄性個體進行性逆轉，顯著增加群體中表型雌魚的比例；本發明還提供一種尼羅羅非魚偽雌魚微衛星分子標記鑒定方法，在將群體中遺傳雄性個體進行性逆轉為表型雌魚后，利用新開發的標記及其引物對群體基因型數據進行分析能夠快速準確鑒定表型雌魚群體中的偽雌魚。

一種尼羅羅非魚偽雌魚的高效誘導方法，其特征在于，在尼羅羅非魚孵化后開始進食時開始投喂含乙烯雌酚(DES)的開口飼料，連續投喂3周以上，然后再進行常規喂養。

優選，所述的含乙烯雌酚的開口飼料，其每1kg所述的含乙烯雌酚的開口飼料中含0.5g-1g乙烯雌酚。

進一步優選，所述的含乙烯雌酚的開口飼料，其每1kg所述的含乙烯雌酚的開口飼料中含1g乙烯雌酚。

所述的含乙烯雌酚的開口飼料的制備方法，將乙烯雌酚溶于足量無水乙醇后與小魚開口飼料充分攪拌混合，待小魚開口飼料充分吸收乙烯雌酚后，充分揮發無水乙醇，干燥，得到含乙烯雌酚的開口飼料。

乙烯雌酚在誘導羅非魚遺傳雄魚性逆轉為偽雌魚中的應用。

優選，所述的羅非魚為尼羅羅非魚。

一種尼羅羅非魚偽雌魚的微衛星分子標記引物，其特征在于，所述的微衛星分子標記引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。

一種尼羅羅非魚偽雌魚微衛星分子標記鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

提取待鑒定尼羅羅非魚的基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，利用上述尼羅羅非魚偽雌魚的微衛星分子標記引物的正向引物和反向引物進行PCR擴增，PCR擴增產物進行電泳然后分型，判斷是否為偽雌魚。

優選，所述的PCR擴增的反應體系為：2×PCR Mastermix 10μL，10μM正、反向引物各0.8μL，模板DNA 25ng，補充ddH₂O至總體積20μL；反應條件為：94℃預變性3min；變性94℃30sec、退火61.5℃30sec、延伸72℃15sec，循環數為34；72℃延伸10min。

本發明首先通過構建尼羅羅非魚家系，并利用含雌激素乙烯雌酚(DES)的開口飼料對家系部分個體(處理組)進行性逆轉處理，促使其中的遺傳雄性個體發育成生理雌性的偽雌魚。對照組則投喂未添加雌激素的飼料。通過與對照組表型數據進行比較發現，該方法成功的提高了處理組群體的表型雌性個體的比例(95％-100％；表1)。研究確定了羅非魚最佳DES性逆轉處理劑量(1g DES/kg飼料)及飼料配制方法。進一步基于已有研究所定位出的不同染色體(LG1,LG23)性別決定QTL區域，設計微衛星引物，通過群體QTL連鎖作圖，分析標記與表型關系，最終篩選出尼羅羅非魚育種家系中與性別性狀連鎖的LG23上的QTL區間及微衛星標記；進一步應用新開發的與性別緊密連鎖的微衛星分子標記tlp-23-sd的引物對激素處理后的群體進行分析，篩選鑒定發生性逆轉的偽雌魚39尾，為生產全雄魚奠定基礎。尼羅羅非魚微衛星分子標記tlp-23-sd的引物序列如SEQ ID NO.1(正向引物)和SEQ ID NO.2(反向引物)所示。

實現本發明的技術如下：

一.尼羅羅非魚偽雌魚雌激素高效誘導

挑選優質尼羅羅非魚親魚構建全同胞家系。將家系分組進行養殖管理(表1)，并利用雌激素乙烯雌酚(DES,0.5g或1g DES/kg開口飼料)對該家系2個處理組分別進行性逆轉處理。其中處理組在孵化后開始進食時即投喂添加雌激素DES的開口飼料，每日三次，連續投喂3周，促使其中的遺傳雄性個體發育成表型雌性的偽雌魚。實驗設置對照組1組投喂未添加雌激素DES的開口飼料。通過比較對照組(30％)和處理組(95％-100％)的雌性個體比例，證實雌激素(DES)能成功提高家系表型雌性個體的比例(表1)。研究確定投喂含1g DES/kg開口飼料能高效誘導遺傳雄性羅非魚性逆轉為生理雌性的偽雌魚。

二.尼羅羅非魚個體動物電子標簽標記及偽雌魚微衛星分子標記鑒定

待魚生長至性腺發育成熟(約5個月)后，通過人工分辨其外生殖器進行表型性別鑒定，并記錄性別和體重，剪取親本和子一代(對照組96尾雌性個體及96尾雄性個體以及DES處理1組中96尾雌性個體)的鰭條樣品保存于無水乙醇中，放入-70℃保存備用。同時，在每條魚背部注射動物電子標簽，記錄個體身份信息，用于進一步追蹤個體的生長及發育情況。

利用基因組DNA提取試劑盒提取所有取樣個體基因組DNA。基于已有研究所定位出的不同染色體(LG1,LG23)性別決定QTL區域基因組序列，設計5對微衛星引物，并從O.Eshel(2012)等的研究當中^[7]，選取9對位于性別決定區域內的微衛星分子標記對所有樣品DNA進行分析。通過3％PAGE膠電泳及銀染顯色對PCR產物進行基因分型。通過QTL作圖分析驗證和篩選性連鎖標記。統計學分析顯示在所分析的羅非魚群體中新開發的LG23微衛星標記tlp-23-sd等與羅非魚性別具有最強的連鎖關系(圖1)。非DES處理的對照組中，tlp-23-sd標記對于遺傳性別為雄性的羅非魚鑒定準確率達到90.6％。進一步使用驗證的性連鎖微衛星分子標記tlp-23-sd篩選鑒定處理組中標記和取樣的偽雌魚(PAGE電泳結果示意圖如圖2)。DES處理1組的96個雌性個體中有90個個體擴增出清晰條帶，經微衛星標記鑒定出39個遺傳性別為雄性、生理性別為雌性的偽雌魚。研究顯示使用雌激素處理的確使雄性尼羅羅非魚發生性逆轉，遺傳性別為雄性的尼羅羅非魚發育成偽雌魚。其中用于擴增微衛星分子標記tlp-23-sd的引物，其正向引物序列tlp-23-sd-F：5’-TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物序列tlp-23-sd-R：5’-GTCAGAATGCACTTTAACACAGAGATACCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本發明的優點和效果：

1.本研究通過比較分析確定1g DES/kg開口飼料是羅非魚高效的DES性逆轉處理劑量，這對于高效誘導羅非魚偽雌魚具有重要的意義。

2.由于羅非魚的性別分化受到許多因素影響，除了遺傳因素，在性別分化的過程中，環境中的多種因素如溫度、環境激素等也可能使其發生性逆轉，從而可能導致羅非魚的遺傳性別與生理性別不一致，導致某些個體的基因型和表現型相悖。通過應用尼羅羅非魚性別決定區緊密連鎖的微衛星分子標記tlp-23-sd及其引物開展偽雌魚的篩選，能縮短育種的周期，提高選育的準確性。

附圖說明

圖1是所用微衛星分子標記tlp-23-sd在LG23號連鎖群上的相對位置及其LOD值。

圖2是微衛星分子標記tlp-23-sd的引物篩選鑒定XY偽雌魚示意圖；Marker：100bp DNA ladder；Pf：雌性親本；Pm：雄性親本；Of：家系當中的雌性表型個體；Om：家系當中的雄性表型個體；箭頭所示為偽雌魚個體及雄性特異條帶。

具體實施方式

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范疇。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1：雌激素乙烯雌酚(DES)開口飼料的配制方法

首先將雌激素乙烯雌酚(DES)按實驗要求量(0.5g或1g)溶解入500mL無水乙醇，然后將含有DES的無水乙醇與1kg小魚開口飼料進行充分攪拌。4度冰箱過夜，讓小魚開口飼料充分吸收DES。將添加DES的小魚開口飼料置入通風櫥，讓無水乙醇充分揮發。干燥，由此制備得到0.5g/kg、1g/kg的含DES的開口飼料，然后用塑料袋密封，低溫保存備用。

實施例2：家系構建與雌激素處理

2015年6月份在廣州市五龍崗水產發展有限公司挑選優質尼羅羅非魚親魚(遺傳雄性親本和遺傳雌性親本)1對成功構建了1個全同胞家系(共1356尾)。實驗魚在廣州市五龍崗水產發展有限公司進行養殖及實驗處理。

將該家系不分性別隨機分成3組(2個處理組及1個對照組)進行養殖管理(表1)。其中2個處理組在孵化后開始進食時投喂含DES的開口飼料，連續投喂3周，促使其中的遺傳雄性個體發育成偽雌魚。對照組則投喂未添加雌激素的小魚開口飼料。

表1尼羅羅非魚全同胞家系DES處理表型性別統計

待尼羅羅非魚生長至5個月性腺發育成熟后，通過人工分辨其外生殖器進行表型性別鑒定并記錄性別(表1)和體重，剪取親本和子一代的鰭條樣品保存于無水乙醇中，放入-70℃保存備用。同時，基于體重及性別性狀，在處理1組中挑選出96條雌魚作為育種群體，為每條魚注射電子標簽，記錄個體身份信息用于育種。數據分析顯示實驗成功的提高了處理組中的表型雌性個體的比例(95％-100％；表1)。研究確定投喂1g/kg的含DES的開口飼料能高效誘導遺傳雄性魚性逆轉為生理雌性的偽雌魚。

實施例3：基因組DNA來源與制備及標記篩選

1.親代及子代基因組DNA樣品提取

本實驗用于偽雌魚性別連鎖分子標記的鑒定的樣品有：實施例2中的雌性和雄性親本、對照組96尾雌性(表型)個體及96尾雄性(表型)個體、處理1組96尾雌性(表型)個體。

2.DNA提取方法

(1)親本DNA

使用東盛基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，提取的DNA稀釋5倍后放入-20℃保存備用。

(2)子一代DNA

a.取一1.5mL的96孔板，置于冰上，每孔加入300μL的STE buffer(10mM Tris pH8.0，50mM EDTA pH 8.0，200mM NaCl，0.5％SDS)，50μL蛋白酶K(20mg/mL)；

b.用滅過菌的剪刀剪下3*3mm²大小的魚鰭樣品，放在濾紙上，按壓吸干樣品上殘留的無水乙醇，放入裂解液中；

c.簡單離心后放入搖床中，將溫度設置為55℃，轉速70-100r/min，裂解3hr；

d.取硅膠柱(96孔)，下面用96孔板承接濾液，每孔加入240μL 6M NaI，再加入80μL的裂解液，2000g離心1min，倒去濾液；

e.每孔加入240μL的wash buffer(10mM Tris pH7.5，1mM EDTA pH7.5，100mM NaCl，50％乙醇)，2000g離心3min后，靜置干燥2-5min；

f.每孔加入120μL的純水，在室溫下靜置2min后，2000g離心2min得到DNA樣品；

g.1％瓊脂糖凝膠電泳，120v電泳30min，凝膠成像系統拍照。提取的DNA稀釋5倍后放入-20℃保存備用。

3.標記篩選

基于已有研究所定位出的不同染色體(LG1，LG23)性別決定QTL區域基因組序列，設計5對微衛星引物，并從O.Eshel(2012)等的研究當中^[7]，選取9對位于性別決定區域內的微衛星分子標記對所有樣品DNA進行分析。標記引物均由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

4.PCR反應

反應體系為：2×PCR Mastermix 10μL，10μM正、反向引物各0.8μL，模板DNA 25ng，補充ddH₂O至總體積20μL。反應條件為：94℃預變性3min；變性94℃30sec、退火61.5℃30sec、延伸72℃15sec，循環數為34；72℃延伸10min。取擴增產物3μL進行凝膠電泳檢測，拍照。

5.聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測

1)制膠

取純水25mL，5×TBE 4mL，Acr-bis(30％)10.7mL，TEMED 26μL，APS(10％)280μL，用玻璃棒充分攪拌均勻，將配置好的凝膠注入組裝好的兩玻璃板之間，輕輕插入梳子，靜置1-2小時，待其凝固。

2)電泳

待膠凝固后，將膠連同玻璃板一起取下，安置在電泳槽中；依次序進行點樣，每孔3μL；蓋好上蓋，將電壓調到200V，電泳10分鐘后，將電壓調到600v，繼續電泳1.5小時。

3)銀染

電泳結束后，排出緩沖液，從電泳槽中取下玻璃板，用薄板輕輕撬開兩塊玻璃板，將凝膠放入裝有純水的盤中，使凝膠與玻璃板脫離；倒掉純水，加入500mL的染色液(1％AgNO₃)，染色約5分鐘后將膠轉移到裝有純水的盤中，漂洗5-10秒，倒掉純水，加入顯色液(20g NaOH+0.5g Na₂CO₃+4mL甲醛溶液(37％)加入1L純水中，使用前置入冰中預冷)，顯色約10-15min，至條帶開始呈現，倒掉顯色液，加入純水浸泡5min，觀察條帶并拍照。

6.遺傳圖的制作和基因定位

用表格記錄每個個體的基因型，使用軟件Joinmap 4和MapQTL 6對遺傳圖譜數據和表型數據分析，計算每個標記的LOD值，獲得顯著性相關的微衛星標記，鑒定尼羅羅非魚性別性狀緊密連鎖的分子標記(如圖1所示)。使用Joinmap 4和MapQTL 6對對照組中96個雄性(表型)個體和96個雌性(表型)個體的基因型數據進行連鎖作圖，結果顯示標記tlp-23-sd的LOD最高，為19.79。LOD值的大小用于判定連鎖關系，本研究當中的LOD值表示微衛星標記與尼羅羅非魚性別的連鎖關系。該微衛星分子標記tlp-23-sd的序列如下所示：TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACATGGTAGCAAAAAAACGTGTGATTACGACCCCC(CA)nCGCACACACCCACTGTGTTACATCATTTCAGCCACTTTATACTTGTTCCCATGGTACGGATGGAAATAACCTTGCTGAAGCAGAAGCTGGTATCTCTGTGTTAAAGTGCATTCTGAC，其含有(CA)n微衛星序列重復。在雌雄個體間存在CA堿基重復次數的差異從而區別不同性別的個體。通過該標記對實驗群體雄性親本DNA進行PCR擴增，PAGE電泳銀染后有兩條雄性特異帶，其分別代表雄性親本該基因標記的2個等位基因(分子量大小分別為197及213bp；如圖2所示)。對照組中，該微衛星分子標記tlp-23-sd對于遺傳性別為雄性的尼羅羅非魚鑒定的準確率達到90.6％，即對照組雄性(表型)個體中有90.6％的個體能擴增出相應的雄性特異帶，而對照組雌性(表型)個體的基因組DNA經擴增后無雄性特異帶。準確率無法到達100％的原因可能是由于羅非魚的性別受到許多因素影響。除了遺傳因素，在性別分化的過程中，環境中的多種因素如溫度、環境激素等也可能使其發生性逆轉，導致某些個體的基因型和表現型相悖。通過微衛星分子標記tlp-23-sd可以快速準確的鑒定和區分不同遺傳成分的個體，其中用于擴增微衛星分子標記tlp-23-sd的引物，其正向引物序列tlp-23-sd-F：5’-TCCCATTTAGACCACCACACCTCAACAACA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物序列tlp-23-sd-R：5’-GTCAGAATGCACTTTAACACAGAGATACCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

實施例4：偽雌魚分子標記篩選

進一步使用驗證的性連鎖微衛星分子標記tlp-23-sd的引物(如SEQ ID NO.1和2所示)對實施例2中處理1組的96個雌性(表型)個體的基因組DNA進行了PCR擴增、PAGE膠電泳、銀染顯色及基因型分析。結果表明，處理1組的96個雌性(表型)個體中有90個個體擴增出清晰條帶，利用微衛星分子標記tlp-23-sd的引物鑒定出39個遺傳性別為雄性、但生理性別為雌性的偽雌魚(圖2)，其都擴增出雄性特異帶。