一種水稻MSP1基因突變體及其分子鑒定方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻MSP1基因突變體msp1-1972及其分子鑒定方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物雄性不育突變是自然界中十分普遍的現(xiàn)象，至少己在43個(gè)科、162個(gè)屬的617個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育突變體。在遺傳上植物雄性不育分為細(xì)胞核雄性不育，細(xì)胞質(zhì)雄性不育和細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)互作雄性不育三大類(lèi)：1)細(xì)胞核雄性不育由細(xì)胞核基因突變產(chǎn)生，有顯性突變和隱性突變，有孢子體基因突變和配子體基因突變。顯性突變和配子體基因突變只能通過(guò)雌配子遺傳，隱性突變既可通過(guò)雌配子也可通過(guò)雄配子進(jìn)行遺傳，而且遵循孟德?tīng)柖伞Ｄ壳耙芽寺×艘恍╂咦芋w隱性核不育基因，如擬南芥的ms2，玉米的ms45和水稻的mil1等(Aarts等，1997，TheArabidopsisMALESTERILITY2proteinsharessimilaritywithreductasesinelongation/condensationcomplexes，PlantJournal，12:615-623；Albertsen，2006，Maletissue-preferredregulatorysequencesofMS45geneandmethodofusingsame，專(zhuān)利號(hào)：US7154024B2；Hong等，2012，Somaticandreproductivecelldevelopmentinriceantherisregulatedbyaputativeglutaredoxin，PlantCell，24:577-588)；一些配子體隱性核不育基因也被克隆，如擬南芥的兩個(gè)小孢子有絲分裂異常的突變體sidecarpollen和geminipollen(Oh等，2010，TheSIDECARPOLLENgeneencodesamicrospore-specificLOB/AS2domainproteinrequiredforthecorrecttimingandorientationofasymmetriccelldivision，PlantJournal，64:839-50；Park等，1998，TheArabidopsisthalianagametophyticmutationgeminipollen1disruptsmicrosporepolarity,divisionasymmetryandpollencellfate，Development，125:3789-99)；玉米上還克隆了一個(gè)孢子體顯性核不育基因MS44(CiganandAlbertsen，1998，Reversiblenucleargeneticsystemformalesterilityintransgenicplants，US5750868)；2)細(xì)胞質(zhì)雄性不育則是由細(xì)胞質(zhì)基因控制，并沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的核恢復(fù)基因，屬母性遺傳；3)細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)互作雄性不育由細(xì)胞質(zhì)基因和細(xì)胞核基因共同控制，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核遺傳物質(zhì)不和的結(jié)果。不育細(xì)胞質(zhì)是一些由突變線粒體基因引起，但有相對(duì)應(yīng)的核恢復(fù)基因，能抑制不育細(xì)胞質(zhì)基因。不育細(xì)胞質(zhì)基因可產(chǎn)生一種新的蛋白質(zhì)，夠影響線粒體正常功能(ChenandLiu，2014，Malesterilityandfertilityrestorationincrops，AnnuRevPlantBiol，65:5.1-5.28)。在育恢復(fù)基因方面，目前水稻中已經(jīng)克隆了Rf-1，Rf-2，Rf-4，Rf-5等基因(Komori等，2004，Map-basedcloningofafertilityrestorergene,Rf-1,inrice(OryzasativaL.)，PlantJournal，37:315-325；Itabashi等，2011，Thefertilityrestorergene,Rf2,forLeadRice-typecytoplasmicmalesterilityofriceencodesamitochondrialglycine-richprotein，PlantJournal，65:359-367；Tang等，2014，ThericerestorerRf4forwild-abortivecytoplasmicmalesterilityencodesaPPRproteinthatfunctionsinreductionofWA352transcripts，MolecularPlant，7:1497-500；Hu等，2012，ThericepentatricopeptiderepeatproteinRF5restorersfertilityinHong-LianCytoplasmicmale-sterilelinesviaacomplexwiththeglycine-richproteinGRP162，PlantCell，24:109-22)。水稻是我國(guó)的民族產(chǎn)業(yè)，雜交水稻對(duì)提高我國(guó)糧食產(chǎn)量發(fā)揮了重要作用。目前，我國(guó)雜交水稻累計(jì)種植面積超過(guò)45億畝，雜交水稻種植面積已經(jīng)占到全國(guó)水稻種植面積的55％左右。雜種水稻是選用兩個(gè)遺傳背景不同，同時(shí)性狀又能互補(bǔ)的水稻品種，通過(guò)雜交產(chǎn)生具有雜種優(yōu)勢(shì)的第一代雜交種用于生產(chǎn)。雜交水稻具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)旺盛，根系發(fā)達(dá)，穗大粒多，抗逆性強(qiáng)等方面。雜交水稻比常規(guī)稻增產(chǎn)達(dá)30％。目前我國(guó)種植的雜交水稻可分為三系法雜交稻和兩系法雜交稻。三系法雜交稻(三系雜交稻)就是生產(chǎn)這種雜交稻需要三個(gè)水稻品系來(lái)完成：水稻質(zhì)核互作雄性不育系、水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系和水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系。水稻質(zhì)核互作雄性不育系(簡(jiǎn)稱(chēng)不育系，代號(hào)A)有野敗型，紅蓮型等多種細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型。水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系(簡(jiǎn)稱(chēng)保持系，代號(hào)B)是用來(lái)繁殖不育系一種水稻。其細(xì)胞核基因型與不育系相同，但含有可育細(xì)胞質(zhì)基因，可產(chǎn)生可育花粉，能夠自交結(jié)實(shí)。由于保持系的核基因不含恢復(fù)基因，因此它給不育系授粉產(chǎn)生的后代也是不育的。水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系(簡(jiǎn)稱(chēng)恢復(fù)系，代號(hào)R)攜帶恢復(fù)基因，能夠修復(fù)細(xì)胞質(zhì)雄性不育性，與不育系雜交產(chǎn)生的雜種(即雜交稻)正?？捎Ｈ涤N法存在感病、品質(zhì)差、育種效率低等問(wèn)題。因受恢保關(guān)系的制約，95％的水稻資源不能用于雜交育種。兩系法雜交稻利用光溫敏核不育突變體，其在長(zhǎng)日高溫條件下表現(xiàn)雄性不育，可進(jìn)行雜交制種，短日低溫條件下表現(xiàn)雄性可育，可以自交繁殖。與三系法相比，兩系法具有顯著的優(yōu)越性：不育系與恢復(fù)系配組自由，選配優(yōu)良組合幾率大；不育系可一系兩用。但是兩系法不育系易受光溫環(huán)境影響，育種風(fēng)險(xiǎn)巨大。比如在制種期間遇上低溫，不育系將轉(zhuǎn)為可育，產(chǎn)生自交種子，影響雜交種子的純度；有的兩系雜交種遇上高溫則不育，影響結(jié)實(shí)率，導(dǎo)致減產(chǎn)。因此，尋找新的雄性不育制種方法依然是作物育種上的重要研究課題。利用人工誘變比如物理輻射，化學(xué)處理，組織培養(yǎng)等方法，人們?cè)谒旧汐@得了多種新的不育突變體。msp1-1突變體是其中之一，其花藥不產(chǎn)生成熟花粉粒。該突變體由MSP1基因中插入Tos17引起；MSP1基因有1個(gè)外顯子，編碼一個(gè)1294個(gè)氨基酸的富亮氨酸膜受體樣蛋白激酶；在減數(shù)分裂形成小孢子前后，在絨粘層和小孢子特異性表達(dá)，作為信號(hào)識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，參與絨氈層的形成并影響大孢子母細(xì)胞的數(shù)目；MSP1的突變，引起絨氈層缺失，影響早期小孢子母細(xì)胞的發(fā)育；小孢子母細(xì)胞數(shù)目增多，花藥壁不正常形成，導(dǎo)致完全雄性不育。(Nonomura,2003，TheMSP1GeneIsNecessarytoRestricttheNumberofCellsEnteringintoMaleandFemaleSporogenesisandtoInitiateAntherWallFormationinRice.ThePlantCell,15:1728-39)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種水稻MSP1基因突變體msp1-1972及其分子鑒定方法和應(yīng)用。本發(fā)明首先對(duì)秈稻品種93-11種子(M0代)進(jìn)行鈷60輻射誘變處理，種植處理的種子獲M1代植株；M1代植株自交產(chǎn)生種子(為M2代)，種植M2代植株，對(duì)M2代植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，組織學(xué)和遺傳學(xué)鑒定，篩選不育植株；然后對(duì)不育植株進(jìn)行基因測(cè)序和DNA序列分析，在分子水平上進(jìn)行驗(yàn)證。最后獲得純合不育單株，并用于雜交育種和生物技術(shù)研究。本發(fā)明提供的水稻MSP1基因突變體msp1-1972，其為水稻MSP1基因編碼區(qū)第1879位堿基T替換為堿基C，使第627個(gè)氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)變成脯氨酸，導(dǎo)致水稻雄性不育表型。進(jìn)一步地，水稻MSP1基因突變體msp1-1972，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。本發(fā)明提供了含有本發(fā)明所述水稻MSP1基因突變體msp1-1972的表達(dá)載體。本發(fā)明提供了含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了水稻MSP1基因突變體msp1-1972在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了水稻MSP1基因突變體msp1-1972在制備隱性雄性核不育的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了水稻MSP1基因突變體msp1-1972在水稻改良育種、制種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了檢測(cè)水稻MSP1基因突變體msp1-1972的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記是由以下引物對(duì)擴(kuò)增和HaeIII酶切組合得到，所述引物對(duì)的核苷酸序列為：上游引物1972_F：ATTTTGTCTTCCAACCAGCGG(如SEQIDNO.2所示)下游引物1972_R：ACCATCACCATTGCACAGT(如SEQIDNO.3所示)。本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在制備隱性雄性核不育的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。一種水稻MSP1基因突變體msp1-1972的分子標(biāo)記的方法，通過(guò)下述引物對(duì)擴(kuò)增待檢植物基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在37℃下用HaeIII酶切，并檢測(cè)酶切產(chǎn)物：所述引物對(duì)的核苷酸序列為：上游引物1972_F：ATTTTGTCTTCCAACCAGCGG(如SEQIDNO.2所示)下游引物1972_R：ACCATCACCATTGCACAGT(如SEQIDNO.3所示)；上述引物對(duì)樣品DNA擴(kuò)增的產(chǎn)物在HaeIII酶切后，如果比野生型93-11擴(kuò)增后酶切產(chǎn)物片段短20bp，則該樣品中存在突變基因msp1-1972。本發(fā)明提供的突變體msp1-1972優(yōu)點(diǎn)如下：1)該突變體來(lái)源于秈稻骨干親本品種93-11。該品種已完成了全基因組測(cè)序，對(duì)水稻分子育種十分有利。2)文獻(xiàn)“Nonomura,2003，TheMSP1GeneIsNecessarytoRestricttheNumberofCellsEnteringintoMaleandFemaleSporogenesisandtoInitiateAntherWallFormationinRice.ThePlantCell,vol.15:1728-39”中的突變體是轉(zhuǎn)座子Tos17插入突變，難以研究蛋白序列與功能之間的關(guān)系。而本發(fā)明的突變發(fā)生在一個(gè)MSP1基因的第1個(gè)外顯子中1個(gè)T堿基替換為1個(gè)C堿基，使這一基因的第627個(gè)氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)變成脯氨酸，導(dǎo)致其所編碼蛋白功能改變，表現(xiàn)完全雄性不育，表明這一突變位點(diǎn)為該蛋白功能的關(guān)鍵位點(diǎn)之一，對(duì)于研究蛋白結(jié)構(gòu)與功能有重要價(jià)值。3)因輻射誘變?cè)斐蓡螇A基替換，通過(guò)引物設(shè)計(jì)在突變位點(diǎn)添加酶切位點(diǎn)，在PCR和酶切組合下，采用實(shí)驗(yàn)室常用的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳就能開(kāi)展分子檢測(cè)，也適用于各種高通量長(zhǎng)度片段檢測(cè)技術(shù)。該突變位點(diǎn)本身是一個(gè)SNP，因此也適用于熒光探針雜交(如TaqMan)、高分辨溶解曲線法、基因芯片、單堿基測(cè)序和質(zhì)譜法等常規(guī)或高通量SNP檢測(cè)技術(shù)用于突變位點(diǎn)基因型鑒定。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例2中野生型93-11和1972突變體的株型與穗型照片。圖2是實(shí)施例3中野生型93-11與1972突變體花藥的體式顯微鏡照片，與花粉碘染的顯微鏡照片。圖3是實(shí)施例6中1972突變體MSP1基因的突變位點(diǎn)及氨基酸殘基改變示意圖。圖4是實(shí)施例7中野生型93-11、“1972×93-11”F2群體中可育株和不育株MSP1基因突變位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物在HaeIII酶切后的電泳照片。圖5是實(shí)施例8的雜交轉(zhuǎn)育的技術(shù)路線圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1鈷60輻射誘變突變體庫(kù)的構(gòu)建選用秈稻骨干親本品種93-11作為輻射處理的材料，該品種已完成了全基因組測(cè)序，對(duì)水稻分子育種十分有利。2013年夏，于長(zhǎng)沙鈷60(60Co)輻射93-11種子(M0代)10公斤，7月種植于海南臨高田間，分單株收獲M1代種子，共收獲約6500份種子。選取M1代種子3200個(gè)株系，每個(gè)株系種植50棵單株。2014年春季，種植于海南臨高田間。移栽后，在分蘗期、孕穗期、抽穗期、開(kāi)花期、灌漿期等經(jīng)過(guò)仔細(xì)觀察田間性狀，篩查株型、穗型、育性、產(chǎn)量等各種類(lèi)型突變體，對(duì)各類(lèi)型突變體單株收種保存作為特殊突變體。每個(gè)株系收6個(gè)單株，作為突變體庫(kù)資源保存。實(shí)施例2M2代種植與性狀觀察在M2代抽穗、開(kāi)花期間，在田間對(duì)花藥的形態(tài)進(jìn)行觀察，選取顏色淺白、形態(tài)小、花粉量小等表現(xiàn)異常的花藥在顯微鏡下進(jìn)行進(jìn)一步鏡檢。在編號(hào)為1972的家系中發(fā)現(xiàn)1株育性異常的植株，該突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、抽穗期、穗型均與野生型沒(méi)有明顯區(qū)別，圖1為該突變體植株與野生型植株的株型(圖1左圖)和穗型(圖1右圖)對(duì)比照片，但花藥比野生型小，顏色淺黃，結(jié)實(shí)率很低，被選作候選突變體材料進(jìn)行下一步研究。實(shí)施例3花粉鏡檢，自交和異交通過(guò)數(shù)碘染著色與不著色花粉比例，統(tǒng)計(jì)花粉育性。在體式顯微鏡下觀察1972突變體小花形態(tài)，發(fā)現(xiàn)雌蕊與野生型無(wú)明顯區(qū)別，花藥比野生型小，顏色較淺(圖2左圖)。田間采集開(kāi)花期小花，用鑷子取出花藥，在碘-碘化鉀溶液(0.6％KI，0.3％I2，w/w)中輕輕擠壓花藥，滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察花粉碘染情況并拍照(圖2右圖)。野生型花粉多而染成藍(lán)黑色，而突變體則看不到花粉粒。同一家系野生型植株套袋自交后正常結(jié)實(shí)，而1972突變體不結(jié)實(shí)。以水稻品種93-11和中花11為父本給1972突變體授粉，均可結(jié)實(shí)得到F1代種子。表明該突變體為雄性不育突變體。對(duì)F1代自交得到F2代種子，種植F2代植株710株，將花藥碘染后在顯微鏡下觀察，其中524株花粉正常碘染，且正常自交結(jié)實(shí)，186株無(wú)花粉，自交不結(jié)實(shí)，符合3:1分離，表明該不育性狀由單個(gè)隱性基因控制。實(shí)施例4葉片采樣與DNA提取本項(xiàng)研究采用CTAB法提取水稻葉片DNA，具體方法如下：稱(chēng)取約0.1g葉片，放入離心管，加入600μLCTAB提取緩沖液，5μLRNaseA，震蕩分散，65℃水浴0.5hr，其間輕搖2-3次；加入等體積氯仿/Tris-飽和酚(1:1，v/v)，混勻，輕搖10min；4℃10000rpm離心20min；轉(zhuǎn)移上清至新管，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH值5.2)、0.6-1倍體積的冷異丙醇；輕搖混勻，至絮狀沉淀出現(xiàn)；4℃10000rpm離心10min；棄去上清，用體積百分含量70％乙醇洗沉淀2次；風(fēng)干，加入50μL1×TE溶解沉淀，-20℃保存。用Nanodrop2000檢測(cè)DNA濃度，稀釋至10ng/L用作PCR模板。實(shí)施例5PCR反應(yīng)與產(chǎn)物回收用水稻MSP1基因的特異引物擴(kuò)增93-11野生型和實(shí)施例2篩選到的編號(hào)為1972的突變體DNA。以水稻品種日本晴MSP1基因?yàn)閰⒖夹蛄?，設(shè)計(jì)了5對(duì)引物用于擴(kuò)增MSP1片段，然后拼接出野生型和1972突變體MSP1全長(zhǎng)序列。所用5對(duì)引物的序列見(jiàn)表1，：表1用于擴(kuò)增MSP1的引物對(duì)序列引物對(duì)名稱(chēng)正向引物反向引物MSP1_1GCTACTGACATGGTTAACCTCTTCCATTTCCTTCAGCATCTTCAGMSP1_2TCTGACTTCGGCCTTGCGATCAAGCAGAGAGCATTACATGMSP1_3CAAGCAGCAACCATTTCTCAGCAAGGCCGAAGTCAGAMSP1_4CATTTAAAGGGTGCACGAACTGAGAAATGGTTGCTGCTTGMSP1_5CTGAAGATGCTGAAGGAAATGGTTCGTGCACCCTTTAAATGPCR反應(yīng)體系為：1μL10×反應(yīng)緩沖液，0.25μLdNTP，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5UTaq酶，1μL10ng/μL模板DNA，加超純水將總體積補(bǔ)至10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4-98℃變性1-3min，然后執(zhí)行以下循環(huán)：95℃變性20s，53-58℃復(fù)性20s，72℃延伸30s，30-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72℃補(bǔ)充延伸3-10min，結(jié)束反應(yīng)。配置1.5％瓊脂糖凝膠，在5V/cm電場(chǎng)下電泳30min；采用市面DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。實(shí)施例6DNA序列分析將回收所得野生型與突變體的PCR產(chǎn)物DNA采用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物分別使用正向引物與反向引物。使用常見(jiàn)DNA序列分析軟件DNAman6.0對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接；將1972突變體的MSP1等位基因記為msp1-1972。對(duì)野生型和突變體序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在MSP1基因的基因組序列第1879個(gè)堿基T替換為1個(gè)堿基C；蛋白序列分析比對(duì)顯示，該突變引起了第627個(gè)氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?。?shí)施例7突變位點(diǎn)分子標(biāo)記設(shè)計(jì)與基因型-表型共分離鑒定根據(jù)實(shí)施例6中得到的突變位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)基因特異引物：正向引物1972_F，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；反向引物1972_R，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。其中1972_F的3’端第二個(gè)堿基由基因原來(lái)的堿基T修改為G，在1972突變體的擴(kuò)增產(chǎn)物中形成一個(gè)HaeIII酶切位點(diǎn)，而對(duì)野生型的擴(kuò)增產(chǎn)物則沒(méi)有。因此可通過(guò)該引物對(duì)擴(kuò)增后，用HaeIII酶切，突變體1972的片段會(huì)比野生型短20個(gè)堿基對(duì)。在實(shí)施例5中所述PCR反應(yīng)條件下，用上述引物對(duì)對(duì)93-11以及1972×93-11的F2群體的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用HaeIII酶切，酶切方法如下：按照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，去核酸酶水18μL，10×Buffer2μL，HaeIII1-2μL，混合各反應(yīng)物，微離心幾秒鐘，在37℃下孵育1-2小時(shí)，最后在80℃下20分鐘以終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳方法如下：(1)聚丙烯酰胺膠的配制：6％PA膠80mL，10％過(guò)硫酸胺250μL(冬天)/125μL(夏天)，四甲基乙二胺(TEMED)80μL。搖勻后灌膠。用洗滌劑把玻璃板反復(fù)擦洗干凈，用酒精擦凈、晾干。在通風(fēng)櫥中將凹板涂上2％的RepelSilane后，再用酒精擦凈、干燥，將另一塊平板涂上0.5％的BingdingSilane1.5mL(在1.5ml離心管中加入7.5μLBindingSilane和7.5μL冰醋酸，補(bǔ)足95％乙醇至1.5mL)。操作過(guò)程中，防止兩塊玻璃板相互污染，徹底干燥后再進(jìn)行玻璃板組裝、灌膠。(2)預(yù)電泳：待膠凝固后，取出梳子，洗掉上邊凝膠尤其注意接縫處定要洗凈。先在電泳槽下槽(陰極)裝入1×TBE的電極緩沖液，將聚合的凝膠板裝在電泳槽內(nèi)，在上槽中注入0.5×TBE的電極緩沖液。恒定功率40W-65W，預(yù)電泳約30min。用吸管清除膠面上沉淀的尿素和氣泡，插入梳子。(3)電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5μl5×LoadingBuffer混合后95℃變性5分鐘，立刻轉(zhuǎn)移到冰上冷卻，吸取1.5-3μl加入上樣孔；恒定功率40W-65W進(jìn)行電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)電泳槽底部結(jié)束。視SSR擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小及差異帶型的可辨程度調(diào)整電泳時(shí)間。(4)銀染顯色，將帶膠的一塊玻璃板放入10％的冰乙酸固定液中，65r/min振蕩約30min，直至二甲苯腈全部脫色；蒸餾水沖洗2次，每次5min；將沖洗后的膠板放入新配制的染色液(2L水中加入2g硝酸銀、3mL37％甲醛)中65r/min搖動(dòng)30min；將染色后的膠板放入蒸餾水沖洗5s，立即拿出進(jìn)行顯影；將膠板快速轉(zhuǎn)移到4℃預(yù)冷的顯影液(2L水中加入30g氫氧化鈉，10ml37％甲醛)輕輕搖動(dòng)至帶紋出現(xiàn)；將膠板置于10％的冰乙酸固定液中至無(wú)氣泡產(chǎn)生為止；用蒸餾水沖洗2次，每次2min；室溫下自然干燥后，拍照保存圖像。電泳結(jié)果見(jiàn)圖4，擴(kuò)增產(chǎn)物有長(zhǎng)、短兩種片段，組成3種帶型：親本野生型93-11的擴(kuò)增-酶切帶型為較大的單一片段，F(xiàn)2中表型為野生型的個(gè)體帶型為單一大片段或大、小雜合型；突變體擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶型全部為單一短片段。這一結(jié)果一方面驗(yàn)證了實(shí)施例6中的突變位點(diǎn)，同時(shí)表明該突變位點(diǎn)與不育表型是共分離的。這一結(jié)果結(jié)合該突變體的突變表型和已發(fā)表文獻(xiàn)中的表型描述，可推斷1972突變體的雄性不育表型是由實(shí)施例6中所述的突變?cè)斐傻?。?shí)施例8：突變基因的雜交轉(zhuǎn)育可按圖5的步驟將1972突變體的不育等位基因msp1-1972通過(guò)雜交轉(zhuǎn)育到其它水稻遺傳背景中：①雜交：以1972為母本，與受體水稻材料為父本雜交獲得F1種子；②第一輪回交：F1播種后獲得F1植株，將F1植株與輪回親本進(jìn)行雜交，獲得BC1種子；③BC1不育基因選擇(前景選擇)：播種BC1種子，獲得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各單株葉片，以實(shí)施例4中所述方法提取DNA，以實(shí)施例7中所列的引物對(duì)(1972_F和1972_R)進(jìn)行擴(kuò)增、HaeIII酶切和電泳，選取基因型為雜合的單株繼續(xù)種植，棄去純合野生型的單株；④BC1背景選擇：采用一組(例如100個(gè)，或200個(gè)等)在1972和輪回親本之間存在多態(tài)的，且在基因組上均勻分布的分子標(biāo)記(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等類(lèi)型標(biāo)記)，對(duì)步驟③中選出的單株進(jìn)行鑒定，選取與輪回親本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中選率等)的材料；⑤第二輪回交：用步驟④中選出的單株為父本，為輪回親本授粉，獲得BC2種子；⑥BC2的前景與背景選擇：對(duì)選出的材料重復(fù)步驟③至步驟④的操作，選出與輪回親本相似度高于選擇標(biāo)準(zhǔn)(如相似度大于98％，或2％中選率等)的BC2代植株；⑦自交獲得BC2F2種子：對(duì)步驟⑥中選出的BC2植株進(jìn)行自交，獲得BC2F2種子；⑧BC2F2的前景選擇：將步驟⑦中獲得的BC2F2種子播種，獲得500株以上幼苗，在幼苗期采集葉片，以實(shí)施例4中所述方法提取DNA，以實(shí)施例7中所列的引物對(duì)(1972_F和1972_R)進(jìn)行擴(kuò)增、酶切和電泳，選出帶型為純合突變體和雜合型的單株繼續(xù)栽培，丟棄純合野生型的單株；⑨BC2F2的背景選擇及應(yīng)用：將步驟⑧中選出的單株按照步驟④的方法進(jìn)行背景篩選，選出100％背景純合的單株。如果中選單株的1972_F/1972_R引物對(duì)擴(kuò)增后酶切帶型為純合突變體，則該單株為最終目標(biāo)材料，可進(jìn)一步與輪回親本雜交保存材料，或與其它水稻材料進(jìn)行雜交。如果中選單株是雜合帶型，可直接用于保存種質(zhì)，或通過(guò)自交獲得不育株用于雜交育種或制種。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3