一種灰略紅鏈霉菌果膠酯酶及其編碼基因和應用的制作方法

本發明涉及基因工程和現代酶工程技術領域，涉及一種灰略紅鏈霉菌果膠酯酶及其編碼基因和應用，具體涉及一種果膠酯酶及其編碼基因序列、含有該編碼基因序列的重組表達載體和轉基因重組菌以及該果膠酯酶的應用。

背景技術：

果膠酶是廣泛存在于果實及多種微生物中，是一類可以作用于果膠質的一類由許多單酶組成的復合酶的總稱。果膠酶在苧麻脫膠、木材防腐和酒精發酵等領域具有主要的應用意義，目前已廣泛應用于食品行業。

果膠酯酶(EC 3.1.1.11)是一種能催化、水解果膠生產果膠酸和甲醇的酶。果膠酶對聚半乳糖醛酸甲酯具有高度的專一性，無法催化聚甘露糖醛酸甲酯，但是能夠水解聚半乳糖醛酸乙酯、丙酯和烯丙酯，但是水解速度較甲酯低。果膠酯酶能夠從果膠分子的還原性末端或其臨近的游離羧基開始進攻去甲氧基，沿著分子以單鏈機制進行，形成對二價陽離子非常敏感的游離態半乳糖醛酸區域。目前，果膠酯酶在食品行業中應用較多，常用于制備低甲氧基果膠及果汁澄清加工。因此，果膠酯酶有著廣泛的用途和開發前景，目前新型果膠酯酶的開發和制備已經成為研究的熱點。

果膠酯酶來源廣泛，細菌、真菌和放線菌都能產生果膠酯酶，但是能產生果膠酯酶并成功應用于工業生產的實例卻還很少。研究表明，鏈霉菌是合成果膠酯酶的理想菌株。本發明針對克隆自灰略紅鏈霉菌的新型果膠酯酶，經密碼子優化后對其進行原核表達分析及初步酶學性質分析，為該果膠酯酶的異源重組表達及生產利用提供了有效的途徑。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種灰略紅鏈霉菌果膠酯酶。

本發明的另一目的在于提供一種果膠酯酶的編碼基因。

本發明的另一目的在于提供一種含有上述的果膠酯酶編碼基因的重組表達載體或轉基因重組菌。

本發明的另一目的在于提供一種上述的果膠酯酶編碼基因在表達果膠酯酶中的應用。

本發明的另一目的在于提供一種上述的果膠酯酶在水解果膠中的應用。

本發明的目的是通過以下技術方案實現：

一種灰略紅鏈霉菌果膠酯酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO.3。

本發明提供的果膠酯酶及其編碼基因克隆自灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名為JSD-1，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號,保藏日期：2012.01.09，保藏編號為CGMCC No.5706，具有下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

(2)所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1經密碼子優化后得到的SEQ ID NO.2的核苷酸序列；

(3)編碼序列表中的SEQ ID NO.3氨基酸序列的多核苷酸。

本發明所述的果膠酯酶基因序列是通過全基因組測序、密碼子優化及全基因人工合成的方式獲得。本發明涉及的實驗技術包括灰略紅鏈霉菌基因組及大腸桿菌質粒DNA的提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠回收、連接、質粒酶切、轉化、蛋白誘導表達及純化、聚丙烯酰胺凝膠電泳及重組果膠酯酶活性的測定等，具體步驟為：以灰略紅鏈霉菌基因組為模板，通過密碼子優化及基因人工合成的方式獲得該基因序列，隨后將該基因序列連接到表達載體pET-22b(+)上，并將重組質粒轉入到特定的大腸桿菌表達菌株TransB(DE3)內，進而獲得果膠酯酶表達菌株，最終通過IPTG誘導實現果膠酯酶的體外高效表達，最后收集菌體、細胞破碎，離心后獲得粗酶液，之后進行蛋白純化并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western Blot檢測表達情況，最后測定該果膠酯酶相關的酶學特征。

從灰略紅鏈霉菌得到的果膠酯酶具有以下特征：

1.該果膠酯酶的編碼基因共有1101個核苷酸，序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，共編碼366個氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示。

2.該果膠酯酶的適合反應溫度為45～65℃，優選為55℃。

3.該果膠酯酶的適合反應的pH為7～10，優選為8。

4.除Hg²⁺之外，Cu²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺及Fe²⁺對該酶活性影響較小，對重金屬離子有較普遍的耐受能力；酶活性抑制劑DTT和SDS對該酶活性抑制率分別為13.7％和17.0％，而EDTA對該酶活性抑制較為明顯，酶活抑制程度可達37.5％。

所述的果膠酯酶編碼基因的重組表達載體及轉基因重組菌。所述的重組表達載體為將上述的果膠酯酶的編碼基因插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達果膠酯酶的重組表達載體，所述的大腸桿菌重組表達載體為pET-22b(+)載體。

所述的轉基因重組菌為將上述的重組表達載體導入到大腸桿菌中，篩選得到表達果膠酯酶的轉基因重組菌，所述的大腸桿菌為TransB(DE3)。

上述的果膠酯酶編碼基因在表達果膠酯酶中的應用。

上述的果膠酯酶及其編碼基因在水解果膠中的應用。

一種表達果膠酯酶的方法，是培養上述的轉基因重組菌得到果膠酯酶。

本發明所述的果膠酯酶在天然灰略紅鏈霉菌內的表達量和酶活性均較低，因此嚴重限制了其使用范圍和效果。本發明利用基因工程手段，構建了果膠酯酶表達工程菌株，大幅度提高了目的蛋白果膠酯酶的表達量，為該果膠酯酶的高效表達與應用奠定了基礎，可用于果膠的水解。

與現有技術相比，本發明的有益效果如下：

第一.本發明通過構建外源表達載體，實現了上述果膠酯酶的體外高效表達，并通過對目的蛋白添加可溶性標簽His₆·Tag和目的蛋白的周外空間表達，保證了蛋白生物活性的同時便于后續蛋白的純化；

第二.本發明的果膠酯酶是一種堿性(最適反應pH約為8.0)、耐高溫型(最適反應溫度約為55℃)的裂解酶，該酶對多種重金屬離子(如Hg²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺及Zn²⁺)及酶活性抑制劑(如EDTA、DTT、SDS)具有很強的耐受能力，這可降低酶在生產過程中對水和蛋白原料的純度要求，避免了生產過程中的金屬離子對酶活性的影響，提高了實際應用時的穩定性；

第三.本發明通過應用基因工程技術手段，實現果膠酯酶在體外的高效表達，克服現有技術中果膠酯酶在生物體內多為胞內表達，致使酶表達量和活性較低而導致的應用范圍和效果嚴重受限的問題。

附圖說明

圖1為本發明的灰略紅鏈霉菌的基因組電泳圖；

圖2為本發明的果膠酯酶信號肽切除位點的預測圖；

圖3為本發明的果膠酯酶的基因序列片段PCR擴增圖；

圖4為本發明的果膠酯酶外源誘導表達的示意圖；

圖5為pH對果膠酯酶活力影響的示意圖；

圖6為溫度對果膠酯酶活力影響的示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應該理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用于限定本發明的保護范圍。在實際應用中本領域技術人員根據本發明做出的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。

為了更好的說明本發明，下方結合附圖對本發明進行詳細的描述。

1、灰略紅鏈霉菌的基因組提取和測序

將灰略紅鏈霉菌孢子懸浮液接種于LB液體培養基中，于37℃、150rpm 條件下培養3天，然后收集2.0mL菌液，12000rpm離心2min，并棄上清液，收集菌體沉淀，加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20μl EDTA溶液(0.5M,pH 8.0)，37℃處理45min，加入4μL RNase A(100mg/mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒操作說明完成剩余操作，得到高純度基因組DNA，最后通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質量，確保無明顯RNA條帶，基因組條帶清晰、完整、無降解、無污染，如圖1所示。

采用第二代測序技術，構建不同插入片段長度的文庫，采用Illumina Miseq(2×250bp)平臺進行測序，收集測序的原始數據，對帶接頭、低質量的數據進行過濾，隨后采用Newbler version 2.8對去除接頭的測序數據進行從頭拼接，構建Contigs及Scaffolds，最后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基因組草圖。

2、果膠酯酶的切割位點預測

基于基因功能注釋，在該菌株基因組獲得果膠酯酶編碼基因。采用SignalP 4.1分別對果膠酯酶氨基酸序列進行信號肽模擬預測，如圖2所示。結果表明果膠酯酶N端存在明顯的信號肽序列，推測該酶為胞外酶，且信號肽切割位點位于第30位丙氨酸與第31位組氨酸之間。

3、果膠酯酶的基因序列密碼子優化

采用JCat對該果膠酯酶基因序列進行密碼子優化，以減少其密碼子中GC含量、存在的莖環結構，同時在優化后基因序列中要避免出現轉錄終止位點和轉錄起始位點。經優化，基因GC含量由74.7％降為70.7％，且基因的密碼子使用率由0.28提高至0.63。因此，以優化后的基因序列為模板，進行基因人工合成。

4、果膠酯酶表達載體構建

根據果膠酯酶基因序列，設計含有酶切位點的引物，序列如下：

PE-Nde I-F：

GGAATTCCATATGGTGGCAGCAGGCAAGCCGGCGATGCC

PE-EcoR I-R：

GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTGCACGCGGACGCCAGTCGCCCAGCC

以人工合成基因序列為模板，用含有Nde I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得果膠酯酶基因序列，如圖3所示，使用DNA A-Tailing Kit加A后連接到PMD^TM 19-T，并將連接產物轉入DH5α大腸桿菌內。挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。Nde I和EcoR I進行雙酶切(37℃)，回收果膠酯酶基因片段PE。用相同內切酶酶切表達載體pET-22b(+)并回收載體DNA片段。將果膠酯酶基因片段與載體片段混合，T4DNA連接酶過夜連接(16℃)，將連接產物轉入DH5α大腸桿菌感受態細胞內，通過抗性平板及菌落PCR篩選含有目的基因表達載體的陽性克隆。挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養基中，180rpm、37℃培養16小時后提取質粒。

上述PCR擴增條件為：98℃預變性3min；98℃變性10s，68℃延伸30s；30個循環后68℃終延伸3min。

5、果膠酯酶過表達菌株的構建

將果膠酯酶表達載體轉入TransB(DE3)大腸桿菌，在含有氨芐青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)及四環素(10μg/mL)的LB固體培養基上篩選，獲得果膠酯酶過表達菌株。

上述的TransB(DE3)具有以下特征：該菌株具有卡那霉素(Kan^R)和四環素(Tet^R)抗性，此外該菌株還包含突變的硫氧還蛋白還原酶(trxB)和谷胱甘肽還原酶(gor)基因，表達主要還原途徑的兩個關鍵酶。有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強蛋白的可溶性。

6、重組果膠酯酶體外過表達與純化

挑取陽性克隆于含有氨芐青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)及四環素(10μg/mL)的LB液體培養基中，在25℃震蕩培養，當OD₆₀₀達到0.6-0.8時，加入IPTG溶液使其在發酵液中的濃度分別達到25-40μM，22℃繼續培養20h進行誘導表達。誘導表達培養好的發酵液離心收集菌體，利用破胞緩 沖液洗滌菌體一次，再利用1/10發酵液體積的磷酸鹽緩沖液緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波破胞至菌液澄清，13000rpm離心15min收集上清，上清液即為果膠酯酶的粗酶液。收集上清液，經0.45μm醋酸纖維素膜過濾，之后通過Ni-NTA Resin與His₆·Tag間的親和吸附進行蛋白純化，并使用一定濃度的咪唑洗脫液對蛋白進行洗脫。

7、重組果膠酯酶表達驗證

制備12％SDS-PAGE膠，將粗酶液與5×SDS-PAGE Loading Buffer比例混合，與沸水浴5min，每個點樣孔上樣20μL，在160V電壓下電泳60-70min，直至溴酚藍指示條帶完全跑出膠。停止電泳，用考馬斯亮藍R-250溶液染色20min，然后用脫色液進行洗滌，直至背景色完全脫去，條帶清晰可見。結果顯示，經優化已經成功表達出明顯的果膠酯酶條帶，且濃度為50-150mM的咪唑洗脫液洗脫效果最佳。

按順序組裝轉膜裝置：正電極、海綿、三張濾紙、PVDF膜、SDS-PAGE膠、三張濾紙、海綿和負電極。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，濾紙用電轉液浸泡。將裝好的轉膜裝置放入電轉槽，4℃、100V運行60-70min；將轉好的PVDF膜置于封閉液中，并置于水平振蕩器上室溫封閉1h；將封閉完的PVDF膜轉入一抗溶液中，置于滾動搖床37℃、150rpm孵育1h；隨后轉移一抗孵育后的PVDF至TBST緩沖液中，在搖床上震蕩清洗3次，每次10min；之后再在TBS緩沖液中清洗1次，10min；將沖洗干凈的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滾動搖床37℃、150rpm孵育1h；洗膜，將染色液均勻涂抹于PVDF膜上，靜置1min；通保鮮膜包好PVDF膜，置于X-光片盒中，并用透明膠帶固定；于暗室中壓片洗膜顯影，結果如圖4所示。

8、重組果膠酯酶酶學特征的測定

果膠酯酶催化水解果膠分子而釋放出H⁺，使反應體系的pH下降，用堿液(0.05mol/L NaOH溶液)使反應體系的pH維持不變。通過堿的消耗量可以反應出果膠酯酶的活性。取30mL 1.0％的果膠溶液于100mL三角燒瓶中，加入10mL粗酶液，記錄pH讀數。同時開始記時，通過自動電位滴定儀用0.05M NaOH滴定，保持溶液的pH讀數不變。以消耗的NaOH微摩爾數-反應時間 作圖，由所得曲線最初部分的斜率表示果膠酯酶的活力，活力單位為mol/s，即每秒鐘消耗1mol NaOH定義為一個活力單位。

采用上述方法測定在不同溫度(30℃-70℃)、pH值(3.0-11.0)、1mM金屬離子(Hg²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺及Zn²⁺)及1mM酶活性抑制劑(DTT、EDTA、SDS)處理1h后，果膠酯酶的殘存活性，測定結果如圖5和圖6所示，隨著溫度升高，果膠酯酶活性呈的現先升高后降低的趨勢，當溫度為55℃時，該果膠酯酶具有最高的催化活性，同時該酶最適反應pH約為8.0。因此，該果膠酯酶的具有較強的耐高溫能力和在堿性環境下具有較高的酶學活性。

該果膠酯酶對重金屬離子有較普遍的耐受能力，如表一所示，除Hg²⁺之外，其余重金屬離子如Cu²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺及Fe²⁺對該酶活性影響較小，Hg²⁺對該果膠酯酶的抑制作用較為顯著，酶活性抑制率可達46.4％。

最后，酶活性抑制劑DTT和SDS對該果膠酯酶活性抑制率分別為13.7％和17.0％，而EDTA對該酶活性抑制較為明顯，酶活抑制程度可達37.5％。

附表一重金屬離子對果膠酯酶活性的影響

以上公開的本發明優選實施例只是用于幫助闡述本發明。優選實施例并沒有詳盡敘述所有的細節，也不限制該發明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據本說明書的內容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這 些實施例，是為了更好地解釋本發明的原理和實際應用，從而使所屬技術領域技術人員能很好地理解和利用本發明。本發明僅受權利要求書及其全部范圍和等效物的限制。