海洋低溫α?淀粉酶基因克隆與表達的制作方法

本發明屬于酶工程和基因工程領域，具體涉及到一種在低溫下仍具有活性與穩定性的海洋低溫α-淀粉酶基因的克隆與其表達。

背景技術：

淀粉酶是能夠降解淀粉糖昔鍵的一類酶的總稱，按照水解方式的不同，主要分為α-淀粉酶、自淀粉酶、糖化酶、異淀粉酶和普魯蘭酶。

淀粉作為原料在工業中的應用，其最主要的方式是將淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖或者寡糖糖漿，這些糖漿隨后被用作原料用于如酒精、有機酸、氨基酸等工業生產或直接作為產品用于其他工業領域,淀粉酶作為應用最廣的酶制劑之一，其主要用途包括：食品、醫藥、洗滌、造紙、紡織等領域,淀粉酶能分解淀粉類污垢，使之降解，達到去除的目的。

目前商品化的淀粉酶為中溫和高溫酶，在工業上用淀粉制糖主要采用酶水解的方法,酶法制糖工藝一般采用兩步法，第一步用α-淀粉酶將淀粉水解成低分子量的糊精，第二步用糖化酶將糊精水解成葡萄糖，α-淀粉酶的作用特點是在淀粉分子鏈中間將α-1，4)搪昔鍵切斷，但是，在0～20℃活力低，從而限制了淀粉酶在食品、飼料、紡織和洗滌工業的應用,日本學者和田恭尚曾詳細論述了低溫淀粉酶作為洗滌劑的條件，因此，低溫淀粉酶的研究開發具有現實的意義。

技術實現要素：

本發明的目的之一在于提供了一種在低溫下仍具有活性與穩定性的海洋低溫α-淀粉酶基因。

本發明的目的之二在于提供了該基因的編碼蛋白。

本發明的目的之三在于提供該基因的克隆方法。

為達到以上目的，本發明通過下述方案實現:

一種海洋低溫α-淀粉酶基因，其序列為SEQ ID NO.1所示的堿基序列，該基因序列全長1302bp，以ATG為起始密碼子，以TGA為終止密碼子，GC堿基含量為35％。

所述的海洋低溫α-淀粉酶基因的蛋白序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，該蛋白是433個氨基酸構成的蛋白序列，預測其分子相對質量為50.29kDa。

所述的海洋低溫α-淀粉酶基因的克隆方法，包括以下步驟為:

(1)、以蘇云金芽孢桿菌基因組DNA為模板，以PCR擴增獲取alpha amylase基因CDS區全長序列；

(2)、根據已獲取的alpha amylase基因，與已知序列進行NCBI比對，得到同源序列，并根據同源序列設計合成如下引物：

CTF035Fw1：5’-CGACATATGCGTTTCATTCG-3’

CTF035Rw1：5’-GCTAGGAAGAAGACTTTCTC-3’

CTF035Fw2：5’-GTGATGTTAGAAAACCTAAC-3’

CTF035Rw2：5’-GTATAAGAGTATTCTCTAAC-3’；

(3)、使用HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)進行PCR擴增獲得克隆基因片段，最后測序分析獲得所需的基因克隆片段。

所述的PCR擴增的條件為：98℃10秒，50℃10秒，72℃2分鐘，30個循環，72℃5分鐘一個循環。

表達上述的海洋低溫α-淀粉酶基因的方法的具體步驟為:

(1)、PCR擴增alpha amylase基因1299bp，3’端添加TGA終止子，兩側添加NdeI/Hind III酶切位點，克隆至pCold I載體形成重組質粒。

(2)、將重組質粒轉入BL21T1R感受態細胞中，對陽性克隆進行誘導，表達。

本發明的有益效果：本發明通過蘇云金芽孢桿菌菌株能快速，準確的獲得活性最適溫度為15-25℃的低溫α-淀粉酶基因，并且獲得的基因是一個完整的閱讀框，并實現快速高效表達低溫淀粉酶基因，可以大量獲取海洋低溫淀粉酶，為研究開發低溫淀粉酶提供基礎。

附圖說明

圖1為溫度對α-淀粉酶活性的影響；

圖2為溫度對α-淀粉酶穩定性的影響。

具體實施方式

現結合實施例進一步對本發明進行說明。

一種海洋低溫α-淀粉酶基因，其序列為SEQ ID NO.1所示的堿基序列，該基因序列全長1302bp，以ATG為起始密碼子，以TGA為終止密碼子，GC堿基含量為35％。

所述的海洋低溫α-淀粉酶基因的蛋白序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，該蛋白是433個氨基酸構成的蛋白序列，預測其分子相對質量為50.29kDa。

所述的海洋低溫α-淀粉酶基因的克隆方法，包括以下步驟為:

(1)、以蘇云金芽孢桿菌基因組DNA為模板，以PCR擴增獲取alpha amylase基因CDS區全長序列；

(2)、根據已獲取的alpha amylase基因已知序列進行NCBI比對得到同源序列，并根據同源序列設計合成如下引物：

CTF035Fw1：5’-CGACATATGCGTTTCATTCG-3’

CTF035Rw1：5’-GCTAGGAAGAAGACTTTCTC-3’

CTF035Fw2：5’-GTGATGTTAGAAAACCTAAC-3’

CTF035Rw2：5’-GTATAAGAGTATTCTCTAAC-3’；

(3)、使用HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)進行PCR擴增獲得克隆基因片段和PCR產物純化，最后測序分析獲得所需的基因克隆片段。

所述的PCR擴增的條件為：98℃10秒，50℃10秒，72℃2分鐘，30個循環，72℃5分鐘一個循環。然后PCR擴增獲得基因片段和PCR產物純化，最后測序分析獲得所需的基因克隆片段。

表達上述的海洋低溫α-淀粉酶基因的方法的具體步驟為:

(1)、PCR擴增alpha amylase基因1299bp，3’端添加TGA終止子，兩側添加NdeI/Hind III酶切位點，克隆至pCold I載體形成重組質粒。

(2)、將重組質粒轉入BL21T1R感受態細胞中，對陽性克隆進行誘導，表達：

①轉化：將重組質粒取0.5ul轉入BL21T1R中；使用LB/抗生素Amp(100ug/ml)平板,10ul轉化液涂布，37℃O/N培養23h，Control pCold I進行同樣操作；

②培養及誘導：分別挑取單菌落至2ml LB/Amp(100ug/ml)培養基中，37℃O/N培養23h。在Glass tube中添加5ml LB/Amp(100ug/ml)培養基，分別添加種子培養液100ul，37℃培養至OD₆₀₀nm值約為0.6，15℃15min,添加100mM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50ul(final 1mM IPTG)進行誘導，15℃培養22h。

③蛋白質抽提：集菌后1.0OD相當的菌體加入160ulPBS懸濁后進行超聲波破碎，對菌體破碎液進行離心分離。

④抽提液電泳：取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8ul(0.05OD相當)，加入2ul 5×SDS Loading Buffer，95℃加熱10分鐘，進行SDS-PAGE電泳，最后得到海洋低溫α-淀粉酶。

利用不同溫度分別對海洋低溫α-淀粉酶的活性和穩定性作出如下測試：

1、溫度對低溫α-淀粉酶活性的影響

具體實施步驟為：

(1)于無菌條件下將斜面上的菌體轉接3環于種子培養基中，20℃，140r/min搖床振蕩培養20h后，作為種子液；再將種子液用移液器轉接到發酵培養基中，20℃，140r/min振蕩培養。定時取樣測定發酵液中的酶活力，每個實驗做2個平行，結果取平均值。

(2)將發酵液于4℃，8000r/min下離心15min，上清液即作為粗酶液。

(3)取適量粗酶液在不同溫度下(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)作用30min，然后測量粗酶液相對酶活。

根據上述實驗，低溫α-淀粉酶活性如圖1所示，圖1橫坐標表示作用溫度，縱坐標表示相對酶活，從圖中可以看出該酶作用的最適溫度為15-25℃，15℃和30℃時酶活性分別保留80％和60％以上，可見該酶具備一定的低溫特性，在較低溫度還能保持較高的酶活；

2、溫度對α-淀粉酶穩定性的影響具體實施步驟：

(1)于無菌條件下將斜面上的菌體轉接3環于種子培養基中，20℃，140r/min搖床振蕩培養20h后，作為種子液；再將種子液用移液器轉接到發酵培養基中，20℃，140r/min振蕩培養。定時取樣測定發酵液中的酶活力，每個實驗做2個平行，結果取平均值。

(2)將發酵液于4℃，8000r/min下離心15min，上清液即作為粗酶液。

(3))取適量粗酶液在不同溫度下(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃)作用下，每隔10min測一次相對酶活，連續測量6次。

根據上述實驗，得出α-淀粉酶的穩定性示意圖，如圖2所示，圖2橫坐標表示作用時間，縱坐標表示相對酶活，該圖表示出此低溫酶在不同溫度下的穩定性，該酶在20℃以下是穩定的；30℃保溫1h，仍保留60％的酶活性，可見該酶具備一定的低溫特性，屬低溫型α-淀粉酶，有潛力應用于低溫條件下淀粉液化加工行業。

盡管本發明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。

<110> 大連大學

<120> 海洋低溫α-淀粉酶基因克隆與表達

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> PRT

<213> 人工合成

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<212> DNA

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