含人APP啟動子?luci細胞系及其構建方法和應用與流程
本發明屬于細胞系構建方法技術領域，具體涉及一種含人APP啟動子-luci細胞系，本發明還涉及上述含人APP啟動子-luci細胞系的構建方法和應用。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，俗稱老年癡呆癥；是以進行性癡呆為其主要臨床特征的神經系統退行性病變。阿爾茨海默病患者認知和記憶能力不斷下降，并伴有各種神經精神癥狀和行為障礙。就現有技術而言，阿爾茨海默病在臨床上尚無有效的治療方法。
近年來國、內外研究表明：在阿爾茨海默病病情進展中，Aβ聚集并形成淀粉樣原纖維是老年斑形成的關鍵步驟，也是導致神經元損傷的重要因素。神經元細胞中APP表達異常增高是加速Aβ產生和聚集的重要因素之一。多年來，研究人員致力于研發一種能夠抑制APP表達且無明顯細胞毒性作用的藥物。但目前在技術領域仍然缺乏高效篩選抑制APP啟動子區活性藥物的平臺。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種含人APP啟動子-luci細胞系，能用于篩選抑制人APP表達的新型抗老年癡呆化合物及治療性藥物。
本發明的另一目的是提供上述含人APP啟動子-luci細胞系的構建方法。
本發明的第三個目的是提供上述含人APP啟動子-luci細胞系在篩選抑制人APP表達的新型抗老年癡呆化合物及治療性藥物中的應用。
本發明所采用的第一種技術方案是，含人APP啟動子-luci細胞系，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
本發明所采用的第二種技術方案是，含人APP啟動子-luci細胞系的構建方法，具體按照以下步驟實施：
步驟1、構建含人APP啟動子區-熒光素酶嵌合基因的表達載體，該表達載體為：pGL3-APPP_luc-puro質粒；
步驟2、將步驟1中構建的pGL3-APPP_luc-puro質粒與pRL-SV40質粒共轉染人胚腎細胞系HEK-293T細胞系；
步驟3、將步驟2中被轉染的HEK-293T細胞經胰酶消化后鋪種于10cm培養皿中，并采用嘌呤霉素加壓篩選獲得基因組中有可能穩定整合人APP啟動子區-熒光素酶嵌合基因的細胞系，共五株，分別為：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3；通過對篩選得到的五株細胞系中螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶的活性檢測，得到含人APP啟動子-luci細胞系，即為1A3細胞系。
本發明第二種技術方案的特點還在于：
步驟1具體按照以下步驟實施：
步驟1.1、以pRL-SV40載體為模板，并采用引物1和引物2，經PCR擴增獲得SV40增強子/啟動子區序列片段；
引物1為：
TGGTAAAATCGATAAGAGTCCGCGCAGCACCATGGCCTGAA；
引物2為：
GTGGGCTTGTACTCGGTCATGGATCCTTGCAAAAGCCTAGG；
以pBrit-HA/Flag載體為模板，并采用引物3和引物4，經PCR擴增獲得嘌呤霉素抗性基因序列片段；
引物3為：
CCTAGGCTTTTGCAAGGATCCATGACCGAGTACAAGCCCAC；
引物4為：
CTCTCAAGGGCATCGGTCGACTCAGGCACCGGGCTTGCGGG；
步驟1.2、待步驟1.1完成，運用二次PCR方法，再利用引物1和引物4，以凝膠純化后的SV40增強子/啟動子區序列片段和嘌呤霉素抗性基因序列片段為模板，經PCR擴增獲得SV40增強子/啟動子及嘌呤霉素抗性基因融合片段；
步驟1.3、經步驟1.2后，先將pGL3-basic表達載體用限制性酶切酶BamH I-HF和Sal I-HF進行雙酶切，接著采用熱敏堿性磷酸酶對酶切產物進行去磷酸化處理，最后采用凝膠純化方法回收載體片段；
步驟1.4、采用Infusion-HD連接酶連接經步驟1.3雙酶切后得到的載體pGL3-basic和目的基因片段SV40增強子/啟動子及嘌呤霉素抗性基因融合片段，得到連接產物A；
步驟1.5、將經步驟1.4得到的連接產物A轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，并于次日挑取陽性克隆，提取質粒并送測序，獲得的載體命名為pGL3-puro1，獲得的該載體還保留了pGL3-basic載體的原有氨芐抗性基因及螢火蟲熒光素酶基因序列片段；
步驟1.6、提取人膠質細胞系A172細胞的基因組DNA，具體按照以下方法實施：
采用引物5和引物6，經PCR法擴增人APP，即淀粉樣蛋白前體蛋白基因，啟動子區基因片段；
所述引物5為：
CTATCGATAGGTACCGAGCTCTGCATTTTTAGTAGAGATGGGGG；
所述引物6為：
ACTTAGATCGCAGATCTCGAGGGGTTAAGGTCTTGGGGGGTAT；
步驟1.7、先將經步驟1.5獲得的pGL3-puro1表達載體用限制性酶切酶Sac I-HF和Xho I-HF進行雙酶切，然后采用熱敏堿性磷酸酶對酶切產物進行去磷酸化處理，最后采用凝膠純化方法回收載體片段；
步驟1.8、采用Infusion-HD連接酶連接經步驟1.7雙酶切后的載體pGL3-puro1和目的基因片段APPP，得到連接產物B；
步驟1.9、將經步驟1.8得到的連接產物B轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，次日挑取陽性克隆，提取質粒并送測序，獲得的載體命名為pGL3-APPP_luc-puro，所述pGL3-APPP_luc-puro載體中保留了pGL3-puro1載體原有氨芐抗性基因、嘌呤霉素抗性基因序列及SV40啟動子/增強子基因序列片段。
步驟1.3中雙酶切的條件為：先于37℃條件下反應3.5h～4.5h，再于65℃條件下滅活20min～30min；
步驟1.3中去磷酸化處理的反應條件為：先于37℃條件下反應30min～60min，在于65℃條件下滅活10min～12min。
步驟1.4中的反應條件為：先于50℃條件下反應13min～17min；再于4℃條件下冷卻1min～3min。
步驟1.7中的反應條件具體如下：
雙酶切條件為：先于37℃條件下反應3h～5h，再于65℃條件下滅活20min～30min；
去磷酸化處理的反應條件為：先于37℃條件下反應50min～70min，再于65℃條件下65℃滅活10min～12min。
步驟1.8中的反應條件具體如下：先于50℃條件下反應15min，再于4℃條件下冷卻2min～4min。
步驟2具體按照以下步驟實施：
步驟2.1、將1×105個HEK-293T細胞鋪種于24孔板中；
步驟2.2、待24h之后，采用脂質體2000將0.8微克的pGL3-APPP_luc-puro質粒和0.2微克的pRL-SV40質粒轉染人胚腎細胞系HEK-293T細胞系。
步驟3具體按照以下步驟實施i:
步驟3.1、采用胰酶消化經步驟2得到的被轉染細胞；
步驟3.2、經步驟3.1后，將被轉染細胞分別鋪種于兩個直徑為10cm細胞培養皿中，每個培養皿中都預先加入10mL含10％胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培養基；
于1μg/mL嘌呤霉素加壓條件下，篩選細胞2周，能夠觀察到培養皿中形成多個陽性細胞克隆團；
步驟3.3、待步驟3.2完成，先將經細胞消化液潤濕后的無菌濾紙覆蓋于單一陽性細胞克隆團上，待全部陽性細胞克隆團被濾紙覆蓋后，再將培養皿置于細胞培養箱中孵育3min～6min后取出培養皿；
然后采用無菌鑷子將沾有陽性細胞克隆團的濾紙轉移至24孔板；
最后采用含有1μg/mL嘌呤霉素和10％胎牛血清的DMEM培養基培養細胞；
步驟3.4、篩選經步驟3.3得到的細胞系，初步獲得五株能穩定整合人APP啟動子區-螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶基因的細胞系，簡稱為含人APP啟動子-luci細胞系，并將這五株細胞系分別命名為：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3；
步驟3.5、將步驟3.4中的五株細胞系培養于1μg/mL嘌呤霉素含10％胎牛血清的DMEM培養基中；
步驟3.6、經步驟3.5后，采用雙熒光素酶報告系統試劑盒對步驟3.4中篩選到的五株APPP-luci細胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3進行螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶表達檢測，以確定APP啟動子區序列能否正常啟動螢火蟲熒光素酶表達，最終得到一株基因組中確定能穩定整合人APP啟動子區-熒光素酶嵌合基因且高效表達螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的細胞系，即為含人APP啟動子區-熒光素酶嵌合基因的細胞系；
對篩選到的五株APPP-luci細胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3進行表達檢測，其具體的方法如下：
步驟a、分別將五株APPP-luci細胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3鋪種于24孔培養板中，每孔1×105個細胞，培養24h，
步驟b、經步驟a后，去除細胞培養液，每孔加入50μL細胞裂解液1×Passive lysis buffer，于室溫條件下反應15min～20min；
步驟c、取5μL步驟b中細胞裂解液，加入白色不透明96孔板中，并在每孔中加入50μL螢火蟲熒光素酶底物液，讀取熒光強度，然后加入50μL海腎熒光素酶底物液，讀取熒光強度；
步驟d、通過比較5株細胞系中螢火蟲熒光素酶活性相對強弱RLA來確定插入螢火蟲熒光素酶基因上游的人源APP啟動子區基因序列是否能驅動螢火蟲熒光素酶表達，螢火蟲熒光素酶活性相對強弱按照如下算法獲得：
RLA＝螢火蟲熒光素酶活性(LAF)/海腎熒光素酶活性(LAR)；
經計算后得到：篩選到的五株穩定細胞系中1A3、1B3和2B3既表達螢火蟲熒光素酶，又表達海腎熒光素酶，其中1A3細胞株中兩種熒光素酶表達效率較高，＝該細胞系可用于篩選具有調控人APP啟動子區活性作用的化合物。
本發明所采用的第三種技術方案是，上述含人APP啟動子-luci細胞系在篩選抑制人APP表達的新型抗老年癡呆化合物及治療性藥物中的應用。
本發明的有益效果在于：
(1)在構建本發明含人APP啟動子-luci細胞系的方法中，在pGL3-basic載體中插入了SV40啟動子/增強子和嘌呤霉素抗性基因融合片段，所構建出的pGL3-puro1載體具有嘌呤霉素抗性，經轉染細胞后，可以采用嘌呤霉素進行篩選細胞，具有低成本和高效性的優點。
(2)在本發明含人APP啟動子-luci細胞系的構建方法中，人源APP啟動子區序列片段來源于人膠質細胞基因組，將該片段插入pGL3-puro1載體中的螢火蟲熒光素酶基因上游，構建出的pGL3-APPP_luc-puro載體，經轉染人胚腎HEK-293T細胞并采用嘌呤霉素篩選后獲得了穩定細胞系，其中1A3細胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達較高，可如說明書中的圖7所示，能用于大規模篩選抑制人APP表達的新型抗老年癡呆化合物及治療性藥物。
附圖說明
圖1是SV40增強子/啟動子區基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2是嘌呤霉素抗性基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3是凝膠純化回收APPP片段、SV40增強子/啟動子區基因片段和BamH I-HF/Sal I-HF雙酶切后的pGL3-basic載體片段經瓊脂糖凝膠電泳后的圖；
圖4是pGL3-puro1載體的結構示意圖；
圖5是APPP基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖6是pGL3-APPP_luc-puro載體的結構示意圖；
圖7是1A3、2A3、2A6、1B3和2B3穩定細胞系中螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶表達檢測結果。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施方式對本發明進行詳細說明。
本發明含人APP啟動子-luci細胞系，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
本發明含人APP啟動子-luci細胞系的構建方法，具體按照以下步驟實施：
步驟1、構建含人APP啟動子區-熒光素酶嵌合基因的表達載體，該表達載體為：pGL3-APPP_luc-puro質粒，具體按照以下步驟構建：
步驟1.1、以pRL-SV40載體為模板，并采用引物1和引物2，經PCR擴增獲得SV40增強子/啟動子區序列片段；
SV40增強子/啟動子區序列片段可如圖1所示：瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物；圖1種的第7和第8泳道為經過PCR獲得的SV40增強子/啟動子區序列片段，其大小約為450bp，且條帶單一、產物量大，可用于凝膠純化及后續的二次PCR反應；
另外，引物1和引物2分別如下：
引物1為：
TGGTAAAATCGATAAGAGTCCGCGCAGCACCATGGCCTGAA；
引物2為：
GTGGGCTTGTACTCGGTCATGGATCCTTGCAAAAGCCTAGG；
以pBrit-HA/Flag載體為模板，并采用引物3和引物4，經PCR擴增獲得嘌呤霉素抗性基因序列片段；
嘌呤霉素抗性基因序列片段可如圖2所示：瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，圖2中的第2泳道為經過PCR獲得的嘌呤霉素抗性基因序列片段，其大小約為650bp，且條帶單一、產物濃度較低，但仍可作可用于凝膠純化及后續的二次PCR反應；
另外，引物3和引物4分別如下：
引物3為：
CCTAGGCTTTTGCAAGGATCCATGACCGAGTACAAGCCCAC；
引物4為：
CTCTCAAGGGCATCGGTCGACTCAGGCACCGGGCTTGCGGG；
步驟1.2、待步驟1.1完成，運用二次PCR方法，再利用引物1和引物4，以凝膠純化后的SV40增強子/啟動子區序列片段和嘌呤霉素抗性基因序列片段為模板，經PCR擴增獲得SV40增強子/啟動子及嘌呤霉素抗性基因融合片段；
步驟1.3、經步驟1.2后，先將pGL3-basic表達載體用限制性酶切酶BamH I-HF和Sal I-HF進行雙酶切；接著采用熱敏堿性磷酸酶對酶切產物進行去磷酸化處理，最后采用凝膠純化方法回收載體片段；
回收的pGL3-basic載體片段可如圖3中的第4泳道所示：條帶單一且濃度較高，可用于后續的連接反應。
在步驟1.3中：
雙酶切的條件為：先于37℃條件下反應3.5h～4.5h，再于65℃條件下滅活20min～30min；
去磷酸化處理的反應條件為：先于37℃條件下反應30min～60min，在于65℃條件下滅活10min～12min。
步驟1.4、采用Infusion-HD連接酶連接經步驟1.3雙酶切后得到的載體pGL3-basic和目的基因片段SV40增強子/啟動子及嘌呤霉素抗性基因融合片段，得到連接產物A；
步驟1.4中的反應條件具體如下：
先于50℃條件下反應13min～17min；
再于4℃條件下冷卻1min～3min。
步驟1.5、將經步驟1.4得到的連接產物A轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，并于次日挑取陽性克隆，提取質粒并送測序，其測序結果如圖4所示，獲得的載體命名為pGL3-puro1；
如圖4所示：在pGL3-puro1載體中，SV40啟動子/增強子基因序列片段位于嘌呤霉素抗性基因序列片段上游，啟動嘌呤霉素抗性基因表達；
獲得的該載體還保留了pGL3-basic載體的原有氨芐抗性基因及螢火蟲熒光素酶基因序列片段。
步驟1.6、提取人膠質細胞系A172細胞的基因組DNA，具體方法如下：
采用引物5和引物6，經PCR法擴增人APP(淀粉樣蛋白前體蛋白)基因啟動子區基因片段，如圖5中的泳道2所示，經瓊脂糖凝膠電泳后，APP啟動子區基因片段大小約為2250bp，條帶單一；
經凝膠純化回收，如圖3中的第2泳道所示，純化后的APP啟動子區基因片段純度高，瓊脂糖凝膠電泳條帶單一，可用于后續了連接反應。
APP啟動子區基因片段片段簡寫為：APPP，該段基因序列位于APP基因轉錄起始位點上游1823bp至下游329bp(-1823bp/+329bp)處；
另外，引物5和引物6分別為：
引物5為：
CTATCGATAGGTACCGAGCTCTGCATTTTTAGTAGAGATGGGGG；
引物6為：
ACTTAGATCGCAGATCTCGAGGGGTTAAGGTCTTGGGGGGTAT。
步驟1.7、先將經步驟1.5獲得的pGL3-puro1表達載體用限制性酶切酶Sac I-HF和Xho I-HF進行雙酶切，然后采用熱敏堿性磷酸酶對酶切產物進行去磷酸化處理，最后采用凝膠純化方法回收載體片段；
在步驟1.7中：
雙酶切條件為：先于37℃條件下反應3h～5h，再于65℃條件下滅活20min～30min；
去磷酸化處理的反應條件為：先于37℃條件下反應50min～70min，再于65℃條件下65℃滅活10min～12min；
步驟1.8、采用Infusion-HD連接酶連接經步驟1.7雙酶切后的載體pGL3-puro1和目的基因片段APPP，得到連接產物B；
步驟1.8中的反應條件具體如下：
先于50℃條件下反應15min；
再于4℃條件下冷卻2min～4min。
步驟1.9、將經步驟1.8得到的連接產物B轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，次日挑取陽性克隆，提取質粒并送測序，獲得的載體命名為pGL3-APPP_luc-puro；
pGL3-APPP_luc-puro載體的結構示意圖如圖6所示，在pGL3-APPP_luc-puro載體中，APPP位于螢火蟲熒光素酶基因序列上游，啟動螢火蟲熒光素酶表達；pGL3-APPP_luc-puro載體中保留了pGL3-puro1載體原有氨芐抗性基因、嘌呤霉素抗性基因序列及SV40啟動子/增強子基因序列片段。
步驟2、將步驟1中構建的pGL3-APPP_luc-puro質粒與pRL-SV40質粒共轉染人胚腎細胞系HEK-293T細胞系，具體按照以下方法實施：
步驟2.1、將1×105個HEK-293T細胞鋪種于24孔板中；
步驟2.2、待24h之后，采用脂質體2000將0.8微克的pGL3-APPP_luc-puro質粒和0.2微克的pRL-SV40質粒轉染人胚腎細胞系HEK-293T細胞系。
步驟3、將步驟2中被轉染的HEK-293T細胞經胰酶消化后鋪種于10cm培養皿中，并采用嘌呤霉素加壓篩選獲得基因組中有可能穩定整合人APP啟動子區-熒光素酶嵌合基因的細胞系，共五株，分別為：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3；通過對篩選得到的五株細胞系中螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶的活性檢測，得到含人APP啟動子-luci細胞系，即為1A3細胞系，具體按照以下步驟實施：
步驟3.1、采用胰酶消化經步驟2得到的被轉染細胞；
步驟3.2、經步驟3.1后，將被轉染細胞分別鋪種于兩個直徑為10cm細胞培養皿中；
每個培養皿中都預先加入10mL含10％胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培養基；于1μg/mL嘌呤霉素加壓條件下，篩選細胞2周，能夠觀察到培養皿中形成多個陽性細胞克隆團；
步驟3.3、待步驟3.2完成，先將經細胞消化液潤濕后的無菌濾紙覆蓋于單一陽性細胞克隆團上，待全部陽性細胞克隆團被濾紙覆蓋后，再將培養皿置于細胞培養箱中孵育3min～6min后取出培養皿；然后采用無菌鑷子將沾有陽性細胞克隆團的濾紙轉移至24孔板；最后采用含有1μg/mL嘌呤霉素和10％胎牛血清的DMEM培養基培養細胞；
步驟3.4、篩選經步驟3.3得到的細胞，初步獲得五株能穩定整合人APP啟動子區-螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶基因的細胞系，簡稱為APPP-luci細胞系，并將這五株細胞系分別命名為：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3；
步驟3.5、將步驟3.4中的五株細胞系培養于1μg/mL嘌呤霉素含10％胎牛血清的DMEM培養基中；
步驟3.6、經步驟3.5后，采用雙熒光素酶報告系統試劑盒對步驟3.4中篩選到的五株APPP-luci細胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3進行螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶表達檢測，以確定APP啟動子區序列能否正常啟動螢火蟲熒光素酶表達，最終得到一株基因組中確定能穩定整合人APP啟動子區-熒光素酶嵌合基因且高效表達螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的細胞系，即為含人APP啟動子區-熒光素酶嵌合基因的細胞系；
其中，對篩選到的五株APPP-luci細胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3分別進行檢測，其具體的方法如下：
步驟a、分別將五株APPP-luci細胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3鋪種于24孔培養板中，每孔1×105個細胞，培養24h，
步驟b、經步驟a后，去除細胞培養液，每孔加入50μL細胞裂解液(1×Passive lysis buffer)，于室溫條件下反應15min～20min；
步驟c、取5μL步驟b中細胞裂解液，加入白色不透明96孔板中，并在每孔中加入50μL螢火蟲熒光素酶底物液，讀取熒光強度，然后加入50μL海腎熒光素酶底物液，讀取熒光強度；
步驟d、通過比較5株細胞系中螢火蟲熒光素酶活性相對強弱(RLA)來確定插入螢火蟲熒光素酶基因上游的人源APP啟動子區基因序列是否能驅動螢火蟲熒光素酶表達，螢火蟲熒光素酶活性相對強弱按照如下算法獲得：
RLA＝螢火蟲熒光素酶活性(LAF)/海腎熒光素酶活性(LAR)；
具體結果可如圖7所示，篩選到的五株穩定細胞系中1A3、1B3和2B3既表達螢火蟲熒光素酶，又表達海腎熒光素酶，其中1A3細胞株中兩種熒光素酶表達效率較高，因此該細胞系可用于篩選具有調控人APP啟動子區活性作用的化合物。
最終得到的1A3細胞建立后即可應用于高通量篩選抑制人APP基因表達的抗老年癡呆藥物，具體檢查方法為：
采用不同濃度的待測化合物處理1A3細胞，24h后檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達，具體方法如下：
細胞經1×Passive lysis buffer裂解后，加入螢火蟲熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，分別讀取熒光強度；通過比較待測化合物處理前后，APP啟動子區活性強弱，即螢火蟲熒光素酶活性相對強弱(RLA)來確定待測化合物對APP啟動子區的影響；
RLA＝螢火蟲熒光素酶活性(LAF)/海腎熒光素酶活性(LAR)。
待測化合物對APP啟動子區抑制效率的計算公式具體如下：
在上式中：
LAFc代表對照組(即溶劑組)螢火蟲熒光素酶活性值；
LARc代表對照組(即溶劑組)海腎熒光素酶活性值；
LAFc代表實驗組(即待測化合物組)螢火蟲熒光素酶活性值；
LARc代表實驗組(即待測化合物組)海腎熒光素酶活性值；
BLAFc，BLARc、BLAFt和BLARt分別代表相應96孔板的背景吸光值；
S.e.代表抑制效率。
判斷標準：
如果S.e.值接近0，說明該化合物對APP啟動子區活性無明顯影響；
如果S.e.值接近1，說明該化合物能顯著抑制APP啟動子區活性。
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