本發明屬于腫瘤治療和分子免疫學領域，涉及一種抗ctla4-抗pd-1雙功能抗體、其藥物組合物及其用途。具體地，本發明涉及一種抗ctla4-抗pd-1的單克隆抗體。
背景技術：
：：細胞毒性t淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxictlymphocytesociatedantigen4，亦簡稱為ctla4)與cd28分子在基因結構、染色體定位、序列的同源性及基因表達具有十分相近的關系，都是共刺激分子b7的受體，主要表達于被激活t細胞表面。ctla4與b7結合后能抑制小鼠和人t細胞的激活，在t細胞活化中起負調節作用。ctla4mab或ctla4配體可以阻止ctla4與其天然配體結合，從而封閉ctla4對t細胞負性調節信號的傳導，增強t細胞對各種抗原的反應性，在這方面體內與體外研究結果基本一致。目前已有ctla4mab處于臨床試驗階段用于治療前列腺癌，膀胱癌，結腸直腸癌，胃腸道癌，肝癌，惡性黑色素瘤等(grossojf.,jure-kunkelmn.,ctla-4blockadeintumormodels:anoverviewofpreclinicalandtranslationalresearch.cancerimmun.2013；13:5.epub2013jan22)。白細胞介素2(il-2)由t細胞產生，是調節t細胞亞群的生長因子，也是調控免疫應答的重要因子，并可促進活化b細胞增殖，參與抗體反應、造血和腫瘤監視。重組的人il-2已經被美國fda批準用于治療惡性腫瘤(包括黑色素瘤、腎腫瘤等)，同時正在進行治療慢性病毒感染的臨床研究(chavez,a.r.,etal.,pharmacologicadministrationofinterleukin-2.annnyacadsci,2009.1182:p.14-27)。體外實驗中，ctla4mab可特異地解除ctla4對機體免疫抑制，激活t細胞，誘導il-2產生，在抗腫瘤及寄生蟲等疾病的基因治療中有廣泛應用前景。ctla4及ctla4mab作為t細胞功能狀況的重要影響因素，通過干預機體免疫微環境，可對疾病產生特異性治療作用，并發揮較高療效，補充傳統用藥的不足，由此開辟基因治療的新途徑。ctla4及ctla4mab應用于試驗及臨床各階段：如在自身免疫性疾病中有效抑制哮喘動物模型的氣道高反應性、阻止風濕性疾病的發展以及在同種異體移植中介導機體免疫耐受等。但同時，盡管生物基因治療在短期臨床試驗研究中未發現不良反應，我們亦應注意到其長期應用所存在的潛在影響，如ctla4mab過度阻斷ctla4-b7信號則可導致自身免疫性疾病的發生。由于抗體可以特異結合其配體并導致靶細胞溶解或阻斷病理進程，所以抗體尤其人源性抗體藥物的開發利用對人類惡性腫瘤及其他免疫性疾病臨床治療有重要意義。跨膜受體pd-1(程序性細胞死亡-1)是cd28基因家族成員之一，在活化的t細胞，b細胞以及骨髓系細胞都有表達。pd-1的受體pdl1和pdl2均屬于b7超家族，其中pdl1多種細胞都有表達，包括t細胞，b細胞以及內皮細胞和上皮細胞，pdl2則僅表達于抗原呈遞細胞如樹突狀細胞和巨噬細胞。t細胞對清除病毒感染起著非常重要的作用，但t細胞抗病毒反應通常與免疫病理相關。pd-1在負調節t細胞的活化過程中起著非常重要的作用，pd-1介導的對t細胞負調節作用可減少促感染過程引起的組織損傷，但是阻斷或抑制pd-1的負調節作用可導致自身免疫性疾病，例如，pd-1基因敲除小鼠能更有效的清除胰腺病毒感染，但是卻導致了更嚴重的肝臟損傷(isaietal.,2003,j.exp.med.198:39-50)。另外，高表達pd-1的腫瘤伴隨著很難被檢測到的癌癥(hamanishietal.,2007,proc.natl.acad.sci.usa104:3360-5)。一種實施有效的方法是通過體內注射抗體對pd-1的表達進行調控。由于pd-1抗體的廣譜抗腫瘤前景和驚人的藥效，業界普遍認為針對pd-1通路的抗體將帶來治療多種腫瘤治療的突破性的進展：用于治療非小細胞性肺癌，腎細胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(hometm.b.,parisig.,etal.,anti-pd-1therapyinmelanoma.seminoncol.2015jun；42(3):466-473)，白血病以及貧血病(heldsa,heinea,etal.,advancesinimmunotherapyofchronicmyeloidleukemiacml.currcancerdrugtargets.2013sep；13(7):768-74)。在2012年和2013年的美國癌癥協會(aacr)年會以及美國臨床腫瘤協會(asco)年會上揭曉的前所未有的臨床藥效數據后，既成為全球制藥行業最炙手可熱的在研新藥。此外，干擾素γ(ifnγ)，主要由自然殺傷細胞(nk)，自然殺傷t細胞(nkt)先天產生，和由cd4th1細胞和cd8細胞毒性t淋巴細胞(ctl)這些效應t細胞經由特定抗原刺激后產生。ifnγ作為一種重要的先天性和獲得性免疫細胞因子在對抗或抑制腫瘤，病毒，某些細菌和原蟲性疾病感染起著重要作用。同時，ifnγ能激活巨噬細胞，誘導ⅱ類主要組織相容性復合體(mhc)的表達激活免疫反應控制腫瘤的發展(schoenbornjr,wilsoncb.regulationofinterferon-γduringinnateandadaptiveimmuneresponses.advancesinimmunology2007；96:41-101)。單克隆抗體目前已被用于治療癌癥，炎癥和感染性疾病和其它疾病，大部分是單特異性的，然而，有些疾病在成因上以及體內的影響因素通常是多方面的，包括在不同的信號通路中，不同的蛋白、細胞因子和受體等的上調或者下調，抑制或促進體內機能作用。因此，多種不同的因素阻斷可以改善治療效果。這可以通過組合不同的藥物，或者使用替代合不同藥物如采用多特異性抗體的多重靶向策略來實現。雙功能抗體亦稱為雙特異性抗體(bispecificantibody)，是同時靶向兩種不同抗原的特異性藥物，其可通過免疫分選純化生產。另外，也可通過基因工程獲得，基因工程在結合位點優化，合成形式的考量以及產量等方面都具有相應的靈活性，所以具有一定的優勢。目前，其存在形式已被證明有超過45種(müllerd,kontermannre.bispecificantibodiesforcancerimmunotherapy:currentperspectives.biodrugs2010；24:89-98)。目前已開發的多種雙特異性抗體為igg-scfv形式即morrison模式(1997colomamj,morrisonsl.designandproductionofnoveltetravalentbispecificantibodies.natbiotechnol.naturebiotechnology,1997；15:159-163)，由于這種類似于天然存在的igg形式，其在抗體工程、表達和純化上所具有的優勢，已被證明是雙功能抗體的其中一種理想存在形式(millerbr,demarestsj,etal.,stabilityengineeringofscfvsforthedevelopmentofbispecificandmultivalentantibodies.proteinengdessel2010；23:549-57；fitzgeraldj,lugovskoya.rationalengineeringofantibodytherapeuticstargetingmultipleoncogenepathways.mabs2011；3:299-309)。然而，目前市場上甚至還沒有靶向同一類細胞上兩個以上靶點的雙功能抗體，目前世界上有的是針對兩種不同細胞表面分子的抗體。需要開發同時抗pd-1和ctla4的雙功能抗體藥物。技術實現要素：本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，利用哺乳動物細胞表達系統分別表達出重組的ctla4和pd-1作為抗原免疫小鼠，經小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合獲得雜交瘤細胞。發明人通過進行對大量樣本的篩選，分別得到了如下的雜交瘤細胞株：雜交瘤細胞株lt002(ctla4-4g10)，其于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c201587；以及雜交瘤細胞株lt003(pd-1-14c12)，其于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c2015105。本發明人驚奇地發現：雜交瘤細胞株lt002能夠分泌產生與ctla4特異性結合的特異性單克隆抗體(命名為4g10)，并且該單克隆抗體能夠十分有效地阻斷ctla4與b7的結合；雜交瘤細胞株lt003能夠分泌產生與pd-1特異性結合的特異性單克隆抗體(命名為14c12)，并且該單克隆抗體能夠十分有效地阻斷pd-1與pdl1的結合。進一步地，本發明人創造性地制得了抗ctla4的人源化抗體(分別命名為4g10h1l1、4g10h3l3、4g10h4l3和8d2h14l2)和抗pd-1的人源化抗體(命名為14c12h1l1)。進一步地，本發明人創造性地將兩類人源化抗體進行蛋白重組融合成新的抗體，獲得了能夠結合ctla4和pd-1，阻斷ctla4與b7、pd-1與pdl1的結合的人源化雙功能抗體(分別命名為biab001、biab002、biab003、biab004、biab007和biab010)，能有效地結合人t細胞，并且激活t細胞，誘導人淋巴細胞分泌ifn-γ和il-2；具有用于制備防治肺癌、黑色素瘤、腎腫瘤、卵巢癌、白血病等癌癥的藥物的潛力。由此提供了下述發明：本發明的一個方面涉及一種雙特異性抗體，其包括：靶向pd-1的第一蛋白功能區，和靶向ctla4的第二蛋白功能區。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中，所述第一蛋白功能區和第二蛋白功能區直接連接或者通過連接片段連接；優選地，所述連接片段為(ggggs)n，n為正整數，例如1、2、3、4、5或6。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中，所述第一蛋白功能區和第二蛋白功能區獨立地為免疫球蛋白或其抗原結合片段，例如半抗體、fab、f(ab’)2或單鏈抗體；優選地，所述第一蛋白功能區為免疫球蛋白，所述第二蛋白功能區為單鏈抗體；或者優選地，所述第一蛋白功能區為單鏈抗體，所述第二蛋白功能區為免疫球蛋白。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中，所述第一蛋白功能區和第二蛋白功能區獨立地為1個、2個或者2個以上。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中，所述免疫球蛋白為igg、iga、igd、ige或igm；優選為igg，例如igg1、igg2、igg3或igg4。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中，所述單鏈抗體連接在免疫球蛋白的重鏈的c末端。由于免疫球蛋白由兩條重鏈，因此，一個免疫球蛋白分子連接有兩個單鏈抗體分子。優選地，兩個單鏈抗體分子相同。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中：所述的免疫球蛋白，其重鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:29－31的cdr，其輕鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr；和/或所述的單鏈抗體，其重鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:35－37的cdr或者包含氨基酸序列為seqidno:35、seqidno:41和seqidno:37的cdr或者包含氨基酸序列為seqidno:42－44的cdr，其輕鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr或者包含氨基酸序列為seqidno:45－47的cdr；在本發明的另一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中：所述的免疫球蛋白，其重鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:35－37的cdr或者包含氨基酸序列為seqidno:35、seqidno:41和seqidno:37的cdr或者包含氨基酸序列為seqidno:42－44的cdr，其輕鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr或者包含氨基酸序列為seqidno:45－47的cdr；和/或所述的單鏈抗體，其重鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:29－31的cdr，其輕鏈可變區包含氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中：所述免疫球蛋白的重鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:16和seqidno:20；所述免疫球蛋白的輕鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:18和seqidno:22；和/或所述單鏈抗體的重鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:2、seqidno:6、seqidno:10、seqidno:14和seqidno:25；所述單鏈抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:4、seqidno:8、seqidno:12和seqidno:27；在本發明的另一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中：所述免疫球蛋白的重鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:2、seqidno:6、seqidno:10、seqidno:14和seqidno:25；所述單鏈抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:4、seqidno:8、seqidno:12和seqidno:27；和/或所述單鏈抗體的重鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:16和seqidno:20；所述免疫球蛋白的輕鏈可變區的氨基酸序列選自seqidno:18和seqidno:22。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中，所述的免疫球蛋白包括非-cdr區，且所述非-cdr區來自不是鼠類的物種，例如來自人抗體。在本發明的一個實施方案中，所述免疫球蛋白的恒定區是人源化的，例如，重鏈恒定區均采用iggamma-1chaincregion，accession:p01857；輕鏈恒定區均采用igkappachaincregion，accession:p01834。在本發明的一個實施方案中，所述的雙特異性抗體，其中，所述的雙特異性抗體以小于大約10-5m，例如小于大約10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的kd結合ctla4蛋白和/或pd-1蛋白。本發明還涉及一種雙特異性抗體，其重鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:29－31的cdr、氨基酸序列為seqidno:35－37的cdr或者氨基酸序列為seqidno:35、seqidno:41和seqidno:37的cdr或者氨基酸序列為seqidno:42－44的cdr，和氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr或者氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr或者氨基酸序列為seqidno:45－47的cdr；并且其輕鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr，氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr，或者氨基酸序列為seqidno:45－47的cdr；優選地，輕鏈可變區的cdr與重鏈可變區包含的cdr不相同。本發明的另一方面涉及分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區的核酸序列，其中，所述抗體的重鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:29－31的cdr、氨基酸序列為seqidno:35－37的cdr或者氨基酸序列為seqidno:35、seqidno:41和seqidno:37的cdr或者氨基酸序列為seqidno:42－44的cdr，和氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr或者氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr或者氨基酸序列為seqidno:45－47的cdr。本發明還涉及分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區的核酸序列，其中，所述抗體輕鏈可變區包含：氨基酸序列為seqidno:32－34的cdr，氨基酸序列為seqidno:38－40的cdr，或者氨基酸序列為seqidno:45－47的cdr。本發明的再一方面涉及一種載體，其包本發明的分離的核酸分子。本發明的再一方面涉及一種宿主細胞，其包含本發明的分離的核酸分子，或者本發明的載體。本發明的再一方面涉及制備本發明的雙特異性抗體的方法，其包括在合適的條件下培養本發明的宿主細胞，以及從細胞培養物中回收所述雙特異性抗體的步驟。本發明的再一方面涉及偶聯物，其包括雙特異性抗體以及偶聯部分，其中，所述雙特異性抗體為本發明的雙特異性抗體，所述偶聯部分為可檢測的標記；具體地，所述偶聯部分為放射性同位素、熒光物質、發光物質、有色物質或酶。本發明的再一方面涉及試劑盒，其包括本發明的雙特異性抗體，或者包括本發明的偶聯物；具體地，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別所述雙特異性抗體；任選地，所述第二抗體還包括可檢測的標記，例如放射性同位素、熒光物質、發光物質、有色物質或酶。本發明的再一方面涉及本發明的雙特異性抗體在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測ctla4和/pd-1在樣品中的存在或其水平。本發明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發明的雙特異性抗體或者本發明的偶聯物；可選地，其還包括藥學上可接受的載體和/或賦形劑。本發明的再一方面涉及本發明的雙特異性抗體或者本發明的偶聯物在制備預防和/或治療和/或輔助治療和/或診斷腫瘤或者貧血病的藥物中的用途；具體地，所述腫瘤選自黑色素瘤、腎腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃腸道癌、肝癌、非小細胞性肺癌、卵巢癌和白血病。本發明的再一方面涉及本發明的雙特異性抗體或者本發明的偶聯物在制備如下藥物中的用途：檢測樣品中的ctla4水平的藥物，阻斷ctla4與b7結合的藥物，調節(例如下調)ctla4活性或ctla4水平的藥物，解除ctla4對機體免疫抑制的藥物，激活t淋巴細胞的藥物，或者提高t淋巴細胞中il-2表達的藥物；和/或阻斷pd1與pdl1結合的藥物，調節(例如下調)pd1活性或水平的藥物，解除pd1對機體免疫抑制的藥物，或者提高t淋巴細胞中ifn-γ表達的藥物。本發明的再一方面涉及一種在體內或體外方法，包括施加細胞以有效量的本發明的雙特異性抗體或者本發明的偶聯物的步驟，所述方法選自如下：檢測樣品中的ctla4水平的方法，阻斷ctla4與b7結合的方法，調節(下調)ctla4活性或ctla4水平的方法物，解除ctla4對機體免疫抑制的方法，激活t淋巴細胞的方法，或者提高t淋巴細胞中il-2表達的方法；和/或阻斷pd1與pdl1結合的方法，調節(例如下調)pd1活性或水平的方法，解除pd1對機體免疫抑制的方法，或者提高t淋巴細胞中ifn-γ表達的方法。本發明的體外實驗中，抗ctla4抗體、抗pd1抗體及抗ctla4-抗pd1雙功能抗體均能誘導ifnγ的分泌激活免疫反應。本發明的再一方面涉及一種預防和/或治療和/或輔助治療和/或診斷腫瘤的方法，包括給予受試者有效量的本發明中任一項所述的雙特異性抗體或者本發明的偶聯物的步驟；具體地，所述腫瘤選自黑色素瘤、腎腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃腸道癌、肝癌、非小細胞性肺癌、卵巢癌和白血病。根據本發明中任一項所述的雙特異性抗或者偶聯物，其用于預防和/治療和/或輔助治療和/或診斷腫瘤；具體地，所述腫瘤選自黑色素瘤、腎腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃腸道癌、肝癌、非小細胞性肺癌、卵巢癌和白血病。根據本發明中任一項所述的雙特異性抗體或者偶聯物，其用于：阻斷ctla4與b7結合，調節(例如下調)ctla4活性或ctla4水平，解除ctla4對機體免疫抑制的，或者激活t淋巴細胞的藥物或者提高t淋巴細胞中il-2表達；和/或阻斷pd1與pdl1結合，調節(例如下調)pd1活性或水平，解除pd1對機體免疫抑制，或者提高t淋巴細胞中ifn-γ表達。抗體治療藥物，特別是單克隆抗體(mab)已在多種疾病的治療中取得了良好的療效。獲取這些治療性抗體的傳統實驗方法是采用抗原免疫動物，在免疫動物體內獲取靶向抗原的抗體，或通過親和力成熟的方法來改進那些與抗原的親和力較低的抗體。然而，這些方法需要大量時間和精力，大多數時候也并不能針對抗原上的特定表位。輕鏈和重鏈的可變區決定抗原的結合；每條鏈的可變區均含有三個高變區，稱互補決定區(cdr)(重鏈(h)的cdr包含hcdr1、hcdr2、hcdr3，輕鏈(l)的cdr包含lcdr1、lcdr2、lcdr3；其由kabat等人命名，見sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition(1991),第1-3卷,nihpublication91-3242,bethesdamd)。通過本領域技術人員所熟知的技術手段，例如通過vbase2數據庫分析下面的(1)-(13)項中的單克隆抗體序列的cdr區的氨基酸序列，結果如下：(1)14c12重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:16所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:18所示。其重鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列如下：hcdr1:gfafssyd(seqidno:29)hcdr2:isgggryt(seqidno:30)hcdr3:anrygeawfay(seqidno:31)其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列如下：lcdr1:qdinty(seqidno:32)lcdr2:ran(seqidno:33)lcdr3:lqydefplt(seqidno:34)(2)14c12h1l1重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:20所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:22所示。其重鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與14c12相同。其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與14c12相同。(3)4g10重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:2所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:4所示；其重鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列如下：hcdr1:gysftgyt(seqidno:35)hcdr2:inpynnit(seqidno:36)hcdr3:arldyrsy(seqidno:37)其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列如下：lcdr1:tgavttsnf(seqidno:38)lcdr2:gtn(seqidno:39)lcdr3:alwysnhwv(seqidno:40)(4)4g10h1l1重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:6所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:8所示；其重鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與4g10相同。其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與4g10相同。(5)4g10h3l3重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:10所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:12所示；其重鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與4g10相同。其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與4g10相同。(6)4g10h4l3重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:14所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:12所示。其重鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列如下：hcdr1:gysftgyt(seqidno:35)hcdr2:inpyndit(seqidno:41)hcdr3:arldyrsy(seqidno:37)其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與4g10相同。(7)8d2h14l2重鏈可變區的氨基酸序如seqidno:25所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seqidno:27所示。其重鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列如下：hcdr1:gftfsdnw(seqidno:42)hcdr2:irnkpynyet(seqidno:43)hcdr3:taqfay(seqidno:44)其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列如下：lcdr1:eniygg(seqidno:45)lcdr2:gat(seqidno:46)lcdr3:qnvlrspftf(seqidno:47)(8)biab001其重鏈可變區的9個cdr區的氨基酸序列如下：hcdr1:gfafssyd(seqidno:29)hcdr2:isgggryt(seqidno:30)hcdr3:anrygeawfay(seqidno:31)hcdr4:gysftgyt(seqidno:35)hcdr5:inpynnit(seqidno:36)hcdr6:arldyrsy(seqidno:37)hcdr7:tgavttsnf(seqidno:38)hcdr8:gtn(seqidno:39)hcdr9:alwysnhwv(seqidno:40)其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列如下：lcdr1:qdinty(seqidno:32)lcdr2:ran(seqidno:33)lcdr3:lqydefplt(seqidno:34)(9)biab002其重鏈可變區的9個cdr區的氨基酸序列與biab001相同。其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與biab001相同。(10)biab003其重鏈可變區的9個cdr區的氨基酸序列與biab001相同。其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與biab001相同。(11)biab004其重鏈可變區的9個cdr區的氨基酸序列與biab001相同。其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與biab001相同。(12)biab007其重鏈可變區的9個cdr區的氨基酸序列如下：hcdr1:gfafssyd(seqidno:29)hcdr2:isgggryt(seqidno:30)hcdr3:anrygeawfay(seqidno:31)hcdr4:gysftgyt(seqidno:35)hcdr5:inpyndit(seqidno:41)hcdr6:arldyrsy(seqidno:37)hcdr7:tgavttsnf(seqidno:38)hcdr8:gtn(seqidno:39)hcdr9:alwysnhwv(seqidno:40)其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與biab001相同。(13)biab010其重鏈可變區的9個cdr區的氨基酸序列如下：hcdr1:gfafssyd(seqidno:29)hcdr2:isgggryt(seqidno:30)hcdr3:anrygeawfay(seqidno:31)hcdr4:gftfsdnw(seqidno:42)hcdr5:irnkpynyet(seqidno:43)hcdr6:taqfay(seqidno:44)hcdr7:eniygg(seqidno:45)hcdr8:gat(seqidno:46)hcdr9:qnvlrspftf(seqidno:47)其輕鏈可變區的3個cdr區的氨基酸序列與biab001相同。在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。如本文中所使用的，當提及ctla4蛋白(cytotoxict-lymphocyteantigen4)的氨基酸序列時，其包括ctla4蛋白的全長，或者ctla4的胞外片段ctla4ecd或者包含ctla4ecd的片段；還包括ctla4ecd的融合蛋白，例如與小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)進行融合的片段。然而，本領域技術人員理解，在ctla4蛋白的氨基酸序列中，可天然產生或人工引入突變或變異(包括但不限于置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學功能。因此，在本發明中，術語“ctla4蛋白”應包括所有此類序列，包括其天然或人工的變體。并且，當描述ctla4蛋白的序列片段時，其還包括其天然或人工變體中的相應序列片段。如本文中所使用的，當提及pd-1蛋白(programmedcelldeathprotein1,ncbigenbank:nm_005018)的氨基酸序列時，其包括pd-1蛋白的全長，或者pd-1的胞外片段pd-1ecd或者包含pd-1ecd的片段；還包括pd-1ecd的融合蛋白，例如與小鼠或人igg的fc蛋白片段(mfc或hfc)進行融合的片段。然而，本領域技術人員理解，在pd-1蛋白的氨基酸序列中，可天然產生或人工引入突變或變異(包括但不限于置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學功能。因此，在本發明中，術語“pd-1蛋白”應包括所有此類序列，包括其天然或人工的變體。并且，當描述pd-1蛋白的序列片段時，其還包括其天然或人工變體中的相應序列片段。如本文中所使用的，如果沒有特別說明，所述b7為b7-1和/或b7-2；其具體蛋白序列為現有技術中已知序列，可以參考現有文獻或者genbank中公開的序列。例如，b7-1(cd80,ncbigeneid:941)；b7-2(cd86,ncbigeneid:942)。如本文中所使用的，術語ec50是指半最大效應濃度(concentrationfor50％ofmaximaleffect)，是指能引起50％最大效應的濃度。如本文中所使用的，術語“抗體”是指，是指通常由兩對多肽鏈(每對具有一條“輕”(l)鏈和一條“重”(h)鏈)組成的免疫球蛋白分子。從一般意義上，重鏈可以理解為抗體中分子量較大的多肽鏈，輕鏈是指抗體中分子量較小的多肽鏈。輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈通常可分類為μ、δ、γ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為igm、igd、igg、iga和ige。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區通過大約12或更多個氨基酸的“j”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個氨基酸的“d”區。各重鏈由重鏈可變區(vh)和重鏈恒定區(ch)組成。重鏈恒定區由3個結構域(ch1、ch2和ch3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(vl)和輕鏈恒定區(cl)組成。輕鏈恒定區由一個結構域cl組成。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(c1q)的結合。vh和vl區還可被細分為具有高變性的區域(稱為互補決定區(cdr))，其間散布有較保守的稱為構架區(fr)的區域。各vh和vl由按下列順序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4從氨基末端至羧基末端排列的3個cdr和4個fr組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(vh和vl)分別形成抗體結合部位。氨基酸至各區域或結構域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定義。特別地，重鏈還可以包含3個以上cdr，例如6、9、或12個。例如在本發明的雙功能抗體中，重鏈可以是igg抗體的重鏈的c端連接另一個抗體的scfv，這種情況下重鏈含有9個cdr。術語“抗體”不受任何特定的產生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亞型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗體。如本文中所使用的，術語抗體的“抗原結合片段”是指包含全長抗體的片段的多肽，其保持特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為“抗原結合部分”。通常參見，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的。可通過重組dna技術或通過完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗體的抗原結合片段。在一些情況下，抗原結合片段包括fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互補決定區(cdr)片段、單鏈抗體(例如，scfv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。如本文中所使用的，術語“fd片段”意指由vh和ch1結構域組成的抗體片段；術語“fv片段”意指由抗體的單臂的vl和vh結構域組成的抗體片段；術語“dab片段”意指由vh結構域組成的抗體片段(ward等人,nature341:544-546(1989))；術語“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1結構域組成的抗體片段；術語“f(ab')2片段”意指包含通過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個fab片段的抗體片段。在一些情況下，抗體的抗原結合片段是單鏈抗體(例如,scfv)，其中vl和vh結構域通過使其能夠產生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子(參見，例如,bird等人,science242:423-426(1988)和huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988))。此類scfv分子可具有一般結構：nh2-vl-接頭-vh-cooh或nh2-vh-接頭-vl-cooh。合適的現有技術接頭由重復的ggggs氨基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接頭，但也可使用其變體(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本發明的其他接頭由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情況下，抗體的抗原結合片段是雙抗體，即，雙價抗體，其中vh和vl結構域在單個多肽鏈上表達，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對并且產生兩個抗原結合部位(參見，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:1121-1123(1994))。可使用本領域技術人員已知的常規技術(例如，重組dna技術或酶促或化學斷裂法)從給定的抗體獲得抗體的抗原結合片段(例如，上述抗體片段)，并且以與用于完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結合片段。在本文中，除非上下文明確指出，否則當提及術語“抗體”時，其不僅包括完整抗體，而且包括抗體的抗原結合片段。如本文中所使用的，術語“單抗”和“單克隆抗體”是指，來自一群高度同源的抗體分子中的一個抗體或抗體的一個片斷，也即除可能自發出現的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對抗原上的單一表位具有高特異性。多克隆抗體是相對于單克隆抗體而言的，其通常包含至少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識別抗原上的不同表位。單克隆抗體通常可采用kohler等首次報道的雜交瘤技術獲得(nature,256:495,1975)，但也可采用重組dna技術獲得(如參見u.s.p4,816,567)。如本文中所使用的，術語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一部分源自一個抗體(其可以源自某一特定物種或屬于某一特定抗體類或亞類)，且輕鏈或/和重鏈的另一部分源自另一個抗體(其可以源自相同或不同的物種或屬于相同或不同的抗體類或亞類)，但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。如本文中所使用的，術語“人源化抗體”是指，人源免疫球蛋白(受體抗體)的全部或部分cdr區被一非人源抗體(供體抗體)的cdr區替換后得到的抗體或抗體片段，其中的供體抗體可以是具有預期特異性、親和性或反應性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗體。此外，受體抗體的構架區(fr)的一些氨基酸殘基也可被相應的非人源抗體的氨基酸殘基替換，或被其他抗體的氨基酸殘基替換，以進一步完善或優化抗體的性能。關于人源化抗體的更多詳細內容，可參見例如，jonesetal.,nature,321:522525(1986)；reichmannetal.,nature,332:323329(1988)；presta,curr.op.struct.biol.,2:593596(1992)；和clark,immunol.today21:397402(2000)。如本文中所使用的，術語“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。“表位”在本領域內也稱為“抗原決定簇”。表位或抗原決定簇通常由分子的化學活性表面基團例如氨基酸或碳水化合物或糖側鏈組成并且通常具有特定的三維結構特征以及特定的電荷特征。例如，表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的氨基酸，其可以是“線性的”或“構象的”。參見，例如，epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。在線性表位中，蛋白質與相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用的點沿著蛋白質的一級氨基酸序列線性存在。在構象表位中，相互作用的點跨越彼此分開的蛋白質氨基酸殘基而存在。如本文中所使用的，術語“分離的”或“被分離的”指的是，從天然狀態下經人工手段獲得的。如果自然界中出現某一種“分離”的物質或成分，那么可能是其所處的天然環境發生了改變，或從天然環境下分離出該物質，或二者情況均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術語“分離的”或“被分離的”不排除混有人工或合成的物質，也不排除存在不影響物質活性的其它不純物質。如本文中所使用的，術語“大腸桿菌表達系統”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成的表達系統，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的菌株，例如但不限于：gi698,er2566,bl21(de3),b834(de3),blr(de3)。如本文中所使用的，術語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限于：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動物病毒等。可用作載體的動物病毒包括但不限于，逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)。一種載體可以含有多種控制表達的元件，包括但不限于，啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有復制起始位點。如本文中所使用的，術語“宿主細胞”是指，可用于導入載體的細胞，其包括但不限于，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細胞，如酵母細胞或曲霉菌等的真菌細胞，如s2果蠅細胞或sf9等的昆蟲細胞，或者如纖維原細胞，cho細胞，cos細胞，nso細胞，hela細胞，bhk細胞，hek293細胞或人細胞等的動物細胞。如本文中所使用的，術語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據時(例如，兩個dna分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據)，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目×100的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地進行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法來實現。還可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120權重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。此外，可使用已整合入gcg軟件包(可在www.gcg.com上獲得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩陣或pam250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權重來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。如本文中使用的，術語“特異性結合”是指，兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。在某些實施方式中，特異性結合某抗原的抗體(或對某抗原具有特異性的抗體)是指，抗體以小于大約10-5m，例如小于大約10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的親和力(kd)結合該抗原。在本發明的一些實施方案中，術語“靶向”是指特異性結合。如本文中所使用的，術語“kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，其用于描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。通常，抗體以小于大約10-5m，例如小于大約10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的解離平衡常數(kd)結合抗原，例如，如使用表面等離子體共振術(spr)在biacore儀中測定的。如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”和“單抗”具有相同的含義且可互換使用；術語“多克隆抗體”和“多抗”具有相同的含義且可互換使用；術語“多肽”和“蛋白質”具有相同的含義且可互換使用。并且在本發明中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。如本文中所使用的，術語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”可互換使用，并且當提及術語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”時，其還包括雜交瘤的亞克隆和后代細胞。例如，當提及雜交瘤細胞株lt002或lt003時，其還指雜交瘤細胞株lt002或lt003的亞克隆和后代細胞。如本文中所使用的，術語“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，ph調節劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如tween-80；離子強度增強劑包括但不限于氯化鈉。如本文中所使用的，術語“佐劑”是指非特異性免疫增強劑，當其與抗原一起或預先遞送入機體時，其可增強機體對抗原的免疫應答或改變免疫應答類型。佐劑有很多種，包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)、弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)、短小棒狀桿菌、脂多糖、細胞因子等。弗氏佐劑是目前動物試驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑則在臨床實驗中使用較多。如本文中所使用的，術語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預防疾病(例如ctla4與b7結合或者ctla4活性過高相關的疾病如腫瘤)有效量是指，足以預防，阻止，或延遲疾病(例如ctla4與b7結合或者ctla4活性過高相關的疾病如腫瘤)的發生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發癥的量。測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力范圍之內。例如，對于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。發明的有益效果本發明的單克隆抗體4g10h1l1、4g10h3l3能夠很好地特異性與ctla4結合，并且能夠十分有效地阻斷clta4與b7的結合，特異地解除ctla4對機體免疫抑制，激活t淋巴細胞。單克隆抗體14c12h1l1能夠很好地特異性與ctla4結合，并且能夠十分有效地阻斷clta4與b7的結合，特異地解除ctla4對機體免疫抑制，激活t淋巴細胞。附圖說明圖1:單克隆鼠源抗體4g10的sds-page檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依次為：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體，1μg；還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體，1μg；marker，5μl；bsa，1μg。圖2:單克隆人源化抗體4g10h1l1的sds-page檢測結果。從左至右的3個泳道的樣品及其上樣量依次為：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體，1μg；還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體，1μg；marker，5μl。圖3:單克隆人源化抗體4g10h3l3的sds-page檢測結果。從左至右的2個泳道的樣品及其上樣量依次為：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體，1μg；marker，5μl。圖4:單克隆人源化抗體14c12h1l1的sds-page檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依次為：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體，1μg；還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體，1μg；marker，5μl；bsa，1μg。圖5:雙功能抗體biab001的sds-page檢測結果。泳道樣品及其上樣量為：marker，5μl；1，non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；2，reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；3，bsa，1μg。圖6:雙功能抗體biab002的sds-page檢測結果。泳道樣品及其上樣量為：marker，5μl；1，non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；2，reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；3，bsa，1μg。圖7：雙功能抗體biab003的sds-page檢測結果。泳道樣品及其上樣量為：marker，5μl；1，non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；2，reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；3，bsa，1μg。圖8：雙功能抗體biab004的sds-page檢測結果。泳道樣品及其上樣量為：marker，5μl；1，non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；2，reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；3，bsa，1μg。圖9：雙功能抗體biab007的sds-page檢測結果。泳道樣品及其上樣量為：marker，5μl；1，non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；2，reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；3，bsa，1μg。圖10：雙功能抗體biab0010的sds-page檢測結果。泳道樣品及其上樣量為：marker，5μl；1，non-reduced：非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；2，reduced：還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品，1μg；3，bsa，1μg圖11：抗體4g10的動力學特征參數檢測結果。圖12：抗體4g10h1l1的動力學特征參數檢測結果。圖13：抗體4g10h3l3的動力學特征參數檢測結果。圖14：抗體4g10h4l3的動力學特征參數檢測結果。圖15：抗體14c12的動力學特征參數檢測結果。圖16：抗體14c12h1l1的動力學特征參數檢測結果。圖17：ctla4和抗體biab001的動力學特征參數檢測結果。圖18：ctla4和抗體biab002的動力學特征參數檢測結果。圖19：ctla4和抗體biab003的動力學特征參數檢測結果。圖20：ctla4和抗體biab004的動力學特征參數檢測結果。圖21：ctla4和抗體biab007的動力學特征參數檢測結果。圖22：pd-1和抗體biab001的動力學特征參數檢測結果。圖23：pd-1和抗體biab002的動力學特征參數檢測結果。圖24:pd-1和抗體biab003的動力學特征參數檢測結果。圖25:pd-1和抗體biab004的動力學特征參數檢測結果。圖26:pd-1和抗體biab007的動力學特征參數檢測結果。圖27：pd-1和抗體biab010的動力學特征參數檢測結果。圖28:采用間接elisa方法檢測抗體4g10h1l1和4g10h3l3與抗原ctla4的結合。圖29:采用競爭elisa方法檢測抗體4g10h1l1和4g10h3l3與b7競爭結合抗原ctla4的結合活性。圖30:采用間接elisa方法檢測抗體14c12、14c12h1l1與pd-1的結合。圖31:采用競爭elisa方法檢測抗體14c12、14c12h1l1與pdl1的競爭結合pd-1。圖32:采用間接elisa方法檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004與ctla4的結合。圖33:采用間接elisa方法檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004與pd-1的結合。圖34:采用競爭elisa方法檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004與b7競爭結合ctla4。圖35:采用競爭elisa方法檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004與pdl1競爭結合pd-1。圖36:抗體4g10h1l1與293t-ctla4細胞表面蛋白ctla4的結合ec50。圖37:抗體4g10h3l3與293t-ctla4細胞表面蛋白ctla4的結合ec50。圖38:抗體14c12h1l1與293t-pd-1細胞表面蛋白pd-1結合ec50。圖39:抗體biab001與293t-ctla4細胞表面蛋白ctla4結合ec50。圖40:抗體biab002與293t-ctla4細胞表面蛋白ctla4結合ec50。圖41:抗體biab003與293t-ctla4細胞的表面蛋白ctla4結合ec50。圖42:抗體biab004與293t-ctla4細胞的表面蛋白ctla4結合ec50。圖43:抗體biab001與293t-pd-1細胞的表面蛋白pd-1結合ec50。圖44:抗體biab002與293t-pd-1細胞的表面蛋白pd-1結合ec50。圖45:抗體biab003與293t-pd-1細胞的表面蛋白pd-1結合ec50。圖46:抗體biab004與293t-pd-1細胞的表面蛋白pd-1結合ec50。圖47:抗體4g10h3l3與t細胞表面抗原ctla4的結合活性。圖48:抗體14c12h1l1與t細胞表面抗原pd-1的結合活性。圖49:抗體biab003和biab004與t細胞的結合活性，并與抗體14c12h1l1和4g10h3l3進行對比。圖50:抗體4g10h1l1、4g10h3l3對混合淋巴細胞的細胞因子ifn-γ分泌的影響。圖51:抗體14c12h1l1對混合淋巴細胞的細胞因子ifn-γ分泌的影響。圖52:抗體biab001、biab002對混合淋巴細胞的細胞因子ifn-γ分泌的影響，并與抗體14c12h1l1、4g10h1l1進行對比。圖53:抗體biab003、biab004對混合淋巴細胞的細胞因子ifn-γ分泌的影響，并與抗體14c12h1l1、4g10h3l3進行對比。圖54:抗體4g10h3l3對混合淋巴細胞細胞因子il-2分泌的影響。圖55:抗體14c12h1l1對混合淋巴細胞的il-2分泌的影響。圖56:抗體biab003、biab004對混合淋巴細胞的細胞因子il-2分泌的影響，并與抗體14c12h1l1、4g10h3l3進行對比。圖57:抗體4g10h1l1和4g10h3l3對混合pbmc、mda-mb-231和raji細胞共培養所誘導的細胞因子il-2的分泌的影響。圖58:抗體14c12h1l1對混合pbmc、mda-mb-231和raji細胞共培養所誘導的細胞因子il-2的分泌的影響。圖59:抗體biab001、biab002、biab003、biab004對混合pbmc、mda-mb-231和raji細胞共培養所誘導的細胞因子il-2的分泌的影響，并與抗體4g10h1l1、4g10h3l3和14c12h1l1進行比較。關于生物材料保藏的說明：雜交瘤細胞株lt002(ctla4-4g10)，其于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c201587，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，郵編：430072。雜交瘤細胞株lt003(pd-1-14c12)，其于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c2015105，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，郵編：430072。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市場購買獲得的常規產品。在下面的實施例中，使用的t細胞來自中山康方生物醫藥有限公司；使用的balb/c小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心。實施例1：抗ctla4的抗體4g10的制備1.雜交瘤細胞株lt002的制備制備抗ctla4抗體所用的抗原ctla4-mfc是人ctla4(genbankid:np_005205.2)胞外區與鼠igg1fc的融合蛋白。取免疫balb/c小鼠(購自廣東醫學實驗動物中心)的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，參考目前已確立的方法(例如，stewart,s.j.,“monoclonalantibodyproduction”,inbasicmethodsinantibodyproductionandcharacterization,eds.g.c.howardandd.r.bethell,bocaraton:crcpress,2000)。用tev蛋白酶酶切融合蛋白ctla4-mfc，并過柱純化獲得ctla4蛋白。用ctla4蛋白作為抗原包被酶標板，進行間接elisa法篩選，得到分泌與ctla4特異性結合的新的抗體的雜交瘤細胞。對間接elisa篩選得到的雜交瘤細胞，通過競爭elisa篩選出能夠分泌與配體b7-1(cd80,ncbigeneid:941)、b7-2(cd86,ncbigeneid:942)競爭結合ctla4的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并經過有限稀釋法得到穩定的雜交瘤細胞株。將該雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株lt002(ctla4-4g10)，其分泌的單克隆抗體命名為4g10。雜交瘤細胞株lt002(ctla4-4g10)，其于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c201587，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，郵編：430072。2.抗ctla4的抗體4g10的制備用含10％的低igg胎牛血清的imdm培養基對上面制得的lt002細胞株進行培養(imdm培養基，內含1％青鏈霉素，于5％co2，37℃細胞培養箱中進行培養)，7天后收集細胞培養上清，通過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾以及hitrapproteinahp柱進行純化，制得抗體4g10。純化后4g10樣品進行sds-page電泳檢測，結果如圖1所示。實施例2：抗ctla4的抗體4g10的序列分析抗體4g10的序列分析按照培養細胞細菌總rna提取試劑盒(tiangen，貨號dp430)的方法，從實施例1中培養的lt002細胞株中提取mrna。按照invitrogeniiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr試劑盒說明書合成cdna，并進行pcr擴增。pcr擴增產物直接進行ta克隆，具體操作參考peasy-t1cloningkit(transgenct101)試劑盒說明書進行。將ta克隆的產物直接進行測序，測序結果如下：重鏈可變區的核酸序列：(372bp)caggtcaagctgcaggagtctggacctgagctggtgaagcctggagcttcaatgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagccatggaaagaaccttgaatggattggacttattaatccttacaataatattactaactacaaccagaagttcatgggcaaggccacatttactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggaactcctcagactgacatctgaagactctggagtctatttctgtgcaagactcgactataggtcttattggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacgacacccccatctgtctat(seqidno:1)其編碼的氨基酸序列：(124aa)qvklqesgpelvkpgasmkisckasgysftgytmnwvkqshgknlewiglinpynnitnynqkfmgkatftvdkssstaymellrltsedsgvyfcarldyrsywgqgtlvtvsaakttppsvy(seqidno:2)輕鏈可變區的核酸序列：(378bp)caggctgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaagtactggggctgttacaactagtaactttgccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactagtctaataggtggtaccaacaaccgagctccaggtgttcctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggcacagactgaggatgaggcaatatatttctgtgctctatggtacagcaaccattgggtgttcggtggaggaaccaaactgactgtcctaggccagcccaagtcttcgccatcagtcaccctgtttcaagggcaattctgc(seqidno:3)其編碼的氨基酸序列：(126aa)qavvtqesalttspgetvtltcrsstgavttsnfanwvqekpdhlftsliggtnnrapgvparfsgsligdkaaltitgaqtedeaiyfcalwysnhwvfgggtkltvlgqpksspsvtlfqgqfc(seqidno:4)實施例3：抗ctla4的人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3和4g10h4l3的設計和制備1.抗ctla4人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3和4g10h4l3的輕鏈和重鏈序列的設計根據ctla4蛋白的三維晶體結構(nat.struct.biol.(1997)4p.527)以及實施例2獲得的抗體4g10的序列，通過計算機模擬抗體模型，根據模型設計突變，得到抗體44g10h1l1、4g10h3l3和4g10h4l3的可變區序列(抗體恒定區序列，來自ncbi的數據庫，重鏈恒定區為iggamma-1chaincregion，accession:p01857，輕鏈恒定區為igkappachaincregion，accession:p01834)。設計的可變區序列如下：(1)人源化單克隆抗體4g10h1l1的重鏈和輕鏈序列重鏈可變區的核酸序列：(345bp)caggtgcagctggtggagtctggggccgagctggtgaagcccggcgcctccatgaagatctcttgcaaggccagcggatacagtttcactggctataccatgaactgggtcaaacaggctccaggacagggactggagtggatcgggctgattaatccttacaacaacatcaccaactacaaccagaagttcatgggaaaagcaacctttacagtggacaagagcatttccacagcctacatggaactgagccggctgacttcagacgatagcggggtctatttttgtgcaaggctggattatcgctcttactgggggcagggaactctggtcactgtctccgct(seqidno:5)其編碼的氨基酸序列：(115aa)qvqlvesgaelvkpgasmkisckasgysftgytmnwvkqapgqglewiglinpynnitnynqkfmgkatftvdksistaymelsrltsddsgvyfcarldyrsywgqgtlvtvsa(seqidno:6)輕鏈可變區的核酸序列：(327bp)caggctgtcgtcactcaggaaccttcactgactgtgagcccaggaggaactgtcaccctgacatgcggaagctccaccggagcagtgaccacatccaacttcgccaattgggtccaggaaaagccaggccaggcatttcgatccctgatcggaggcacaaacaatcgggcttcttgggtgcccgcaagattctcaggaagcctgctggggggaaaagccgctctgaccattagtggcgctcagcctgaggacgaagccgagtacttctgcgctctgtggtatagcaaccactgggtgtttggcgggggaacaaagctgactgtgctg(seqidno:7)其編碼的氨基酸序列：(109aa)qavvtqepsltvspggtvtltcgsstgavttsnfanwvqekpgqafrsliggtnnraswvparfsgsllggkaaltisgaqpedeaeyfcalwysnhwvfgggtkltvl(seqidno:8)(2)人源化單克隆抗體4g10h3l3的重鏈和輕鏈序列重鏈可變區的核酸序列：(345bp)caggtgcagctggtcgagtctggggccgaagtgaagaaacccggcgcctcagtgaaggtcagctgcaaggccagcgggtacagtttcactggatataccatgaactgggtccgacaggcccctggccaggggctggagtggatcggcctgattaacccttacaacaacatcactaactacgcacagaagttccaggggagagtgacctttacagtggacaccagcatttccacagcctacatggaactgtcccggctgagatctgacgatacaggcgtgtacttctgcgctaggctggattaccgcagctattggggacagggcacactggtgactgtcagcgca(seqidno:9)其編碼的氨基酸序列：(115aa)qvqlvesgaevkkpgasvkvsckasgysftgytmnwvrqapgqglewiglinpynnitnyaqkfqgrvtftvdtsistaymelsrlrsddtgvyfcarldyrsywgqgtlvtvsa(seqidno:10)輕鏈可變區的核酸序列：(327bp)caggctgtcgtcactcaggaaccttcactgaccgtgtctcctggcgggactgtcaccctgacatgcggcagctccacaggggccgtgaccacaagtaacttcccaaattgggtccagcagaagccaggacaggctccccggagtctgatcggaggcaccaacaacaaggccagctggacacccgcacggttcagcggcagcctgctgggcggcaaggccgctctgacaattagcggagcccagcctgaggacgaagccgagtactattgcgctctgtggtactccaaccactgggtgttcggcggcggcaccaagctgactgtgctg(seqidno:11)其編碼的氨基酸序列：(109aa)qavvtqepsltvspggtvtltcgsstgavttsnfpnwvqqkpgqaprsliggtnnkaswtparfsgsllggkaaltisgaqpedeaeyycalwysnhwvfgggtkltvl(seqidno:12)(3)人源化單克隆抗體4g10h4l3的重鏈和輕鏈序列重鏈可變區的核酸序列：(345bp)caggtgcagctggtcgagtctggggccgaagtgaagaaacccggcgcctcagtgaaggtcagctgcaaggccagcgggtacagtttcactggatataccatgaactgggtccgacaggcccctggccaggggctggagtggatcggcctgattaacccttacaacgacatcactaactacgcacagaagttccaggggagagtgacctttacagtggacaccagcatttccacagcctacatggaactgtcccggctgagatctgacgatacaggcgtgtacttctgcgctaggctggattaccgcagctattggggacagggcacactggtgactgtcagcgca(seqidno:13)其編碼的氨基酸序列：(115aa)qvqlvesgaevkkpgasvkvsckasgysftgytmnwvrqapgqglewiglinpynditnyaqkfqgrvtftvdtsistaymelsrlrsddtgvyfcarldyrsywgqgtlvtvsa(seqidno:14)輕鏈可變區的核酸序列同4g10h3l3的輕鏈可變區序列。2.人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3和4g10h4l3的制備重鏈恒定區均采用iggamma-1chaincregion，accession:p01857；輕鏈恒定區均采用igkappachaincregion，accession:p01834。將4g10h1l1重鏈cdna和輕鏈的cdna、4g10h3l3的重鏈cdna和輕鏈的cdna、以及4g10h4l3重鏈cdna和輕鏈的cdna，分別克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)載體中，分別獲得puc57simple-4g10h1、puc57simple-4g10l1；puc57simple-4g10h3、puc57simple-4g10l3；和puc57simple-4g10h4、puc57simple-4g10l3。并分別亞克隆到pcdna3.1載體中。將重組質粒轉染293f細胞后收集培養液進行純化獲得人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3和4g10h4l3。純化后4g10h1l1樣品進行sds-page電泳檢測，結果如圖2所示。純化后4g10h3l3樣品進行sds-page電泳檢測，結果如圖3所示。實施例4：抗pd-1的抗體14c12的制備1.雜交瘤細胞株lt003的制備用pd-1-mfc融合蛋白作為抗原，取免疫balb/c小鼠(購自廣東醫學實驗動物中心)的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，參考目前已確立的方法(例如，stewart,s.j.,“monoclonalantibodyproduction”,inbasicmethodsinantibodyproductionandcharacterization,eds.g.c.howardandd.r.bethell,bocaraton:crcpress,2000)。用pd-1-mfc作為抗原包被酶標板，進行間接elisa法篩選，得到分泌與pd-1特異性結合的新的抗體的雜交瘤細胞。通過競爭elisa篩選出能夠分泌與配體pdl1-hfc(pdl1genbankid:np_054862.1)競爭結合pd-1的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，經過有限稀釋法得到穩定的雜交瘤細胞株，并經過有限稀釋法得到lt003穩定細胞株(pd-1-14c12)，其分泌的單克隆抗體命名為14c12。雜交瘤細胞株lt003(pd-1-14c12)，其于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno:c2015105，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，郵編：430072。2.抗pd-1的抗體14c12的制備用含10％的低igg胎牛血清的imdm培養基對上面制得的lt003細胞株進行培養(imdm培養基，內含1％青鏈霉素，于5％co2，37℃細胞培養箱中進行培養)，7天后收集細胞培養上清進行純化，制得抗體14c12。實施例5：抗體14c12的序列的獲得抗體14c12的序列的獲得按照培養細胞細菌總rna提取試劑盒(tiangen，貨號dp430)的方法，從實施例4制得的雜交瘤細胞株lt003中提取mrna。按照invitrogeniiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr試劑盒說明書合成cdna，并進行pcr擴增。pcr擴增產物直接進行ta克隆，具體操作參考peasy-t1cloningkit(transgenct101)試劑盒說明書進行。將ta克隆的產物直接進行測序，測序結果如下：重鏈可變區的核酸序列：(354bp)gaggtcaaactggtggagagcggcggcgggctggtgaagcccggcgggtcactgaaactgagctgcgccgcttccggcttcgcctttagctcctacgacatgtcatgggtgaggcagacccctgagaagcgcctggaatgggtcgctactatcagcggaggcgggcgatacacctactatcctgactctgtcaaagggagattcacaattagtcgggataacgccagaaatactctgtatctgcagatgtctagtctgcggtccgaggatacagctctgtactattgtgcaaaccggtacggcgaagcatggtttgcctattggggacagggcaccctggtgacagtctctgcc(seqidno:15)其編碼的氨基酸序列：(118aa)evklvesggglvkpggslklscaasgfafssydmswvrqtpekrlewvatisgggrytyypdsvkgrftisrdnarntlylqmsslrsedtalyycanrygeawfaywgqgtlvtvsa(seqidno:16)輕鏈可變區的核酸序列：(318bp)gacattaagatgacacagtccccttcctcaatgtacgctagcctgggcgagcgagtgaccttcacatgcaaagcatcccaggacatcaacacatacctgtcttggtttcagcagaagccaggcaaaagccccaagaccctgatctaccgggccaatagactggtggacggggtccccagcagattctccggatctggcagtgggcaggattactccctgaccatcagctccctggagtatgaagacatgggcatctactattgcctgcagtatgatgagttccctctgacctttggagcaggcacaaaactggaactg(seqidno:17)其編碼的氨基酸序列：(106aa)dikmtqspssmyaslgervtftckasqdintylswfqqkpgkspktliyranrlvdgvpsrfsgsgsgqdysltissleyedmgiyyclqydefpltfgagtklel(seqidno:18)實施例6：抗pd-1的人源化抗體14c12h1l1的設計、制備和檢測1.人源化抗體14c12h1l1的輕鏈和重鏈序列的設計根據pd-1蛋白的三維晶體結構(shinoharat,etal.,structureandchromosomallocalizationofthehumanpd-1gene(pdcd1).genomics1995,23(3):704–6)以及實施例5獲得的抗體14c12的序列，通過計算機模擬抗體模型，根據模型設計突變，得到抗體14c12h1l1的可變區序列。設計的可變區序列如下：重鏈可變區的核酸序列：(354bp)gaagtgcagctggtcgagtctgggggagggctggtgcagcccggcgggtcactgcgactgagctgcgcagcttccggattcgcctttagctcctacgacatgtcctgggtgcgacaggcaccaggaaagggactggattgggtcgctactatctcaggaggcgggagatacacctactatcctgacagcgtcaagggccggttcacaatctctagagataacagtaagaacaatctgtatctgcagatgaacagcctgagggctgaggacaccgcactgtactattgtgccaaccgctacggggaagcatggtttgcctattgggggcagggaaccctggtgacagtctctagt(seqidno:19)其編碼的氨基酸序列：(118aa)evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafssydmswvrqapgkgldwvatisgggrytyypdsvkgrftisrdnsknnlylqmnslraedtalyycanrygeawfaywgqgtlvtvss(seqidno:20)輕鏈可變區的核酸序列：(321bp)gacattcagatgactcagagcccctcctccatgtccgcctctgtgggcgacagggtcaccttcacatgccgcgctagtcaggatatcaacacctacctgagctggtttcagcagaagccagggaaaagccccaagacactgatctaccgggctaatagactggtgtctggagtcccaagtcggttcagtggctcagggagcggacaggactacactctgaccatcagctccctgcagcctgaggacatggcaacctactattgcctgcagtatgatgagttcccactgacctttggcgccgggacaaaactggagctgaag(seqidno:21)其編碼的氨基酸序列：(107aa)diqmtqspssmsasvgdrvtftcrasqdintylswfqqkpgkspktliyranrlvsgvpsrfsgsgsgqdytltisslqpedmatyyclqydefpltfgagtklelk(seqidno:22)2.人源化抗體14c12h1l1的制備和sds-page電泳檢測重鏈恒定區采用iggamma-1chaincregion，accession:p01857；輕鏈恒定區采用igkappachaincregion，accession:p01834。將14c12h1l1的重鏈cdna和輕鏈的cdna分別克隆到pcdna3.1載體中，獲得抗體14c12h1l1的重組表達質粒。將重組質粒轉染293f細胞。將293f細胞培養液純化后進行檢測。結果如圖4所示，還原型蛋白樣品目標蛋白大約在24.5kd和49kd處，非還原型蛋白樣品目標蛋白大約在147kd處。實施例7：雙功能抗體biab001、biab02、biab03、biab04、biab007及biab010的重鏈和輕鏈的序列設計、表達和檢測1.序列設計本發明中之雙功能抗體biab001、biab02、biab03、biab04、biab007以及biab010的結構模式屬于morrison模式(igg-scfv)，即在一個igg抗體的兩條重鏈的c端均連接另一個抗體的scfv片段，其重鏈和輕鏈的主要組成設計如下面的表1。表1：biab001、biab02、biab03、biab04、biab007及biab010的重鏈和輕鏈的組成設計上面的表1中:(1)右下角標注“v”的，是指相應重鏈的可變區或者相應輕鏈的可變區。沒有標注“v”的，相應重鏈或者輕鏈為包含恒定區的全長。這些可變區或者全長的氨基酸序列及其編碼核酸序列均參照上面的實施例中記載的相應序列。(2)linker1的氨基酸序列為(ggggs)3(seqidno:23)linker2的氨基酸序列為(ggggs)4(seqidno:24)(3)8d2h14l2的重鏈可變區(8d2h14v)的氨基酸序列：evqlvesggglvqpggssrlscaasgftfsdnwmnwvrqapgkglewlaqirnkpynyetyysasvkgrftisrddsknsvylqmnslktedtgvyyctaqfaywgqgtlvtvss(seqidno:25)編碼8d2h14v的核酸序列：gaggtgcagctggtcgaatctggaggaggactggtgcagcctggaggaagctcccggctgtcatgtgccgctagcggcttcaccttttccgacaactggatgaattgggtgcgacaggcaccaggcaaaggactggagtggctggctcagatccggaacaagccctacaattatgaaacatactatagcgcctccgtgaaaggccggttcactattagtagagacgattctaagaacagcgtgtacctgcagatgaatagcctgaagacagaggatactggcgtctactattgcacagcacagtttgcctattggggacagggcaccctggtgacagtctctagt(seqidno:26)(4)8d2h14l2的輕鏈可變區(8d2l2v)的氨基酸序列：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrtseniygglnwyqrkpgkspklliygatnlasgvssrfsgsgsgtdytltisslqpedvatyycqnvlrspftfgsgtkleik(seqidno:27)編碼8d2l2v的核酸序列：gacatccagatgactcagagcccctcaagcctgtctgcaagtgtgggcgatagggtcaccatcacatgtcgcacctccgaaaacatctacgggggactgaattggtatcagcgcaagcccggcaaatcccctaagctgctgatctacggcgctaccaacctggcatctggggtgtcctctcgattttcagggagcggcagcggcaccgactatactctgaccattagttcactgcagcctgaggatgtggccacatactattgccagaatgtcctgagatcaccattcacttttgggagcggaaccaaactggaaattaag(seqidno:28)2.抗體biab001的表達和純化分別將biab001的重鏈cdna序列和輕鏈的cdna序列克隆到puc57simple(金斯瑞公司提供)載體中，分別獲得puc57simple-biab001h和puc57simple-biab001l質粒。分別將質粒puc57simple-biab001h和puc57simple-biab001l進行酶切(hindiii&ecori)，電泳回收得到的重鏈輕鏈分別亞克隆到pcdna3.1載體中，提取重組質粒共轉染293f細胞。細胞培養7天后，將培養液通過高速離心、上清濃縮后上樣至hitrapmabselectsure柱，用elutionbuffer一步洗脫蛋白并回收目標樣品并換液至pbs。將純化后的樣品分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸后進行sds-page電泳檢測。biab001的電泳圖如圖5所示，還原型蛋白樣品目標蛋白在23.6kd和75.8kd處，非還原型蛋白樣品(單個抗體)目標蛋白在199kd處。3.抗體biab002、biab003、biab004、biab007和biab010的表達和純化按照上述biab001的表達和純化方法獲得純化的抗體biab002，biab003、biab004、biab007和biab010。將純化后的樣品分別加入還原型蛋白電泳上樣緩沖液和非還原型蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸后進行sds-page電泳檢測。biab002、biab003、biab004、biab007和biab010的電泳圖分別如圖6、圖7、圖8、圖9和圖10所示，還原型蛋白樣品目標蛋白在23.6kd和75.8kd處，非還原型蛋白樣品(單個抗體)目標蛋白在199kd處。實施例8：抗體的動力學參數測定使用fortebio分子相互作用儀測定抗原抗體結合的動力學參數。1.抗體4g10及其人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3、4g10h4l3與抗原ctla4結合的動力學參數測定1.1.用tev蛋白酶酶切ctla4-mfc蛋白，并過柱純化獲得ctla4抗原。1.2.抗體4g10采用氨基偶聯的方式固定于ar2g傳感器表面，經乙醇胺封閉，于pbst中平衡后，與抗原ctla4結合，ctla4用pbst兩倍稀釋，濃度為268.1,134.1,67,33.5,16.8,8.38,4.19,0nm，于pbst中解離。人源化4g10h1l1、4g10h3l3、4g10h4l3的檢測方法與4g10類似，抗原濃度為180、90、45、22.5、11.25、5.625、2.813、0nm。1.3抗體4g10及其人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3、4g10h4l3與抗原結合的動力學參數檢測結果如下表1，動力學特征參數檢測結果分別如圖11、圖12、圖13和圖14所示。2.抗體14c12及其人源化抗體14c12h1l1與抗原pd-1結合的動力學參數測定2.1.用tev蛋白酶酶切pd-1-mfc蛋白，并過柱純化獲得pd-1抗原。2.2.抗原pd-1(抗原濃度為1μg/ml)經生物素標記后固定于sa傳感器表面，于pbst中平衡后，分別與抗體14c12和14c12h1l1結合，抗體用pbst從200nm往下三倍稀釋，于pbst中解離。2.3抗體14c12和14c12h1l1與抗原結合的動力學參數檢測結果如下表1，動力學特征參數檢測結果分別如圖15，圖16所示。3.抗體biab001、biab002、biab003、biab004、biab007和biab010與抗原ctla4結合的動力學參數測定3.1使用抗原ctla4(抗原濃度為1μg/ml)經生物素標記后固定于sa傳感器表面，于pbst中平衡后，分別與抗體biab001、biab002、biab003、biab004、biab007和biab010結合，抗體用pbst從200nm往下三倍稀釋，于pbst中解離。3.2抗體biab001、biab002、biab003、biab004、biab007和biab010與抗原ctla4結合的動力學參數檢測結果如下表1，動力學特征參數檢測結果分別如圖17－圖21所示。4.抗體biab001、biab002、biab003、biab004、biab007和biab010與抗原pd-1結合的動力學參數測定4.1使用抗原pd-1(抗原濃度為1μg/ml)經生物素標記后固定于sa傳感器表面，于pbst中平衡后，分別與抗體biab001、biab002、biab003、biab004、biab007和biab010結合，抗體用pbst從200nm往下三倍稀釋，于pbst中解離。4.2抗體biab001、biab002、biab003、biab004、biab007和biab010與抗原pd-1結合的動力學參數檢測結果如下表2，動力學特征參數檢測結果分別如圖22－圖27所示。表2：抗原抗體結合動力學參數kd為親和力常數；kon為抗原抗體結合速率；kdis為抗原抗體解離速率；kd＝kdis/kon。結果表明：抗體4g10及其人源化抗體均與抗原有較好的親和力。14c12和14c12h1l1與抗原pd-1均有較好的親和力。雙功能抗體均具有與抗原ctla4和pd-1較好的親和力。實施例9：elisa方法檢測抗體與抗原的結合活性1.人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3與抗原ctla4的結合活性1.1采用間接elisa方法分別測定人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3與ctla4的結合活性。酶標板中加入抗原孵育，4℃過夜，用1％的bsa37℃封閉2h后，分別加入抗體，37℃孵育30min，加入hrp標記羊抗人igg(h+l)二抗(jackson，109-035-088)，用tmb(neogen，308177)進行顯色反應5min，并在酶標儀中檢測450nm波長吸光度。檢測結果如圖28所示。由圖可見，人源化抗體4g10h1l1、4g10h3l3能有效地結合ctla4蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表3。通過對結合的抗體進行熒光定量分析，曲線模擬計算獲得抗體4g10h1l1、4g10h3l3的結合效率ec50分別為0.048和0.067nm。表3：間接elisa檢測4g10h1l1、4g10h3l3與ctla4的結合1.2.采用競爭elisa方法分別檢測人源化抗體4g10h1l1，4g10h3l3與b7競爭結合抗原ctla4的結合活性用b7/1-hfc(b7/1genbankid:np_005182.1)包被酶標板4℃過夜，1％bsa封閉2h后加入抗體分別和ctla4-mfc的抗原抗體混合液(稀釋濃度見表4)，37℃孵育30min后加入酶標二抗孵育1h，37℃孵育30min。在酶標儀上檢測450nm的吸光值(見表4)。檢測抗體與與b7-1競爭結合抗原ctla4的結果如圖29所示。由圖可見，抗體4g10h1l1和4g10h3l3能有效地與b7-1競爭結合ctla4蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表4。通過對結合的抗體4g10h1l1和4g10h3l3進行熒光定量分析，曲線模擬結合效率ec50分別為1.297nm和1.229nm。表4：競爭elisa檢測4g10h1l1、4g10h3l3與b7競爭結合人ctla4的結合效率2.elisa方法檢測單克隆抗體14c12及其人源化抗體14c12h1l1與抗原pd-1的結合活性2.1.采用間接elisa方法分別測定單克隆重組抗體14c12和14c12h1l1分別與pd-1的結合活性，方法具體如下：酶標板中加入pd-1-mfc孵育，4℃過夜，用1％的bsa37℃封閉2h后，分別加入抗體，37℃孵育30min，加入hrp標記羊抗人igg(h+l)二抗(jackson，109-035-088)，用tmb(neogen，308177)進行顯色反應5min，并在酶標儀中檢測450nm波長吸光度。檢測抗體14c12，14c12h1l1與抗原pd-1結合結果如圖30所示。由圖可見，抗體14c12和14c12h1l1均能有效地結合pd-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表5。通過對結合的抗體14c12和14c12h1l1進行熒光定量分析，曲線模擬14c12和14c12h1l1抗體的結合效率ec50分別為0.175nm和0.043nm。表5：抗體14c12和14c12h1l1分別與pd-1的結合(間接elisa)2.2.采用競爭elisa方法分別測定雜交瘤細胞產生的單克隆抗體14c12及人源化抗體14c12h1l1與pdl1的競爭結合抗原pd-1，方法具體如下：用pd-1-hfc或pd-1-mfc包被酶標板4℃過夜，1％bsa封閉2h后，分別將不同濃度的抗體14c12和14c12h1l1與pdl1-hfc和pdl1-mfc混合10min(稀釋濃度見表6)，37℃孵育30min后加入酶標二抗37℃孵育30min。在酶標儀上檢測450nm的吸光值(見表6)。檢測抗體14c12及人源化抗體14c12h1l1與抗原pd-1結合結果如圖31所示。由圖可見，14c12及人源化抗體14c12h1l1均能有效地與pdl1競爭結合pd-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表6。通過對結合的抗體14c12及人源化抗體14c12h1l1進行熒光定量分析，曲線模擬抗體14c12及14c12h1l1的結合效率ec50分別為：0.853nm和0.37nm。表6：抗體14c12及14c12h1l1與pdl1競爭結合pd-1elisa3.elisa方法檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004與抗原的結合活性3.1.間接elisa方法分別測定抗體biab001、biab002、biab003和biab004分別與抗原ctla4的結合活性，方法參照本實施例中1.1。檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004與抗原pd-1結合結果如圖32所示。由圖可見，抗體biab001、biab002、biab003和biab004均能有效地結合pd-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表7。通過對結合的抗體biab001、biab002、biab003和biab004進行熒光定量分析，曲線模擬抗體的結合效率ec50，如下表7所示。表7：雙功能抗體分別與ctla4的結合(間接elisa)3.2.間接elisa方法分別測定抗體biab001、biab002、biab003和biab004分別與抗原pd-1的結合活性，方法參照本實施例中2.1。檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004與抗原pd-1結合結果如圖33所示。由圖可見，抗體biab001、biab002、biab003和biab004均能有效地結合pd-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表7。通過對結合的抗體biab001、biab002、biab003和biab004進行熒光定量分析，曲線模擬抗體的結合效率ec50，如下表8所示。表8：雙功能抗體與ctla4的結合(間接elisa)3.3競爭elisa方法分別測定抗體biab001、biab002、biab003和biab004與b7/1-hfc的競爭結合抗原ctla4，方法參照本實施例中1.2。檢測結果如圖34所示。由圖可見，抗體biab001、biab002、biab003和biab004均能有效地結合抗原ctla4，抑制ctla4結合b7/1，并且抗體抑制ctla4結合b7/1的效率呈劑量依賴關系，各劑量的吸光強度見表9。通過對結合的抗體biab001、biab002、biab003和biab004進行吸光強度定量分析，曲線模擬抗體的結合效率獲得結合ec50(表9)。表9：競爭elisa檢測抗體與b7/1-hfc競爭結合抗原ctla43.4.競爭elisa方法分別測定抗體biab001、biab002、biab003和biab004與pdl1的競爭結合抗原pd-1，方法同本實施例中2.2。檢測結果如圖35所示。由圖可見，抗體biab001、biab002、biab003和biab004均能有效地結合抗原pd-1，抑制pd-1結合其配體pdl1，并且抗體抑制pd-1結合其配體pdl1的效率呈劑量依賴關系，各劑量的吸光強度見表10。通過對結合的抗體biab001、biab002、biab003和biab004進行吸光強度定量分析，曲線模擬抗體的結合效率獲得結合ec50(表10)。表10：競爭elisa檢測雙功能抗體與pdl1的競爭結合pd-1實施例10：流式細胞儀方法檢測抗體與細胞表面抗原的結合活性首先分別構建表達ctla4、pd-1抗原的宿主細胞293t，用本發明中制備的人源化抗體分別對改宿主細胞進行標記。然后采用流式細胞術分析驗證抗體對細胞表面天然構象的抗原特異性的結合能力。1.分別表達ctla4、pd-1抗原的宿主細胞293t的構建ctla4或pd-1的載體plenti6.3-ctla4、plenti6.3-pd-1(載體plenti6.3購自invitrogen公司)轉染293t細胞，經篩選分別獲得穩定表達ctla4的克隆群體293t-ctla4細胞和穩定表達pd-1的克隆群體293t-pd-1細胞。2.抗體對細胞表面抗原的結合檢測方法采用常規胰酶消化方法上述步驟獲得的表達抗原的宿主細胞，并使每個收集管細胞數為2×105，用pbs(1％bsa)配制抗體濃度梯度稀釋液，冰上與表達相應抗原的293t細胞孵育2小時，每管加入100μlfitc羊抗人igg(1：500)冰上孵育1小時用pbs洗3次后加入300μlpbs重懸細胞，在流式細胞儀上用fitc通道檢測熒光信號。2.1抗體對細胞表面抗原的結合檢測結果人源化抗體4g10h1l1和4g10h3l3與293t-ctla4細胞的結合結果分別如圖36、圖37所示。由圖可見，4g10h1l1和4g10h3l3抗體能有效地結合宿主細胞293t-ctla4表面的靶標ctla4蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表11。通過對結合的4g10h1l1和4g10h3l3抗體進行熒光定量分析，曲線模擬4g10h1l1和4g10h3l3抗體的結合效率ec50分別為7.58nm、10.54nm。表11：流式細胞儀檢測4g10h1l1和4g10h3l3結合ctla4宿主細胞293t-ctla4表面抗原的熒光強度分析2.2人源化抗體14c12h1l1與293t-pd-1細胞的結合結果如圖38所示。由圖可見，14c12h1l1抗體能有效地結合宿主細胞293t-pd-1表面的靶標pd-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表12。通過對結合的14c12h1l1抗體進行熒光定量分析，曲線模擬14c12h1l1抗體的結合效率ec50為1.89nm。表12：流式細胞儀檢測14c12h1l1結合pd-1宿主細胞293t-pd-1表面抗原的熒光強度分析濃度(nm)0.010.1151050熒光強度8.3220.31174.62579.41686.49669.542.3抗體biab001、biab002、biab003和biab004與293f-ctla4細胞的結合結果分別如圖39、圖40、圖41和圖42所示。由圖可見，抗體biab001、biab002、biab003和biab004均能有效地結合宿主細胞293f-ctla4表面的靶標ctla4蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表13。通過對結合的抗體進行熒光定量分析，曲線模擬抗體的結合效率獲得結合ec50(表13)。表13：流式細胞儀檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004結合293f-ctla4細胞表面抗原的熒光強度分析及ec502.4抗體biab001、biab002、biab003和biab004與293t-pd-1細胞的結合結果分別如圖43－圖46所示。由圖可見，抗體biab001、biab002、biab003和biab004均能有效地結合宿主細胞293t-pd-1表面的靶標pd-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系，各劑量的熒光強度見表14。通過對結合的抗體進行熒光定量分析，曲線模擬抗體的結合效率獲得結合ec50(表14)。表14：流式細胞儀檢測抗體biab001、biab002、biab003和biab004結合293t-pd-1細胞表面抗原的熒光強度分析3.抗體與t細胞表面抗原ctla4和pd-1的結合活性采用ficoll-paqueplus(gehealthcarelotno.:171440-02)分離pbmc，從pbmc中分離得到cd4+細胞，用pha(50μl/ml)刺激三天后用pbs洗一次，加入不同濃度的抗體，冰上孵育1.5h。孵育完成后，用pbs洗滌一次，加入fitc-標記抗人二抗igg(jacksonimmunoresearchlot.102155)。冰上避光孵育1h后，用pbs洗滌一次并用流式細胞儀檢測。其中所用對照抗體nilolumab為抗pd-1的抗體，可以商購得到，其信息亦可參考http://www.drugbank.ca/drugs/db09035；對照抗體ipilimumab為抗ctla4的抗體，可以商購得到，其信息亦可參考http://www.drugbank.ca/drugs/db06186。3.1人源化抗體4g10h3l3與t細胞的結合結果如圖47所示。由圖可見，4g10h3l3抗體能有效地結合t細胞表面的靶標ctla4蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系。3.2人源化抗體14c12h1l1與t細胞的結合結果如圖48所示。由圖可見，14c12h1l1抗體能有效地結合t細胞表面的靶標pd-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系。3.3抗體biab003和biab004與t細胞的結合與14c12h1l1和4g10h3l3對比結果如圖49。由圖可見，抗體biab003、biab004和14c12h1l1、4g10h3l3抗體均能有效地結合t細胞表面的靶標pd-1蛋白，并且其結合效率呈劑量依賴關系。并且抗體biab003、biab004和14c12h1l1與t細胞的結合強于抗體4g10h3l3，nilolumab和ipilimumab。熒光強度檢測結果如表15中。表15：抗體14c12h1l1、4g10h3l3和biab003和biab004與t細胞的結合活性實施例11：混合淋巴細胞反應：細胞因子ifn-γ，il-2的分泌1.采用ficoll-paqueplus(gehealthcarelotno.:171440-02)分離pbmc，將分離出來的pbmc加入il-4(peprotechk2513，1000u/ml)和gm-csf(peprotechh1513，1000u/ml)誘導6天后，加入tnf-α(peprotechg1513，200u/ml)誘導3天獲得dc細胞。pbmc中分離得到t細胞，將獲得的dc細胞與t細胞按1:10的比例混合培養，同時加入不同比例的抗體(higg做為對照)培養5-6天后，采用elisa試劑盒檢測ifn-γ(購自達科為公司)和il-2(購自達科為公司)的分泌量。dc細胞和t細胞混合培養后的ifn-γ的分泌檢測結果分別如圖50－圖53所示。dc細胞和t細胞混合培養后的il-2的分泌檢測結果分別如圖54－圖56所示。由圖可見，4g10h1l1、4g10h3l3、14c12h1l1、以及雙功能抗體biab001、biab002、biab003和biab004均能有效地誘導混合淋巴細胞分泌ifn-γ和il-2。其中，抗pd1抗體14c12h1l1在濃度為1nm和10nm時，對ifn-γ分泌的誘導效果與對照抗體nilolumab在100nm時相當。ctla4抗體4g10h1l1和4g10h3l3在濃度為100nm時對ifn-γ分泌的誘導效果強于對照抗體ipilimumab(圖52)。實施例12：il-2的分泌將分離得到的pbmc(方法同實施例10)用pha(上海疾控生物科技有限公司，50μl/ml)刺激3天后，96孔板中加入刺激成熟的pbmc(來源于志愿獻血者，5×104cells/孔)，raji細胞(來源于atcc,5×104cells/孔)和mda-mb-231細胞(來源于atcc)(1×104cells/孔)，同時加入抗體(100nm)混合均勻共培養。3天后，采用elisa試劑盒檢測il-2(購自達科為公司)的分泌量，具體操作按照試劑盒說明書進行。細胞混合培養后的il-2的分泌檢測結果分別如圖57、圖58和圖59所示。由圖可見，4g10h1l1、4g10h3l3、14c12h1l1、以及雙功能抗體biab001、biab002、biab003和biab004均能有效地誘導pbmc分泌il-2。其中，抗pd1抗體14c12h1l1對il-2分泌的誘導效果強于對照抗體nilolumab(圖58)，雙功能抗體biab001、biab002、biab003和biab004對il-2分泌的誘導效果與14c12h1l1+4g10h1l1或者14c12h1l1+4g10h3l3的效果相當(圖59)。盡管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護范圍之內。本發明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。當前第1頁12當前第1頁12