本發明涉及體外診斷試劑
技術領域：
，具體地說是一種配置簡單、試劑有效期增長、開瓶穩定性高的用于低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的穩定劑。
背景技術：
：眾所周知，低密度脂蛋白膽固醇用于冠心病和動脈粥樣硬化的診斷。動脈粥樣硬化(AS)斑塊中沉淀的脂質主要是低密度脂蛋白(LDL),在各類脂質中，LDL被認為是主要的致病因素，而高密度脂蛋白（HDL）可能起保護作用，血清總膽固醇(TC)大，致反映LDL膽固醇(LDL-CHO)水平，但也受HDL-C水平的影響，因此在AS脂類危險因素判別中，TC偏高時，測定LDL-C有重要臨床意義。目前，低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒多采用直接法-表面活性劑清除法，由于其高靈敏度，高準確性、高精密性及適用性而在臨床上廣泛使用，但因為酶的活性會受到PH、溫度、化學試劑的干擾，從而導致檢測試劑存在穩定性差的問題，影響臨床使用，目前市場上的低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑的保存條件及期限為，未開封試劑避光保存于2~8℃，有效期12個月；試劑開封后避光保存于2~8℃，在無污染情況下有效期1個月。技術實現要素：本發明的目的是解決上述現有技術的不足，提供一種配置簡單、試劑有效期增長、開瓶穩定性高的用于低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的穩定劑。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種用于低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的穩定劑，其特征在于該穩定劑由明膠、MgSO4、甘油、甜菜堿、海藻糖、聚乙二醇、EDTA組成，其重量組分為：明膠1～10ml/L，MgSO40.1～5g/L,甘油1～15ml/L，甜菜堿0.1～1mol/L，海藻糖0.1g/L～20g/L，聚乙二醇0.5～2g/L,EDTA0.5～2.0g/L。本發明中用于低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑，由試劑1和試劑2組成：R1：PIPES-Na80mmol/L，膽固醇酯酶2KU/L，膽固醇氧化酶2KU/L，過氧化氫酶200LU/L，4-氨基安替比林200mmol/L，三甲基-β-環糊精5g/L，環氧乙烷十八烷胺3g/L，亞鐵氰化鉀50μmol/L，氯化鈉25ml/L，Proclin3000.05%。R2：PIPES-Na80mmol/L，過氧化物酶2KU/L，氯化鈉0.9g/L，BSA1.5g/L，疊氮鈉2.0g/L，TritonX-10018g/L。本發明所述穩定劑的使用量在試劑中的體積為5ml/L。本發明所述的穩定劑的PH為6.8-7.0，PH對于酶的活性有很大的影響，影響機制很復雜，主要有下列幾個方面：1.pH過小（過酸）、過大（過堿）都能使酶蛋白變性而失活.2.pH的改變能影響酶活性中心上必須基團的解離程度，同時也可以影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結合和催化，只有在特定的pH下，酶、底物和輔酶的解離狀態，最適宜它們相互結合，并發生催化作用，從而使酶反應速度達到最大值。這個pH稱為酶的最適PH（optimunpH）酶的最適pH不是一個常數，它的大小與底物的種類和濃度、緩沖液的性質和濃度、介質的離子濃度、溫度、反應時間有關，在測定某種酶的活力時，采用該酶的最適pH，并用適當的緩沖液維持最適pH。本發明由于該穩定劑由明膠、MgSO4、甘油、甜菜堿、海藻糖、聚乙二醇、EDTA組成，用于低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的穩定劑，可以顯著延長低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的有效期至2年，開瓶穩定性達到3個月，且明顯降低空白吸光度值，試劑操作簡單，結果準確，穩定性好。具體實施方式一種用于低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的穩定劑，其特征在于該穩定劑由明膠、MgSO4、甘油、甜菜堿、海藻糖、聚乙二醇、EDTA組成，其重量組分為：明膠1～10ml/L，MgSO40.1～5g/L,甘油1～15ml/L，甜菜堿0.1～1mol/L，海藻糖0.1g/L～20g/L，聚乙二醇0.5～2g/L,EDTA0.5～2.0g/L，所述的用于低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑，由試劑1和試劑2組成：R1：PIPES-Na80mmol/L，膽固醇酯酶2KU/L，膽固醇氧化酶2KU/L，過氧化氫酶200LU/L，4-氨基安替比林200mmol/L，三甲基-β-環糊精5g/L，環氧乙烷十八烷胺3g/L，亞鐵氰化鉀50μmol/L，氯化鈉25ml/L，Proclin3000.05%，R2：PIPES-Na80mmol/L，過氧化物酶2KU/L，氯化鈉0.9g/L，BSA1.5g/L，疊氮鈉2.0g/L，TritonX-10018g/L，所述穩定劑的使用量在試劑中的體積為5ml/L，所述的試劑的PH為6.8-7.0，這個PH值是膽固醇酯酶，膽固醇氧化酶及過氧化氫酶的最適PH值，在此PH值的條件下，可以有效的保護酶不發生變性而失活，以延長酶的活性，從而有效的延長試劑的穩定性。在此PH值范圍內，加入樣品后，酶可以最大程度的催化反應，從而使酶反應速度達到最大值。低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑的反應原理為：（1）具有特異選擇性的緩沖液作用于血清中CM、VLDL、HDL，并在膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的催化下反應生成H2O2，H2O2被過氧化氫酶分解為H2O和O2，此時由于缺少Trinder反應的其中一個色原，測定體系不顯色；（2）在表面活性劑的作用下，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶催化LDL-C反應并顯色，用生化分析儀比色定量。反應一：CMVLDLHDL+選擇性抑制劑+CHER+CHOD→4-膽甾烯酮+H2O2H2O2+CAT→H2O+O2反應二：LDL+疊氮鈉+表面活性劑+CHER+CHOD→4-膽甾烯酮+H2O2H2O2+4-AAP+HRP→苯醌亞胺色素本發明高/低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑，適用于各類自動、半自動生化儀，以奧林巴斯AU400全自動生化儀為例，其操作如下：分析方法：終點法，試劑的用量為R1225ul，樣本量為3ul，將樣本加入試劑1于37℃孵育3～5分鐘后讀取吸光度值A1，然后加入試劑2，加樣量為75ul，于37℃孵育5分鐘后讀取吸光度值A2，檢測波長主波長為546nm，副波長為700nm。本實驗的目的是檢測試劑的空白吸光度值、開瓶穩定性、長效穩定性。操作步驟：使用定標液定標，取三個水平的質控各測定10次，取平均值，計算相對偏差。質控采用朗道質控（CAT.NO.LE2663LOT.NO.2162CHLOT.NO.2220CHLOT.NO.2141CH）,三個水平的靶值范圍分別為結果分析：根據檢測數據，計算測定值均值、相對偏差。表一結果顯示，本發明試劑空白本地明顯低于對比試劑，表明試劑的準確度高，精密性好，測試誤差小，干擾因素少。表二結果顯示，對比試劑僅在一個月內表現出良好的測試結果，后期偏離靶值幅度較大，而本發明試劑在開瓶后3個月，對同一質控測定10次，相對偏差均小于6%，表明試劑在開瓶后非常穩定，準確性良好，為測試人員提供了方便快捷的檢測試劑。表三結果顯示，對比試劑僅在一年內內表現出良好的測試結果，后期偏離靶值幅度較大，而本發明試劑在規定的儲存條件下放置兩年后，試劑依然非常穩定，相對偏差均小于6%，準確性好。顯著延長了試劑的使用期限。表1：低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒空白吸光度值不加穩定劑加入穩定劑OD（均值）0.15130.0481表2：低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒表3：低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒本發明試劑中一定比例的MgSO4及過氧化氫酶起到了降低空白本底的作用，其中過氧化氫酶通過催化過氧化氫反應生成水和氧氣從而減少因4-氨基安替比林被氧化而產生的顏色反應，達到降低空白本底的效果。MgSO4的硫酸根離子可以降低4-氨基安替比林被氧化的速度而減少因4-氨基安替比林被氧化而產生的顏色反應，從而降低空白本底。含有MgSO4及過氧化氫酶與不含有MgSO4及過氧化氫酶的對比試驗實驗數據：本發明試劑中一定比例的明膠可以減緩有機試劑對酶的失活作用。甘油及甜菜堿起到抑制酶分子間聚集的作用，維持酶分子的二級結構，增強酶的穩定性。海藻糖即可通過氫鍵與酶表面分子結合，穩定酶活性，也可抑制酶分子間聚集，有效阻止酶分子變性失活。聚乙二醇具有疏水親水的雙重特性，可以提高酶的穩定性。酶分子易受到蛋白水解酶的影響，一旦條件適宜，就會發生水解反應，EDTA可避免水解現象，維持酶分子的活性。本發明的用于低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的穩定劑，可以顯著延長高/低密度脂蛋白膽固醇測定試劑的有效期至2年，開瓶穩定性達到3個月，且明顯降低空白吸光度值，試劑操作簡單，結果準確，穩定性好，實驗采用奧林巴斯AU400全自動生化儀進行，但本發明的試劑不限于上述儀器，還適用于其他半自動或全自動生化分析儀。現有的低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑的成分有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、過氧化物酶、tween-80、曲拉通x-100、4-氨基安替比林、緩沖液，沒有穩定劑，所以開瓶穩定性僅一個月，開瓶效期僅一年。當前第1頁1 2 3