本發明涉及微生物發酵技術領域，更具體地，涉及一種利用有機廢物生產聚果糖的固體發酵方法及其應用。
背景技術：
聚果糖是果糖分子以β-1，2糖苷鍵或β-2，6糖苷鍵連接的多糖，人們將果糖單元數大于20的稱為多聚果糖，小于20的稱為低聚果糖。聚果糖是一種優良的水溶性膳食纖維，可以預防便秘與結腸癌、降低血液膽固醇、穩定血糖水平。同時還是一種很好的“益生元”，具有調節腸道菌群、增殖雙歧桿菌、促進鈣的吸收、促進免疫調節、抗齲齒等保健功能，可減少肝臟毒素，能在腸中生成抗癌的有機酸，有顯著的防癌功能；另外，聚果糖不僅是動物的免疫增強劑，也可以誘導植物產生抗性，增強植物體對病害的抵抗力，是一種安全而新型的飼料添加劑。
果寡糖又稱低聚果糖（Fructo-oligosaccharides，FOS），是一種天然的飼料添加劑，果寡糖具有非著色性、賦形性、耐堿性、耐高溫、保水性和穩定性等優點，果寡糖吸濕性低，可減緩飼料因吸濕而發霉變酸；同時果寡糖的防霉性能好，可以延長飼料保存期。作為添加劑應用于飼料中主要是寡果三糖（GF2）、寡果四糖（GF3）和寡果五糖（GF4）。果寡糖廣泛存在于香蕉、大麥、大蒜、洋蔥、黑麥、馬鈴薯、洋姜、小麥、出小麥等植物小，但提取較為困難，且難以批量生產，果寡糖在工業生產上有兩種制造方法，一種是用菊粉含量高的菊芋作為原料，用熱水抽提菊粉，經微生物菊粉酶部分水解生成果糖聚合度為2～10的鏈狀聚果糖；第二種是用蔗糖作為原料制造的，在一定濃度的蔗糖培養基中，利用微生物產生的β-呋喃果糖苷酶作用，將蔗糖轉化為聚果糖；但這兩種方法都必須依賴于外源酶的作用，由于生物酶自身的特點，制約了低聚果糖的生產效率和聚合度。另一方面，目前用于生產低聚果糖的菊粉酶和β-呋喃果糖苷酶來源有限，生產成本高，轉化效率低，生產時間長，因而開發研究新型聚果糖生產工藝具有明顯的現實意義和經濟價值。
膠凍樣類芽孢桿菌PS04可以產生聚果糖，現有技術研究了PS04在液體培養基中培養產生聚果糖的方法，但液體發酵后聚果糖的提取過程成本較高，很難滿足禽畜飼料的生產需要。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種利用有機廢物生產聚果糖的固體發酵方法及其應用。
一種利用有機廢物生產聚果糖的固體發酵方法，是將膠凍樣類芽孢桿菌PS04的菌液與有機廢物混合培養4～5d得有機廢物-PS04培養物，從有機廢物-PS04培養物中提取即獲得聚果糖；所述有機廢物中蔗糖的含量為2.5～5.1wt%；水含量為55～63.3 wt %。
在利用膠凍樣類芽孢桿菌PS04進行固體發酵時，發現對其固體發酵生產聚果糖產量影響顯著的因素包括固體培養基中蔗糖的含量、水含量和發酵的時間，本發明利用有機廢物發酵時，必須同時控制這三個因素。
另外，研究還發現，膠凍樣類芽孢桿菌PS04的接種量也會影響最終聚果糖的產量，但影響沒有上面幾個因素顯著，優選地，所述膠凍樣類芽孢桿菌PS04的接種量為1～10 V/W %。
具體地，本發明所述有機廢物為木薯渣或者麩皮。
更優選地，當所述有機廢物為木薯渣時，是將膠凍樣類芽孢桿菌PS04的菌液與木薯渣混合培養4d得有機廢物-PS04培養物，從有機廢物-PS04培養物中提取即獲得聚果糖；所述有機廢物中蔗糖的含量為5.06wt%；水含量為63.3 wt %。
更優選地，當所述有機廢物為麩皮時，是將膠凍樣類芽孢桿菌PS04的菌液與麩皮混合培養5d得有機廢物-PS04培養物，從有機廢物-PS04培養物中提取即獲得聚果糖；所述有機廢物中蔗糖的含量為2.5wt%；水含量為55 wt %。
本發明通過固體發酵培養后獲得的有機廢物-PS04培養物可直接與飼料混合，從而滿足禽畜飼料生產的需要。
因此，本發明還提供所述有機廢物-PS04培養物作為飼料添加劑的應用。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明通過膠凍樣類芽孢桿菌PS04在木薯渣培養基中的培養獲得聚果糖，具體是將膠凍樣類芽孢桿菌PS04的菌液與有機廢物混合培養4～5d得有機廢物-PS04培養物，從有機廢物-PS04培養物中提取即獲得聚果糖；所述有機廢物中蔗糖的含量為2.5～5.1wt%；水含量為55～63.3 wt %；本發明所述方法克服了液體發酵產聚果糖提取成本高，難以滿足禽畜飼料生產需要的缺陷，同時，利用本發明所述方法生產的聚果糖含量高，發酵完的培養物可直接與飼料混合，可以大大降低聚果糖提取和干燥需要的能源消耗，生產成本低，能帶來良好的經濟效益。
具體實施方式
下面結合具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬 于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
查氏培養基：硝酸鈉 3g，磷酸氫二鈉 1g，硫酸鎂( MgSO4·7H2O) 0.5g，氯化鉀 0.5g，硫酸亞鐵 0.01g，蔗糖 30g，蒸餾水 1000mL；用于PS04的液體培養。
麩皮培養基：稱取麩皮25g，按麩皮：蒸餾水=1：1（W/W）的比例配制麩皮培養基，攪拌混合均勻后，裝于500mL錐形瓶中，高壓蒸汽滅菌（121℃滅菌20min）。作為實施例1的固體培養基用于發酵。
木薯渣培養基：木薯渣25g、自來水50ml，混合均勻后裝入500ml三角瓶內，用棉塞塞好包扎好，滅菌后備用，作為實施例2的固體培養基用于發酵。
實施例1 以麩皮為固體培養基發酵生產聚果糖
1、PS04液體培養：查氏培養基按100mL/500mL錐形瓶分裝，高壓蒸汽滅菌（121℃滅菌20min）后備用。刮取新鮮的菌苔1～2 環接種在500mL錐形瓶中，30 ℃、150 r/min，振蕩培養84 h后制得PS04液體菌種。
2、PS04固體培養：在滅菌冷卻后的麩皮培養基中，按5%（V/W）的接種量接種PS04液體菌種，接種后攪拌，使菌種和麩皮培養基充分混勻，置于30℃培養箱中靜置培養84h，期間不定時震蕩翻動3～4次。
制作麩皮培養基，接種后，分別準確稱取發酵前和發酵后的麩皮各l0g（無菌操作）作為待測樣品，用于測定發酵前和發酵后麩皮中所含菌種量，結果表明：培養前后菌種的量明顯增加，說明PS04菌能在麩皮培養基中生長，能以麩皮作為固體培養基（表1）。
3、PS04固體培養基單因素優化
多糖提取及產量的測定：將發酵完的固體培養基加入150mL的蒸餾水攪拌均勻，于100℃的水浴鍋中水浴浸提1h，待其冷卻后過濾，取濾液，15000 r/min離心30 min（4℃）。量取30mL上清液于離心瓶中，加入9倍體積的 95%乙醇，混合均勻后4℃下靜置沉淀多糖30min，15000 r/min離心15 min（4℃），除上清液。將沉淀用鑷子輕輕夾起放入準備好的濾紙上（已烘干稱質量，記為W1）中，105 ℃烘至恒重，冷卻后稱質量（記為W2），多糖質量=W2-W1。
（1）蔗糖含量對PS04多糖產量的影響
往麩皮培養基中添加蔗糖，添加量分別為1%，2%，3%，4%，6%，8%，10%（W/W），固體培養84h后結果如表2。
試驗結果表明：當蔗糖添加量為2%（W/W）時，麩皮培養基中的多糖含量達到最大值99.12mg/g，之后隨著蔗糖添加量的增加，多糖含量呈下降趨勢。原因是當蔗糖添加量太低時碳源不夠，無法滿足細菌的生長，而隨著蔗糖添加量的升高，細菌處于較高的滲透壓條件下，抑制了細菌的生長。
（2）含水量對PS04多糖產量的影響
往麩皮培養基中添加2%（W/W）蔗糖，調節含培養基水量分別為30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%（W/W），固體培養84h后結果如表3。
試驗結果表明，隨著含水量的增加，麩皮培養基中的多糖含量相應增加，當含水量為50% （W/W）時，多糖含量達到最大95.2 mg/g，隨后含水量繼續增大，多糖合成量呈下降趨勢。隨著含水量的提高，微生物生長所需要的水分增加，有利于微生物的生長；而當含水量高于最適含水量，麩皮的黏度增加，導致培養基中的氧含量下降，進而抑制菌體的生長。
（3）培養時間對PS04多糖產量的影響
往麩皮培養基中添加2%（W/W）蔗糖，調節培養時間分別為0d ，2d，3d，4d，5d，6d，7d；固體培養后結果如表4。
試驗結果表明：隨著發酵天數的增加，多糖產量增大，在發酵0～3d時，多糖產率增加較平緩，發酵天數為5d時，多糖產量達到最多，為0.08240g/g，之后隨著發酵天數增加多糖產量反而呈減少趨勢。隨著發酵天數的增加，培養基中的碳源被消耗完，菌種會使用次生代謝產物多糖（聚果糖）作為碳源而消耗掉部分聚果糖，導致多糖含量減少。
（）接種量對PS04多糖產量的影響
往麩皮培養基中添加2%（W/W）蔗糖，分別以接種量為1%，3%，5%，7%，10%（V/W）進行接種，固體培養84h后結果如表5。
試驗結果表明：1%～10%的接種量對菌體生長多糖產量的影響沒有表現出較大的差異，說明接種量對菌株產生胞外多糖有影響。
4、PS04固體培養的正交試驗
以優化得到的含水量、蔗糖含量和發酵天數進行3因素3水平的正交試驗。采用L9(34)正交表（見表6）確定各組分的最佳配比。
按表7的正交表的方法進行正交試驗，測定結果如表8，由此可見：發酵天數是影響 PS04 菌株產生多糖的最主要的因素，含水量次之，蔗糖添加量對其影響最小。綜合這3個因素不同水平對發酵的影響，確定最適合該菌株發酵產生多糖的麩皮培養基各組分為含水量55%（W/W），蔗糖含量2.5%（W/W），發酵天數為5d。
通過單因素試驗和正交試驗相結合，初步得到，菌株PS04在以麩皮為固體培養基產生的胞外多糖發酵過程中，接種量對發酵產生多糖影響不大，發酵的最適培養條件為：固體培養幾種含水量為55%（W/W），蔗糖含量為2.5%（W/W），發酵天數為5d。其中發酵天數對多糖發酵影響最大，含水量次之，蔗糖含量影響最小。
實施例2 以木薯渣為固體培養基發酵生產聚果糖
1、PS04的活化：從PS04試管斜面上挑取少許菌苔，接種到已經滅菌的液體查氏培養基中，于30℃活化培養，轉速180r/min的搖床上培養84 h。
2、PS04的種子培養：按接種量1%（V/V）吸取活化后的PS04菌液，接種到裝有查氏培養基的三角瓶中（控制裝液系數（裝液體積與容積體積之比）為0.4），于溫度30℃，轉速180r/min的恒溫搖床中培養84 h，即為PS04種子液。
3、PS04的木薯渣培養：定量吸取PS04的種子液，接種到滅菌的木薯渣培養基中（同一批次接種均為同一批次培養的菌液，無特別說明均為3mL），攪拌混合均勻后置于28℃的恒溫培養箱中培養；培養時間一般為3～4天。
4、聚果糖的提取：定量稱取木薯渣-PS04培養物置于500mL燒杯中，加入250mL或200mL熱水，于90℃恒溫水浴下提取1.5h,期間用玻璃棒邊攪拌。趁熱過濾，取其中濾液30mL，加入9倍體積的醫用乙醇，攪拌均勻后，靜置至少2h，沉淀聚果糖。然后于9000r/min條件下，離心15min，沉淀即為聚果糖。該沉淀為灰白色的，外表性狀與聚果糖一致。
5、聚果糖的測定
把沉淀物連帶濾紙放入烘干機烘烤5h，直到聚果糖完全干燥。再對其稱量，每個實驗流程方案的最終產物為3個重復的平均值，聚果糖凈產量為每30mL濾液的產物平均值，總產量為每25g木薯渣發酵后得到的聚果糖的量，產率為每克木薯渣得到的聚果糖的量。
6、PS04生物量的測定（稀釋平板計數法）
沒有經過培養的木薯渣培養基，直接對PS04菌倒平板培養的培養基都以A來代表，A的單菌落數量即為起始生物量；木薯渣培養基經過72h培養，再對PS04菌倒平板培養的培養基都以B表示，B的單菌落數量為培養后的生物量。
7、PS04固體培養基單因素優化
（1）蔗糖含量對PS04多糖產量的影響
在配制好的木薯渣培養基中，分別添加蔗糖0g、1.4g、2.8g、3.5g、4.2g、4.9g、5.6g、7g；其終濃度分別為0%、2%、3.8%、4.8%、5.7%、6.5%、7.4%、9.1%。滅菌后，無菌操作下接PS04種子菌液。其中蔗糖添加為0g的不接種。接種后置于28℃培養箱倒置培養，72h后，測定其聚果糖含量。
注：聚果糖凈產量為每30mL濾液的產物平均值，總產量為每25g木薯渣發酵后得到的聚果糖的量，產率為每克木薯渣得到的聚果糖的量。
由表9看出當培養基中蔗糖添加量和接種量為0時，聚果糖產物為0，說明用此法結果并沒有受到木薯渣培養基中其他成分的影響，PS04對在該培養基的蔗糖有果糖基轉移酶作用。當蔗糖濃度4.8%（3.5g）時，聚果糖產率為0.2206最高。
（2）含水量對PS04多糖產量的影響
往木薯渣培養基中添加蔗糖3.5g，并分別添加0ml、28.5ml、35ml、43ml、50ml、57ml、63ml、71ml水，使得木薯渣培養基的含水量分別為0%、50%、55.1%、60.1%、63.7%、66.7%、68.9%、71.4%。滅菌后，無菌操作下接PS04種子菌液。其中水添加為0的不接種。接種后置于28℃培養箱倒置培養，72h后測定其聚果糖含量。
由表10看出當培養基的含水量為零蔗糖添加量并不為零時，聚果糖產物也為零，說明經過熱水浸提和乙醇離心沉淀后產物中排除了蔗糖，驗證產物為聚果糖。當含水量為63.7%，即培養基組成為木薯渣25g+蔗糖3.5g+水50mL時，聚果糖產率0.4357最高。
木薯渣培養基的含水量也是PS04菌株能否正常生長和積累代謝物的重要因素之一。如果培養基含水量過少，則會導致菌株生長延緩，減弱了果糖基轉移酶作用，從而降低了產量。而培養基含水量過多，則培養基在高壓滅菌過程中，木薯渣容易出現黏糊狀，降低了培養基內部的透氣性，使其缺少氧氣，不利于菌株進一步生長，進而影響到產量。通過對木薯渣培養基不同含水量的比較試驗，得出適合PS04菌的含水量，進而可以提高聚果糖的產量和品質。
（3）發酵時間對PS04多糖產量的影響
25g木薯渣中，蔗糖添加量為3.5g，水添加量為50ml。滅菌后，無菌操作下接PS04種子菌液。接種后置于28℃培養箱倒置培養，分別于46h、69h、93h、120h、148h取樣，每個時間段取樣2個，提取聚果糖，測定其聚果糖含量。
從表11看出，PS04菌在木薯渣培養基中對蔗糖起果糖基轉移酶作用積累聚果糖的適宜培養時間為69h，產率最高為0.4589。
8、PS04固體培養的正交試驗
根據實驗實際情況，擬定影響木薯渣培養基得出產物的3個主要因素，即A（蔗糖含量）、B（水添加量）、C（培養時間）為優選因素。每個因素選3個水平進行L9(34)正交試驗，以聚果糖產量為評價指標。實驗因素水平設計見表12。
注：A為蔗糖含量g，B為水的含量mL，C為培養天數d，D為溫度，實際溫度都為28℃。
由于RC>RB>RA，因此影響PS04菌在木薯渣培養基積累聚果糖的3個主要因素的主次順序為C>B>A。再由3個主要因素的K1、K2、K3最大值，可以得出最佳工藝為C3B2A3，再結合實驗因素水平表L9(34)，得出PS04積累聚果糖的最佳木薯渣培養基為：25g木薯渣培養基中，蔗糖含量4g，水的含量50ml，培養時間為4天。木薯渣、蔗糖、水含量占總重的百分比分別為：31.65%、5.06%、63.29%。