本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種從玄參中分離出來的化合物及其制備方法，還涉及它在生物醫藥中的應用。
背景技術：
玄參，中藥名。為玄參科草本植物，可達1米余。支根數條，紡錘形或胡蘿卜狀膨大，粗可達3厘米以上。生于海拔1700米以下的竹林、溪旁、叢林及高草叢中。產河北(南部)、河南、山西、陜西(南部)、湖北、安徽、江蘇、浙江、福建、江西、湖南、廣東、貴州、四川。味甘、苦、咸，性微寒，有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結的功效。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種從玄參中分離出來的天然化合物，該天然化合物結構新穎，該天然產物具有對肺癌具有治療作用。另外，本發明還提供一種上述化合物的制備方法。
本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
一種從玄參中分離出來的化合物，它是具有下述結構式的化合物(Ⅰ)，
上述化合物的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將玄參粉碎，用65～85％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6％乙醇洗脫8個柱體積，再用70％乙醇洗脫8個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)。
作為優選，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
上述化合物(Ⅰ)在制備治療肺癌的藥物中的應用。
本發明的優點：
本發明提供的一種結構新穎的天然產物，該天然產物單獨作用時，對肺癌具有治療作用；配以其他藥物聯合協同作用時，可以開發成治療肺癌的藥物。
具體實施方式
下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范圍。
實施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結構確證
分離方法：(a)將玄參(3kg)粉碎，用75％乙醇熱回流提取(20L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水飽和的正丁醇(4L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6％乙醇洗脫8個柱體積，再用70％乙醇洗脫8個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1(8個柱體積)、25:1(8個柱體積)、15:1(8個柱體積)和5:1(10個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1(8個柱體積)、5:1(10個柱體積)和2:1(5個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(純度大于98％)。
結構確證：HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z 247.1259，結合核磁特征可得分子式為C15H18O3，不飽和度為7。核磁共振氫譜數據δH(ppm，CD2Cl2，500MHz)：H-1a(1.12，m)，H-1b(1.83，m)，H-2(1.84，m，2H)，H-4(5.71，s)，H-5(2.59，d，J＝10.6Hz)，H-9(2.18，m)，H-10(1.67，m)，H-12a(5.41，t，J＝2.0Hz)，H-12b(5.02，t，J＝2.0Hz)，H-13a(4.35，dd，J＝13.4，2.0Hz)，H-13b(4.58，dd，J＝13.4，2.0Hz)，H-14(1.02，d，J＝6.4Hz)，H-15(1.84，s)；核磁共振碳譜數據δC(ppm，CD2Cl2，125MHz)：26.8(CH2，1-C)，30.1(CH2，2-C)，135.9(C，3-C)，145.1(CH，4-C)，48.2(CH，5-C)，79.2(C，6-C)，111.1(C，7-C)，204.2(C，8-C)，36.6(CH，9-C)，40.3(CH，10-C)，146.2(C，11-C)，112.1(CH2，12-C)，68.2(CH2，13-C)，14.7(CH3，14-C)，18.4(CH3，15-C)。該化合物的氫譜中有一個乙烯基甲基信號[δH1.84(3H，br，s，Me-15)]，一個雙峰甲基信號[δH1.02(3H，d，J＝6.4Hz，Me-14)]，一個末端雙鍵質子信號[δH5.41(1H，t，J＝2.0Hz，H-12a)和5.02(1H，t，J＝2.0Hz，H-12b)]，一個含氧亞甲基質子信號[δH4.35(1H，dd，J＝13.4，2.0Hz，H-13a)和4.58(1H，dd，J＝13.4，2.0Hz，H-13b)]以及一個烯屬次甲基質子信號[δH5.71(1H，br，s，H-4)]。該化合物的碳譜顯示15個碳信號，包括兩個甲基，四個亞甲基(一個烯烴碳，一個連氧碳)，四個次甲基(一個烯烴碳)以及五個季碳(兩個烯烴碳，一個酮羰基和兩個連氧季碳)。綜合高分辨質譜和核磁數據顯示，該化合物可能為一個倍半萜類化合物。查閱文獻可知，該化合物和已知化合物Lyophyllone B具有相似的結構。比較兩者核磁數據可知，相較于已知化合物，新化合物中C-8位連氧碳信號的缺失的同時多了一個酮羰基碳信號。在該化合物的HMBC譜中，H-14/C-8，H-9/C-8，H-10/C-8的相關性說明多出來的酮羰基是位于C-8位的。解析至此，已解析出7個不飽和度中的6個，故而該化合物中還有一個額外的環。分析核磁數據可以發現，該化合物C-6和C-7位的碳譜數據發生很大的變化，都向高場位移。結合高分辨，以及核磁譜圖，可以確定在該化合物的C-6和C-7位存在一個三元氧環。NOESY譜中，H-10/H3-14，H-5/H-9之間的相關性說明H-10以及14-CH3都是位于β位的。此外，五元含氧環與六元環是順式稠合的，同時C-6和C-7之間的三元氧環是α型的。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。該化合物化學式及碳原子編號如下：
實施例2：藥理作用
本實施例使用右腋皮下接種肺癌瘤株細胞建立lewis肺癌小鼠模型，測定各組的抑瘤率和Bcl-2及Bax表達水平，觀察藥物上調Bax、下調Bcl-2的表達、誘導腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤生長的抗腫瘤作用。
1、材料與方法
1.1動物
C57BL/6純系小鼠，雄性6～8周，(20±2)g，北京維通利華公司動物實驗中心。
1.2試劑與樣品
鹽酸納美芬購自中國藥品生物制品檢定所。化合物(Ⅰ)自制，制備方法見實施例1。兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體(SANTACRUZ公司)、二步法免疫組化檢測試劑盒，DAB顯示劑(北京中杉金橋公司)。瘤株Lewis肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研究所提供并傳代保種；Lewis肺癌維持在C57BL/6小鼠體內，每2周傳代1次。
1.3小鼠分組及模型制備
C57BL/6小鼠隨機分組，每組12只，分別為模型對照組(NS組)、鹽酸納美芬組、化合物(Ⅰ)組、鹽酸納美芬與化合物(Ⅰ)組合物組。每只小鼠右腋皮下接種肺癌瘤株細胞，建立lewis肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥。生理鹽水(NS)組：0.9％生理鹽水0.2mL，連續10d；鹽酸納美芬組：40mg/(kg·d)，連續給藥10d；化合物(Ⅰ)組：40mg/(kg·d)，連續給藥10d；鹽酸納美芬與化合物(Ⅰ)組合物組：40mg/(kg·d)鹽酸納美芬+40mg/(kg·d)化合物(Ⅰ)，連續給藥10d。末次給藥后24h，小鼠稱重，處死。
1.5瘤重測定實驗
末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝取瘤塊稱重。
抑瘤率(％)＝(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100％。
1.6Lewis肺癌Bcl-2、Bax表達變化的測定實驗
免疫組化法測定Bcl-2、Bax表達。瘤塊以石蠟包埋制成4μm厚的切片，脫蠟、水化后，3％H2O2滅活內源性過氧化物酶，高壓抗原修復，后續步驟按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作。陰性對照以0.01mol/LPBS(pH＝7.4)代替一抗。在光學顯微鏡下觀察鹽水對照組和各給藥實驗組樣本的免疫組化切片。
結果判定：每張切片在5～10個高倍視野下進行細胞計數，每個視野計數100～200個細胞，共1000個細胞，計算每張切片陽性細胞數所占比例。Bcl-2在胞漿出現棕黃色染色為陽性染色。Bax在胞漿和(或)胞膜出現棕黃色染色為陽性染色。
1.7統計學方法
數據均以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進行數據處理，單因素方差分析。
2、實驗結果
2.1對Lewis肺癌模型小鼠實體瘤的影響
與模型對照組比較，鹽酸納美芬與化合物(Ⅰ)組合物組瘤重明顯減小(P＜0.01)，抑瘤率明顯增加(P＜0.01)；與模型對照組比較，鹽酸納美芬組、化合物(Ⅰ)組瘤重減小(P＜0.05)，抑瘤率增加(P＜0.05)。結果見表1。
2.2對Lewis肺癌模型小鼠Bcl-2及Bax表達的影響
與模型對照組比較，鹽酸納美芬與化合物(Ⅰ)組合物組Bcl-2表達明顯降低(P＜0.01)，Bax表達明顯升高(P＜0.01)；與模型對照組比較，鹽酸納美芬組、化合物(Ⅰ)組Bcl-2表達降低(P＜0.05)，Bax表達升高(P＜0.05)。結果見表1。
表1對小鼠體內Lewis肺癌生長及Bcl-2、Bax表達水平的影響(x±s，n＝10)
肺癌的發生是一個涉及多因素多階段的復雜過程，近年來研究表明，肺癌的發生可能是由于細胞凋亡與增殖失衡造成的。細胞凋亡是細胞自身的一種主動的、生理性死亡機制，細胞調亡過程受促調亡因子和調亡抑制因子的共同調節。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2同一家族，與人類多種腫瘤的發生有密切關系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B細胞淋巴瘤克隆到的原癌基因，其通過穩定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放Caspase、凋亡誘導因子和細胞色素C等作用抑制細胞凋亡。Bcl-2通過抑制細胞凋亡而參與腫瘤的發生。Bax基因具有拮抗Bcl-2的作用，是促凋亡基因。當Bax蛋白大量表達，并與Bcl-2蛋白形成異源二聚體時加速細胞死亡，Bcl-2和Bax的表達程度對決定細胞接受凋亡信號后存活與否起關鍵作用。目前，多數研究表明，Bcl-2與Bax的表達之間呈負相關，Bcl-2過量表達，細胞存活；Bax蛋白過量表達，細胞死亡。
結果表明，鹽酸納美芬、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對肺癌具有抑制作用；鹽酸納美芬和化合物(Ⅰ)聯合作用時，對肺癌的抑制效果進一步提高，可以開發成治療肺癌的藥物。
上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。