生理性細胞自噬模型的建立方法以及黃嘌呤氧化酶在建立細胞自噬模型中的應用與流程

本發明屬于生物醫學領域，具體涉及生理性的細胞自噬模型的建立。

背景技術：

自噬(Autophagy)是一種通過溶酶體途徑降解包括細胞器在內的胞質成分的分解代謝途徑，在進化上高度保守且普遍存于真核細胞中。

根據細胞內底物運送到溶酶體腔方式的差異，細胞自噬可分為：1)大自噬，通過起始(導致分割膜或吞噬泡的前自噬體結構的形成)、囊泡延伸、自噬體成熟以及自噬體-溶酶體融合、自噬體內容物被溶酶體酸性水解酶降解，最終自噬體內容物被釋放以進行代謝再循環；2)小自噬，是指在溶酶體或酵母液泡表面通過突出、內陷或分隔隔離細胞器的膜來直接攝取待降解成分；3)分子伴侶介導的自噬，由胞質中的分子伴侶識別底物蛋白分子的特定氨基酸序列并與之結合，分子伴侶-底物復合物與溶酶體膜上的受體LAMP2(lysosome associated membrane protein type 2)結合后，底物去折疊，溶酶體腔中的另一種分子伴侶介導底物在溶酶體膜的轉位，然后底物在水解酶的作用下被分解再利用。隨著自噬研究的深入，根據對降解底物的選擇性不同，自噬又被分為線粒體自噬(mitophagy)、過氧化物酶體自噬(pexophagy)、內質網自噬(reticulophagy)、細胞核的碎片狀自噬(piecemeal autophagy of the nucleus)、核糖體自噬(ribophagy)、脂肪自噬(lipophagy)、蛋白體聚集自噬(aggrephagy)、異體吞噬(xenophagy)等。

已有的自噬模型往往自噬發生快、通量小，因而對其捕捉和檢測造成困難，且常常與凋亡或壞死相伴發生，為自噬這一生理現象的研究造成干擾。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種生理性細胞自噬模型的建立方法以及黃嘌呤氧化酶在建立細胞自噬模型中的應用，所建立的細胞自噬模型具有自噬發生顯著、易于檢測、持續時間久，并且不伴有細胞凋亡或壞死的優點。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種生理性細胞自噬模型的建立方法，該自噬模型的建立方法包括以下步驟：用黃嘌呤氧化酶對培養中的動物細胞進行處理。

所述自噬模型的建立方法具體包括以下步驟：將動物細胞接種至培養器皿中并培養至動物細胞貼壁生長，然后向培養器皿中加入終濃度為1～40mU/mL的黃嘌呤氧化酶，并繼續培養至少0.5小時。

所述動物細胞接種量為1×10⁴～3×10⁵個。

所述動物細胞貼壁生長至覆蓋培養器皿底面積的50～60％后加入黃嘌呤氧化酶。

所述動物選自哺乳動物。

所述動物細胞選自上皮細胞或間質細胞。

黃嘌呤氧化酶在建立細胞自噬模型中的應用。

所述黃嘌呤氧化酶為自噬誘導劑。

所述細胞自噬模型包括線粒體自噬。

本發明的有益效果體現在：

本發明以黃嘌呤氧化酶為自噬誘導劑建立細胞自噬模型，可在較長時間內持續、高效誘導細胞自噬。同時，本發明所述細胞自噬模型的建立方法在能明顯誘導自噬的黃嘌呤氧化酶劑量作用下并沒有明顯降低細胞活力，不會導致明顯的細胞凋亡或壞死。

附圖說明

圖1A為XOD處理細胞后MDC熒光結果；Control為對照組結果，各個處理組的結果以左上角標注的代表XOD濃度的數字相區別(XOD濃度分別為1、5、10、20以及40mU/mL)，處理24h；

圖1B為XOD處理細胞后LC3蛋白免疫熒光結果；Control為對照組結果，各個處理組的結果以左上角標注的代表XOD濃度的數字相區別(XOD濃度分別為1、5、10、20以及40mU/mL)，處理24h；

圖1C為XOD處理細胞后透射電子顯微鏡(TEM)結果；Control為對照組結果，各個處理組的結果以左上角標注的代表XOD濃度的數字相區別(XOD濃度分別為1、5、10、20以及40mU/mL)，處理24h；

圖1D為XOD處理細胞后Western Blot及量化結果(處理24h)；0表示對照組結果；

圖1E為XOD處理細胞后自噬通量Western Blot檢測結果(20mU/mL XOD處理24h)，＊表示p＜0.05，VS Control or XOD；

圖1F為采用mRFP-GFP-LC3串聯的熒光蛋白表達載體系統對XOD處理細胞后自噬通量檢測結果(20mU/mL XOD處理24h)；

圖1G為XOD處理多種細胞對自噬標志物LC3水平的Western Blot結果(處理24h)；

圖2A為經典自噬誘導劑Rapamycin、EBSS和XOD處理細胞后自噬水平比較(MDC熒光結果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；

圖2B為經典自噬誘導劑Rapamycin、EBSS和XOD處理細胞后自噬水平比較(LC3免疫熒光結果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；

圖2C為經典自噬誘導劑Rapamycin、EBSS和XOD處理細胞后自噬水平比較(TEM結果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；

圖2D為經典自噬誘導劑Rapamycin、EBSS和XOD處理細胞后自噬水平比較(Western Blot及量化結果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM，＊表示p＜0.05，VS each Control(2h/8h/24h)；

圖3為常用氧化劑及XOD對細胞凋亡及細胞活力的影響，＊表示p＜0.05，VS Control；其中，XOD：20mU/mL，(a)是Western Blot及量化結果，(b)是流式檢測細胞死亡及量化結果，(c)是細胞生長曲線結果；

圖4為XOD誘導線粒體自噬的結果，＊表示p＜0.05，VS Control；其中，(A)是線粒體膜電位結果(JC-1染色共聚焦結果)，(B)是線粒體膜電位流式細胞儀量化結果，(C)是免疫熒光雙標結果，(D)是線粒體自噬關鍵蛋白Western Blot及量化結果，(E)是透射電子顯微鏡結果，(F)是線粒體DNA拷貝數(熒光定量PCR)。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明做詳細說明。

(一)主要實驗部分

1)黃嘌呤氧化酶(XOD)誘導自噬模型實驗

L-02細胞采用含10％(體積分數)FBS(胎牛血清)的MEM完全培養基為細胞培養液，在37℃并含有5％CO₂及飽和濕度條件下培養細胞。處于對數生長期時，用2.5‰的胰蛋白酶(即質量分數2.5‰的胰蛋白酶溶液)將細胞消化至不再貼壁，混合MEM完全培養基均勻吹打制成細胞懸液，細胞懸液接種于6孔板等培養器皿中，起始細胞濃度為3×10⁵個細胞/孔，37℃、5％CO₂及飽和濕度條件的細胞培養箱中培養24小時至細胞貼壁生長，密度大約為覆蓋培養器皿底面積的50～60％后，處理組分別加入終濃度1、5、10、20、40mU/mL的黃嘌呤氧化酶(XOD)進行處理(處理指加XOD并繼續保持培養條件進行培養)24小時，然后檢測細胞自噬及線粒體自噬。對照組(Control)加入相同體積水作為對照，后續處理及檢測同處理組。

2)類似地，采用XOD處理其他多種細胞如人肝細胞HepG2、人肺細胞BEAS-2B、人成纖維細胞WI-38、人皮膚細胞HaCat、以及大鼠肝細胞Clone 9、小鼠肝細胞AML12，處理組分別加入1、5、10、20、40mU/mL的XOD進行處理24小時，然后采用Western Blot方法檢測細胞自噬標志物LC3水平的變化。

3)黃嘌呤氧化酶(XOD)與經典自噬誘導劑誘導的自噬模型的優勢評價實驗

將L-02細胞按照起始濃度3×10⁵個細胞/孔接種于6孔板中，37℃、5％CO₂及飽和濕度條件細胞培養箱中培養24小時后，隨機分組為對照組、雷帕霉素(Rapamycin)組、厄爾平衡鹽溶液(EBSS)組和黃嘌呤氧化酶(XOD)組。其中雷帕霉素組加入終濃度為1μM的Rapamycin(通過預實驗篩選獲得的最佳濃度)，厄爾平衡鹽溶液組采用EBSS替換細胞的完全培養基，黃嘌呤氧化酶組采用20mU/mL的XOD處理細胞，在處理2、8和24小時后，分別檢測細胞自噬。對照組加入相同體積的溶劑。

4)黃嘌呤氧化酶(XOD)與常用氧化劑誘導的自噬模型的優勢評價實驗

將L-02細胞按照起始濃度3×10⁵個細胞/孔接種于6孔板中，37℃、5％CO₂及飽和濕度條件細胞培養箱中培養24小時后，隨機分組為對照組、不同劑量叔丁基過氧化氫(t-BHP)組、不同劑量百草枯(PQ)組和黃嘌呤氧化酶(XOD)組。首先通過Western Blot檢測自噬標志物LC3水平變化。然后根據此結果進一步設立對照組，在叔丁基過氧化氫組根據實驗結果加入剛能顯著引起細胞自噬的濃度800μM t-BHP處理細胞，百草枯組根據實驗結果加入剛能顯著引起細胞自噬的濃度2mM PQ處理細胞，黃嘌呤氧化酶組采用20mU/mL的XOD處理細胞，24小時后，分別檢測細胞細胞凋亡和壞死，同時做72小時的細胞生長曲線。對照組加入等體積的水。

(二)指標檢測方法

1)Western Blot

細胞經過不同處理后，采用Western Blot蛋白免疫印跡法測定相關蛋白相對表達水平。具體過程：用2.5‰的胰蛋白酶將細胞消化后收集細胞，1000g離心5min棄上清，PBS清洗1遍，加入100μL RIPA細胞裂解液(1％protease inhibitor+1％phosphatase inhibitor)，-80℃反復凍融2次后，14000g，4℃，離心20min，取上清為總蛋白，并分裝蛋白樣品。取少量蛋白用BCA蛋白定量試劑盒，測定蛋白濃度，以總上樣量為30μg計算上樣體積。蛋白樣品與等量2×上樣Buffer混勻后煮沸5min，冷卻后離心混勻。根據不同分子量，分別配制濃度為7％、10％及12％的濃縮膠，按計算好的體積上樣后，150V電泳60min。用半干轉轉膜儀將蛋白轉移到PVDF膜上。5％脫脂奶粉室溫封閉2h，棄封閉液，TBST清洗膜后加入相應的一抗溶液，4℃搖床孵育過夜。用TBST洗膜3次，5min/次。5％脫脂牛奶稀釋適合的辣根酶二抗，室溫孵育2h，TBST清洗4次，5min/次。發光液均勻覆蓋膜后，凝膠成像系統進行化學發光，并使用Quantity One軟件對顯影成像進行定量分析。

2)免疫熒光

2.1)自噬小體檢測

采用免疫熒光標記細胞內LC3蛋白以示蹤自噬小體。具體過程：處理結束后，4％多聚甲醛室溫固定20min后PBS清洗3遍，0.5％TritonX-100室溫透化8min后PBS清洗3遍，然后用5％BSA溶液37℃封閉1h。棄BSA溶液后，用新鮮BSA溶液配制LC3(1：200)抗體溶液，加入培養器皿中，4℃孵育過夜。棄一抗，PBS清洗3遍，FITC羊抗兔二抗與5％BSA溶液1：100稀釋后加入培養器皿中，37℃孵育1h，PBS清洗3遍，500μL PBS/皿，用激光共聚焦顯微鏡選擇FITC Ex/Em:495/530nm波長觀察熒光點分布及數量。

2.2)線粒體自噬檢測

采用免疫熒光標記細胞內LC3蛋白以示蹤自噬小體，并與線粒體標志蛋白SDHA，即線粒體復合物Ⅱ共定位以示蹤線粒體自噬體。具體過程：處理結束后，4％多聚甲醛室溫固定20min后PBS清洗3遍，0.5％TritonX-100室溫透化8min后PBS清洗3遍，然后用5％BSA溶液37℃封閉1h。棄BSA溶液后，用LC3、SDHA及新鮮BSA溶液以1:1:200的比例配制抗體溶液，加入培養皿中，4℃孵育過夜。棄一抗，PBS清洗3遍，FITC羊抗兔二抗與5％BSA溶液1:100稀釋后加入培養皿中，37℃孵育1h，PBS清洗3遍，加500μL PBS/皿，用激光共聚焦顯微鏡選擇FITC(Ex/Em:495/530nm)波長觀察熒光點分布及數量。

3)自噬體顯微觀察

透射電子顯微鏡(TEM)下超微結構的形態學檢測是檢測自噬體的金指標。在透射電子顯微鏡下可見損傷的細胞器如線粒體的腫脹變性，其周圍出現空泡狀雙層膜樣結構、繼而雙層膜環繞成自噬體、進而與溶酶體融合，消化，也可見自噬溶酶體內最終不能降解的殘體等。樣品制備如下：處理完成后，PBS清洗3遍，用2.5‰的胰蛋白酶將細胞消化后收集細胞于1.5mL EP管中，1000g離心5min棄上清，順管壁緩慢加入戊二醛1mL/管，4℃靜置24h。用PBS沖洗3次，15min/次。后固定、脫水、滲透、包埋、正染色以及超薄切片。

4)MDC染色

MDC是一種非特異性的自噬染色劑，被細胞吸收并選擇性識別自噬溶酶體，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到細胞漿及細胞核周圍MDC標記的自噬溶酶體呈點狀分布，通過細胞內熒光點量及強度的變化的變化來衡量自噬水平的高低。細胞經處理后，PBS清洗1次，用終濃度為100nM的MDC 37℃孵育30min，PBS清洗3次，激光共聚焦下觀測。

5)熒光定量PCR

采用熒光定量PCR進行檢測mtDNA拷貝數以直接反映細胞線粒體數量并間接反映線粒體自噬水平。參考試劑盒說明書提取DNA，然后再利用DNA作為起始模板在實時PCR儀上進行后續的擴增及檢測。具體PCR條件如下：按照20μL反應體系(10μL 2×PCR Taq Master Mix+1μL模板+1μL上游引物+1μL下游引物+7μL DEPC H₂O)加入八聯管中，在熒光定量PCR儀上以95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；70℃，10min；循環40次的條件進行定量檢測。

(三)實驗結果

1)XOD誘導自噬模型的確立

1.1)XOD對細胞自噬水平的影響

MDC熒光染色結果顯示，在不同濃度XOD處理條件下，藍色熒光點代表的自噬溶酶體隨XOD劑量的加大而增多(圖1A)。隨XOD濃度增加，自噬標志蛋白LC3免疫熒光結果顯示，綠色熒光點代表的自噬小體明顯增多(圖1B)。TEM結果顯示(圖1C)，在不同濃度XOD處理條件下均可以觀察到有不同程度的自噬小體形成(箭頭所示)，為包裹有內容物的雙層膜結構，大小不均一，部分已與溶酶體融合或已被溶酶體降解成空泡樣，數量呈明顯的劑量效應關系。Western Blot結果顯示，隨XOD濃度增加，細胞自噬標志蛋白LC3Ⅱ表達水平依次升高(圖1D)，但自噬相關蛋白Atg5、Beclin1、Atg7、Atg12、LAMP2及p62等表達水平均無明顯變化(β-Actin為內參蛋白)。以上結果均顯示，在本實驗條件下，20和40mU/mL濃度XOD處理條件下可顯著誘導自噬的發生，因此，后續的實驗當中選擇誘導效果顯著，且用量較小的20mU/mL XOD作為模型處理劑量。

1.2)對XOD誘導的自噬通量進行檢測

首先采用自噬溶酶體抑制劑NH₄Cl單獨或與XOD聯合處理(XOD+NH₄Cl)細胞后，Western Blot檢測細胞自噬標志蛋白LC3Ⅱ表達水平。結果發現(圖1E)，與對照組相比，XOD單獨處理后LC3Ⅱ水平明顯升高(p＜0.05)，與NH₄Cl聯合作用后LC3Ⅱ水平進一步升高(p＜0.05)，由此說明NH₄Cl可以抑制XOD誘導的自噬體與溶酶體結合。同時采用mRFP-GFP-LC3串聯的熒光蛋白表達載體系統在熒光顯微鏡下觀察細胞自噬通量的變化。結果顯示(圖1F)，與對照組相比，XOD處理細胞后，受酸堿環境影響的紅色熒光和代表LC3水平的綠色熒光明顯升高，融合后(Merge)的黃色熒光也比對照組明顯升高。這些結果說明XOD確實引起了自噬水平的升高。

1.3)此外采用XOD處理其他多種人和動物細胞，包括人肝細胞HepG2、人肺細胞BEAS-2B、人成纖維細胞WI-38、人皮膚細胞HaCat、以及大鼠肝細胞Clone 9、小鼠肝細胞AML12，以自噬標志物LC3的水平變化來衡量自噬情況，結果發現XOD可以引起上述所有實驗細胞LC3水平發生顯著變化(圖1G)，說明XOD誘導細胞自噬具有很好的普遍性。

2)XOD誘導的自噬模型的優勢評價

2.1)與經典自噬誘導劑相比XOD誘導自噬模型的優勢

已有的自噬誘導劑有很多，但為了評價XOD誘導自噬模型的優勢，將XOD誘導自噬效果與經典自噬誘導劑Rapamycin以及EBSS做了不同時間的比較。將細胞分別用XOD、Rapamycin和EBSS處理2h、8h和24h后，分別檢測各自噬指標變化。MDC結果顯示(圖2A)，細胞處理2h后，與對照組相比，三個處理組的藍色熒光均增強，處理8h和24h后與對照組相比，各組藍色熒光均增強，其中XOD處理組最強。LC3免疫熒光結果顯示(圖2B)，細胞處理2h后，與對照組相比，XOD和Rapamycin綠色熒光點均增多，EBSS處理組變化微弱，處理8h后，三個處理組綠色熒光點數量均較對照組大，處理24h后，XOD處理組綠色熒光點數量仍最大，而Rapamycin和EBSS處理組變化不明顯。TEM結果顯示(圖2C)，細胞處理2h后，與對照組相比，三個處理組均有不同程度的自噬小體形成，其中XOD處理組形成的自噬小體最多，處理8h后，三個處理組均有不同程度的自噬小體形成，XOD處理組最多，Rapamycin處理組次之，EBSS處理組最少。Western Blot結果也顯示(圖2D)，細胞處理2h后，與對照組相比，EBSS和XOD處理組LC3 Ⅱ表達水平明顯升高(p＜0.05)，處理8h后Rapamycin和XOD處理組LC3 Ⅱ表達水平明顯升高(p＜0.05)，處理24h后XOD處理組LC3 Ⅱ表達水平明顯升高(p＜0.05)。由以上結果可以看出，Rapamycin、EBSS和XOD均可誘導細胞發生自噬，但Rapamycin和EBSS在短時間內(＜8h)可有效誘導自噬，XOD可長時間持續有效誘導細胞自噬，且呈一定的時間依賴效應關系。

2.2)與常用氧化劑誘導自噬模型相比XOD誘導自噬模型的優勢

氧化應激條件可誘導自噬的模型已有很多報道，接下來就將XOD與其他常用氧化劑誘導的自噬模型進行對比。首先，Western Blot結果顯示(圖3(a))，細胞處理24h后，與對照組相比，800μM t-BHP、2mM PQ和20mU/mL XOD處理組LC3Ⅱ表達水平明顯升高(p＜0.05)。同樣處理條件下，細胞凋亡及壞死檢測結果顯示(圖3(b))，800μM t-BHP和2mM PQ可明顯引起細胞凋亡和壞死，但能夠顯著引起LC3水平變化的XOD(20mU/mL)處理條件下，未引起明顯的細胞凋亡或壞死。此外，800μM t-BHP、2mM PQ和20mU/mL XOD分別處理細胞24h后，去除各種誘導劑，繼續培養48h，分別于處理0h，24h，48h和72h后MTT法檢測細胞活性，結果顯示(圖3(c))，0h時各組細胞活性處在相同水平，24h后，800μM t-BHP和2mM PQ處理組細胞活力較對照組明顯下降，XOD處理活力下降幅度較小，48h和72h后800μM t-BHP和2mM PQ處理組細胞活力繼續下降，XOD處理組繼續上升，72h時與對照組持平。由以上結果可以看出，與常規氧化劑t-BHP和PQ相比，XOD在誘導細胞自噬的同時，不伴隨有細胞凋亡或壞死。

2.3)XOD誘導線粒體自噬

為了進一步檢測XOD是否也誘導了線粒體自噬，采用不同的線粒體自噬檢測方法對其進行檢測。線粒體膜電位降低是線粒體自噬的前提條件，JC-1結果顯示(圖4(A))，20mU/mL的XOD處理細胞后，紅色熒光代表的富集在細胞線粒體內膜的JC-1有較明顯的降低，綠色熒光代表的游離狀的JC-1有所增加，疊加后可看到黃色熒光增強。可以說明XOD可降低線粒體膜電位。通過流式細胞儀進行定量檢測可以發現XOD處理可以顯著降低線粒體膜電位(圖4(B))。免疫熒光雙標是檢測線粒體自噬的常用方法，紅綠熒光分別標記線粒體和LC3，結果顯示(圖4(C))，XOD可使標記LC3蛋白的綠色熒光點增多，且與紅色熒光標記的線粒體共定位增加。相應采用Western Blot方法檢測線粒體自噬標志蛋白BNIP3L、FUNDC1、Parkin和PINK1并進行量化，結果發現XOD可以顯著提高這些線粒體自噬的標志蛋白的水平(圖4(D))。透射電子顯微鏡下可以看到(圖4(E))XOD處理相比對照組有空泡膜包被的線粒體。此外，熒光定量PCR結果顯示(圖4(F))，XOD使線粒體mtDNA拷貝數明顯降低，說明線粒體數量顯著減少，進一步證明了XOD可以引起線粒體自噬。以上這些結果均表明，XOD可以引起明顯的線粒體自噬。

mTOR抑制劑(雷帕霉素)和EBSS導致的饑餓均被作為自噬的陽性對照而廣泛采用。在誘導自噬效率方面，然而，在許多類型的細胞中，雷帕霉素誘導的自噬水平低且瞬時發生，因此，盡管在一些研究中它能有效誘導自噬，但在一些原代神經元細胞中卻沒有很好的效果。相比之下，EBSS可誘導各類細胞自噬，但自噬水平的活化程度依然不高，且長時間對細胞進行饑餓處理會對細胞造成不可逆的損傷。通過與經典的自噬誘導劑雷帕霉素和EBSS誘導的自噬在誘導時長以及在不同時間對自噬誘導的程度進行比較。本發明結果發現，與經典自噬誘導劑相比，XOD可在較長時間內持續、高效誘導細胞自噬。

對自噬的研究還存在另外一個難題，在很多實驗條件下，自噬往往與細胞凋亡或壞死同時發生，這使得對自噬的針對性研究造成干擾。在第一部分實驗中，發現能明顯誘導自噬的XOD劑量并沒有明顯降低細胞活力，鑒于此，通過與第一部分實驗中所采用能誘導自噬的氧化劑，在自噬誘導效果以及在相同濃度下對細胞凋亡及死亡程度進行比較。結果發現，在能明顯誘導自噬的劑量下，t-BHP及PQ導致了明顯的細胞凋亡和壞死，而XOD對細胞生存并沒有影響。由此可見，XOD誘導細胞自噬同時不伴隨有明顯的凋亡或壞死，是一種生理性細胞自噬模型。