與大白菜紫色葉球基因BrPur連鎖的分子標記的制作方法

本發明屬于蔬菜育種及分子遺傳學領域，具體涉及與大白菜紫色葉球基因BrPur連鎖的分子標記，還涉及到擴增該分子標記的引物及在大白菜輔助育種中的應用。

背景技術：

白菜 (Brassica rapa L.) 屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，是起源于我國的主要蔬菜作物之一，也是我國種植面積最大的蔬菜作物之一，同時還是世界三大油菜之一，與人們的日常生活密切相關。近年來，隨著人們生活水平的提高，人們對大白菜品質的要求日益提高，而紫色大白菜花青素含量豐富，對于人類健康的營養價值極高，因此，紫色大白菜育種受到越來越多國內外學者和育種家的重視。

研究表明紫色大白菜類黃酮類次生代謝產物豐富，尤其是花青素含量較高，不僅有利于提高白菜類作物自身的抗逆能力，而且其具有抗癌、抗氧化及心血管疾病的功效，對于人類健康具有重要的營養價值，近年來受到國內外的廣泛關注。但是，白菜葉球顏色需要在其結球期成熟后才能表現出，而且需要在田間切開葉球逐株觀察，操作起來不僅對種質材料的破壞性極大，而且費時費力，極大的延緩了育種進程。因此為了加快紫色葉球大白菜的育種速度，利用現代的分子生物技術，進行分子標記輔助育種十分必要。

隨著分子生物學技術的快速發展，多種基于DNA多態性的分子技術應運而生，并廣泛應用于遺傳育種研究的各個領域。簡單序列重復（simple sequence repeats，SSR），又稱為微衛星DNA（microsatellite，DNA），是一類由1 - 6個核苷酸串聯重復組成的DNA序列如（CA）n，（ATG）n，（TAGG）n等重復，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，由于重復次數的不同和重復程度的不完全造成了每個位點的多態性，包括SSR標記和EST-SSR標記兩種類型。其中，SSR標記具有共顯性、重復性好、多態性豐富、易于檢測等優點，已廣泛應用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位和分子標記輔助育種等研究領域（Tautz and Schl?tterer，1994；Powell et al.，1996）。

因此，基于以上SSR標記的優點，申請人利用大白菜的測序結果，開發并成功篩選出與大白菜葉球紫色基因BrPur緊密連鎖的分子標記，并構建了BrPur基因的分子遺傳圖譜，為克隆該基因及利用該分子標記進行紫色葉球大白菜分子輔助育種，加快育種進程奠定了基礎。

技術實現要素：

本發明的目的在于，提供與大白菜葉球顏色基因BrPur緊密連鎖的SSR分子標記。

本發明的還一個目的在于，提供可用于PCR擴增與大白菜葉球顏色基因BrPur緊密連鎖的SSR分子標記的引物對，以及應用該分子標記引物，通過PCR方法，獲得分子標記。以此在苗期即可鑒定區分紫色葉球大白菜和非紫色葉球大白菜，從而淘汰非目標植株，大大提高選擇的效率。

為了實現上述任務，本發明采用如下的技術解決方案：

本發明公開了與大白菜紫色葉球基因BrPur緊密連鎖的SSR分子標記，所述分子標記Sep ID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。

本發明還公開了與大白菜紫色葉球基因BrPur連鎖的SSR分子標記引物，已鑒定出的6對SSR引物，優選引物B-76（序列Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物SSR14-36（Sep ID NO.7、Sep ID NO.8）所示的序列，6對中的一對，即可將紫色葉球與非紫色葉球大白菜區分開，同時使用兩個標記能提高選擇的準確性。

[f1] 對SSR引物對的脫氧核糖核苷酸引物序列如下：

引物對B-31：

上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；

下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；

引物對B-51：

上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇

下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇

引物對B-76：

上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇

下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇

引物對SSR14-36：

上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇

下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇

引物對SSR14：

上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇

下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇

引物對SSR17：

上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇

下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇

本發明公開的分子標記，是由優選的引物對B-76（Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物對SSR14-36(Sep ID NO.7、Sep ID NO.8)經過PCR擴增獲得的。

[A2]

采用上述與大白菜紫色葉球基因BrPur緊密連鎖的SSR分子標記引物，通過DNA擴增在苗期即可鑒定區分紫色葉球和非紫色葉球大白菜，從而淘汰非目標植株，大大提高選擇的效率。同時大白菜紫色葉球基因BrPur分子遺傳圖譜的構建可加快克隆該基因。

本發明首次獲得了與大白菜紫色葉球基因BrPur最為緊密連鎖的分子標記引物，具有檢測方便，擴增穩定，重復性和準確率高等優點。其具體有益效果表現在：

（1）獲得了在第7連鎖群（A07）上大白菜紫色葉球基因BrPur的分子遺傳圖譜，且首次獲得與BrPur基因緊密連鎖的分子標記B-76和SSR14-36，可在紫色大白菜分子標記輔助育種及BrPur基因克隆中發揮重要的作用。

[A3] [A4]

（3）鑒定方便。這2個標記均為共顯性標記，具有擴增穩定、檢測方便、快速等優點。用這2個分子標記檢測BrPur基因，可以確定BrPur的存在與否及存在的狀態，進而快速篩選攜有BrPur基因的植株，并用于紫色大白菜品種的選育。同時利用分子標記進行檢測時還可以避免環境對品種的影響，提高選擇的準確性。

（4）提高紫色大白菜的選擇效率。在傳統的紫色大白菜鑒定過程中，必須等到白菜結球期成熟后才能對葉球顏色性狀進行觀察統計，因此紫色大白菜的選育不僅費時費力，而且難度大，成本高，育種周期長。用本發明的分子標記引物，通過檢查與大白菜紫色葉球基因BrPur緊密連鎖的分子標記，可將表型鑒定的工作大大減少，在苗期即可區分紫色和非紫色葉球大白菜，從而淘汰非目標植株，因此，利用本發明的與BrPur基因緊密連鎖的分子標記，不僅節約成本，而且大大的提高了育種效率，加快了育種進程。

（5）可用于克隆大白紫色葉球基因的研究。圖位克隆大白菜紫色基因BrPur的前提在于獲得與BrPur緊密連鎖的分子標記。B-76和SSR14-36在所有已知的A07分子標記中是首次報道的位于BrPur兩側并且與之連鎖最為緊密標記，這為克隆該基因提供了分子生物學基礎和遺傳學依據。

附圖說明

圖1是白菜紫色葉球基因BrPur的遺傳連鎖圖，右側為遺傳連鎖圖的標記，左側數據為標記間的遺傳距離（cM）。

圖2 是B-76在紫色和橙色親本及F₂代單株中的擴增結果；泳道信息：（從左到右）M，50 bp DNA ladder；5個純合紫色單株；5個雜合紫色單株；6個純合非紫色單株；P是紫色親本；O是橙色親本。

圖3是SSR14-36在紫色和橙色親本及F₂代單株中的擴增結果；泳道信息：（從左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色親本；O是橙色親本；5個純合紫色單株；5個雜合紫色單株；5個純合非紫色單株；。

圖4是標記B-76的引物在親本14S839和14S162間的擴增序列差異。B-76-14S839表示標記B-76的引物在親本14S839中的擴增結果；B-76-14S162表示標記B-76的引物在親本14S162中的擴增結果。

圖5是標記SSR14-36的引物在親本14S839和14S162間的擴增序列差異。SSR14-36-14S839表示標記SSR14-36的引物在親本14S839中的擴增結果；SSR14-36-14S162表示標記SSR14-36的引物在親本14S162中的擴增結果。

圖6 P1、P2分別是紫色親本材料14S839成熟期的葉球外觀和紫色球葉性狀；O1、O2分別是橙色親本材料14S162成熟期的葉球外觀和非紫色球葉性狀。

以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細說明。

具體實施方式

以下實施例中的實驗方法均為常規方法，所涉及的實驗試劑均為常規生化試劑。

本發明的與白菜紫色葉球基因BrPur緊密連鎖的SSR分子標記引物是通過以下步驟獲得的：

（1）群體材料準備

以紫色大白菜“14S839” （西北農林科技大學學報（自然科學版）2011（3）11：146-151）為父本，橙色大白菜“14S162”（秦白6號大白菜的親本之一，陜西農業科學，1999 (3)，5-6）為母本雜交產生的F1群體，然后通過單株自交獲得相應的F2群體。

（2）白菜單株基因組總DNA的提取

A、取0.2 g去掉主脈的新鮮嫩葉，塞入裝有鋼珠（鋼珠需要由質量分數為75%的酒精清洗過）的2 mL的離心管中，放入液氮中速凍，利用組織研磨儀磨成粉末；

B、向離心管中加700 μL經65 ℃預熱的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入10 μL的β-巰基乙醇，迅速混勻；

C、隨后將離心管放入65 ℃烘箱中，中間每間隔5-10 min分鐘搖一次，溫浴45 min；

D、取出離心管，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）的混合物，搖勻15 min后，常溫下10000 r/min 離心10 min；

E、將上層液相（約700μL）轉移到另一離心管中，加入等體積的氯仿和異戊醇混合溶液（氯仿：異戊醇＝24：1），輕輕搖勻10 min，常溫下10000 r/min離心10 min；

F、取上清（約500μL），加入2倍體積經預冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-20℃條件下沉淀30 min，4℃條件下8000 r/min離心5 min；

G、棄上清，加入500 μL質量百分數為75%的乙醇洗滌沉淀2次后，沉淀物室溫晾干；

H、加入500 μL的無菌蒸餾水溶解DNA，加入0.29 μL的RNase A（10 μg/μl），混勻后稍離心，37 ℃保溫30 min；

I、加入3 mol/L的NaAc溶液50 μL和2倍體積經預冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-20 ℃條件下沉淀30 min；

J、在4℃條件下，8000 r/min離心5 min，棄上清，加入質量百分數為75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室溫晾干，加入400～500 μL的滅菌ddH₂O溶解使用，或加入質量百分數為75％的乙醇-20 ℃保存備用；

（3）SSR序列的獲得

根據http://brassicadb.org/brad/index 中公布的已知引物，共選取大白菜10對染色體上已知的引物120對，利用親本材料對120對引物進行篩選，共篩選出20對差異引物，然后選擇紫色較深的F2單株和非紫色F2單株各10株，對這20對引物進行再次篩選，發現1對差異引物A710，隨后繼續選取A710引物兩側已知引物，發現了另一對差異引物A731。進一步沿A731到BrPur方向設計SSR引物。利用SSRHunter軟件對該區間序列內的SSR位點進行檢索，檢索標準為：含二、三、四、五和六核苷酸類型的SSR基序（motif）的最小重復數分別為5，4，3，3和3次。將檢索得到的含SSR位點的序列在蕓薹屬基因組網站（http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/）進行同源性比對，SSR序列選取條件為比對相似性85%以上，同時有3條以上的同源序列與該序列存在SSR位點差異。

（4）SSR分子標記引物設計

根據SSR差異位點兩端的序列，采用Primer 5.0 軟件對符合條件的目標序列設計引物。設計引物參數原則：退火溫度為50℃~70℃，最佳溫度為57℃；引物長度18bp ~26bp；產物大小為100 bp ~300bp；引物（G+C）含量為40%~60%，引物不出現二級結構、發夾結構和二聚體。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，設計合成了SSR引物297對。

（5）多態性引物篩選和SSR分子標記分析

選用所設計的297對引物，將在紫色親本和非紫色親本間表現出相同多態性的引物重復分析3次，然后選擇在F₂群體中30株極端個體間進行多態性驗證，如果擴增結果與在兩親本間擴增結果一致，則將確實存在多態性的引物用于F₂代單株的SSR分析。最后根據連鎖交換規律，結合單株基因型材料與田間對葉球顏色調查統計的結果，利用JoinMap4.0軟件構建了大白菜紫色葉球基因BrPur的分子遺傳連鎖圖1，獲得了與BrPur緊密連鎖的6個SSR標記，圖1是白菜紫色葉球基因BrPur的遺傳連鎖圖，右側為遺傳連鎖圖的標記，左側數據為標記間的遺傳距離（cM）。

6對SSR引物對的脫氧核糖核苷酸引物序列如下：

引物對B-31：

上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；

下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；

引物對B-51：

上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇

下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇

引物對B-76：

上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇

下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇

引物對SSR14-36：

上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇

下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇

引物對SSR14：

上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇

下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇

引物對SSR17：

上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇

下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇

所述的PCR擴增包括：20 μL PCR 反應體系為： 50ng/μL的模板 DNA 為2μL， 2×TaqMaster Mix 10μLM的上、下游引物各1μL，用無菌蒸餾水補充反應體系至20 μL；

PCR 反應程序為：

B-76引物：先94 ℃預變性5min；然后94 ℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共 30個循環；最后72℃再延伸10min，4℃保存。

SSR14-36引物：先94 ℃預變性5min；然后94 ℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸 30s，共 30個循環；最后72℃再延伸10min，4℃保存。

以下是發明人給出的具體實施例。

實施例：SSR14-36引物的應用

（一）采用CTAB法提取大白菜基因組DNA，提取步驟如下所示：

A. 取0.2 g去掉主脈的新鮮嫩葉片，塞入裝有鋼珠（鋼珠需要由質量分數為75%的酒精清洗過）的2 mL的離心管中，放入液氮中速凍，利用組織研磨儀磨成粉末；

B. 向離心管中加700 μL經65 ℃預熱的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 μl的β-巰基乙醇，迅速混勻；

C. 隨后將離心管放入65 ℃水浴中，中間每間隔5-10 min分鐘搖一次，水浴45 min；

D. 取出離心管，加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1），搖勻15 min后，常溫下10000 r/min離心10 min；

E. 將上層液相（約700 μL）轉移到另一離心管中，加入等體積的氯仿和異戊醇的混合物（氯仿：異戊醇=24：1），輕輕搖勻10 min，常溫下10000 r/min離心10 min；

F. 取上清（約500 μL），加入2倍體積預冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-20℃條件下沉淀30 min，4 ℃條件下8000 r/min離心5 min；

G. 棄上清，加入500 μL質量分數為75%的乙醇洗滌沉淀2次后，沉淀物室溫晾干；

H. 加入500 μL的無菌蒸餾水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 μg/μL），混勻后離心，37 ℃保溫30 min；

I.加入3 mol/L NaAc溶液50 μL和2倍體積經預冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-20 ℃條件下沉淀30 min；

J. 在4 ℃條件下，8000 r/min離心5 min，棄上清，加入質量分數為75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室溫晾干，加入400 -500 μL滅菌的ddH₂O溶解使用，或加入質量百分數為75％乙醇-20℃保存備用；

（二）PCR擴增

用紫色親本和非紫色親本DNA作模板，按照下述PCR擴增條件和程序進行分析

PCR擴增條件：

20 μL PCR 反應體系為： 50ng/μL的模板 DNA 為2 μL，2×Taq Master Mix 10μL，10 μ M的上、下游引物各1 μL，用無菌蒸餾水補充反應體系至20 μL；

② PCR反應程序為：先94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30個循環；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應在Bio-Rad S1000 96型PCR儀中進行。

（三）9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

（1）9%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備方法如下：

①玻璃板的清洗：用清水將玻璃板沖洗干凈，再用無水乙醇沖洗并空置晾干，洗板時應將帶有磨砂條的玻璃板和光滑玻璃板分開。

②裝板：將帶有磨砂條的玻璃板和光滑玻璃板兩側對齊，光滑玻璃板下側突出插入到帶有凹槽的橡皮封條中，利用1%的瓊脂糖凝膠將磨砂玻璃板與橡皮封條之間的間隙封住，瓊脂糖凝膠凝固后待用。

③灌膠：封底之后，取25 mL，9％的非變性聚丙烯酰胺凝膠溶液，加250 μL濃度為10％的過硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，輕輕混勻，灌完后，將梳子插入適當位置，再將板調至水平，室溫下膠板凝固30 min。

（2）電泳：

①點樣：往膠槽內倒入適量1×TBE電泳緩沖液（中間槽的電泳液需要高于光滑玻璃板的高度，兩側液體高度10 cm以上），將梳子從膠板中輕輕地拔出，用移液器將梳孔中殘余的凝膠和氣泡清除干凈，加入2 μL由SSR14-36引物擴增出的PCR擴增產物。

②電泳檢測：接通電源，恒壓180 V電泳檢測，時間約為90 min，待二甲苯氰跑出膠底部，停止電泳。

③卸板：將電泳完畢的凝膠從玻璃板上剝離下來，該過程在水中進行，可以減少凝膠的損壞。

（3）銀染步驟：

①沖洗：將電泳完畢的凝膠從玻璃板上剝離下來后，放入盛有蒸餾水的盤子里，輕晃5-6 s，倒掉，以洗去凝膠表面的殘余電泳液；

②染色：將膠轉入0.1 % 的硝酸銀溶液中震蕩染色8-10 min；

③水洗：將染完色的凝膠轉入蒸餾水中漂洗2-3次，洗去凝膠表面的硝酸銀殘余；

④顯色：將沖洗完畢的凝膠轉入顯色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中顯色至條帶清楚顯示；

⑤沖洗：將顯色液倒掉，用自來水沖洗膠片2-3次；

⑥保存：將沖洗后的凝膠放在膠片觀察燈上統計分析、照相，然后用保鮮膜封存，4 ℃可保存數月。

（四）結果判斷

純合紫色材料擴增出大約140bp的產物、純合非紫色材料擴增出大約128bp的產物，雜合紫色材料擴增出共顯性的產物見圖3，圖3是SSR14-36在紫色和橙色親本及F₂代單株中的擴增結果；泳道信息：（從左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色親本；O是橙色親本；5個純合紫色單株；5個雜合紫色單株；5個純合非紫色單株。圖5是標記SSR14-36的引物在親本14S839和14S162間的擴增序列差異。SSR14-36-14S839表示標記SSR14-36的引物在親本14S839中的擴增結果；SSR14-36-14S162表示標記SSR14-36的引物在親本14S162中的擴增結果。

實施例：B-76引物的應用

（一）采用CTAB法提取大白菜基因組DNA，提取步驟如下所示：

A. 取0.2 g去掉主脈的新鮮嫩葉片，塞入裝有鋼珠（鋼珠需要由質量分數為75%的酒精清洗過）的2 mL的離心管中，放入液氮中速凍，利用組織研磨儀磨成粉末；

B. 向離心管中加700 μL經65 ℃預熱的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 μL的β-巰基乙醇，迅速混勻；

C. 隨后將離心管放入65 ℃水浴中，中間每間隔5－10 min分鐘搖一次，水浴45 min；

D. 取出離心管，加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合物（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1），搖勻15 min后，常溫下10000 r/min離心10 min；

E. 將上層液相（約700 μL）轉移到另一離心管中，加入等體積的氯仿和異戊醇的混合物（氯仿：異戊醇=24：1），輕輕搖勻10 min，常溫下10000 r/min離心10 min；

F. 取上清（約500 μL），加入2倍體積預冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-20 ℃條件下沉淀30 min，4 ℃條件下8000 r/min離心5 min；

G. 棄上清，加入500 μL質量分數為75%的乙醇洗滌沉淀2次后，沉淀物室溫晾干；

H. 加入500 μL的無菌蒸餾水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 μg/μL），混勻后離心，37 ℃保溫30 min；

I.加入3 mol/L NaAc溶液50 μL和2倍體積經預冷的無水乙醇，輕輕混勻使DNA抱團，-20 ℃條件下沉淀30 min；

J. 在4 ℃條件下，8000 r/min離心5 min，棄上清，加入質量分數為75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室溫晾干，加入400－500 μL滅菌的ddH₂O溶解使用，或加入質量百分數為75％乙醇﹣20 ℃保存備用；

（二）PCR擴增

用紫色親本和非紫色親本DNA作模板，按照下述PCR擴增條件和程序進行分析

PCR擴增條件：

20 μL PCR 反應體系為： 50 ng/μL的模板 DNA 為2 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，10 μ M的上、下游引物各1 μL，用無菌蒸餾水補充反應體系至20 μL；

② PCR反應程序為：先94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30個循環；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應在Bio-Rad S1000 96型PCR儀中進行。

（三）9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

（1）9%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備方法如下：

①玻璃板的清洗：用清水將玻璃板沖洗干凈，再用無水乙醇沖洗并空置晾干，洗板時應將帶有磨砂條的玻璃板和光滑玻璃板分開。

②裝板：將帶有磨砂條的玻璃板和光滑玻璃板兩側對齊，光滑玻璃板下側突出插入到帶有凹槽的橡皮封條中，利用1%的瓊脂糖凝膠將磨砂玻璃板與橡皮封條之間的間隙封住，瓊脂糖凝膠凝固后待用。

③灌膠：封底之后，取25 mL，9％的非變性聚丙烯酰胺凝膠溶液，加250 μL濃度為10％的過硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，輕輕混勻，灌完后，將梳子插入適當位置，再將板調至水平，室溫下膠板凝固30 min。

（2）電泳：

①點樣：往膠槽內倒入適量1×TBE電泳緩沖液（中間槽的電泳液需要高于光滑玻璃板的高度，兩側液體高度10 cm以上），將梳子從膠板中輕輕地拔出，用移液器將梳孔中殘余的凝膠和氣泡清除干凈，加入2 μL由B-76引物擴增出的PCR擴增產物。

②電泳檢測：接通電源，恒壓180 V電泳檢測，時間約為90 min，待二甲苯氰跑出膠底部，停止電泳。

③卸板：將電泳完畢的凝膠從玻璃板上剝離下來，該過程在水中進行，可以減少凝膠的損壞。

（3）銀染步驟：

①沖洗：將電泳完畢的凝膠從玻璃板上剝離下來后，放入盛有蒸餾水的盤子里，輕晃5－6 s，倒掉，以洗去凝膠表面的殘余電泳液；

②染色：將膠轉入0.1 % 的硝酸銀溶液中震蕩染色8-10 min；

③水洗：將染完色的凝膠轉入蒸餾水中漂洗2－3次，洗去凝膠表面的硝酸銀殘余；

④顯色：將沖洗完畢的凝膠轉入顯色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中顯色至條帶清楚顯示；

⑤沖洗：將顯色液倒掉，用自來水沖洗膠片2－3次；

⑥保存：將沖洗后的凝膠放在膠片觀察燈上統計分析、照相，然后用保鮮膜封存，4 ℃可保存數月。

（四）結果判斷

純合紫色材料擴增出大約152bp的產物、純合非紫色材料擴增出大約160bp的產物，雜合紫色材, 料擴增出共顯性的產物見圖2，圖2是B-76在紫色和橙色親本及F₂代單株中的擴增結果；泳道信息：（從左到右）M，50 bp DNA ladder；5個純合紫色單株；5個雜合紫色單株；6個純合非紫色單株；P是紫色親本；O是橙色親本。圖4是標記B-76的引物在親本14S839和14S162間的擴增序列差異。B-76-14S839表示標記B-76的引物在親本14S839中的擴增結果；B-76-14S162表示標記B-76的引物在親本14S162中的擴增結果。

圖6中的 P1、P2分別是紫色親本材料14S839成熟期的葉球外觀和葉球剖面；O1、O2分別是橙色親本材料14S162成熟期的葉球外觀和葉球剖面。

<110> 西北農林科技大學

<120> 與大白菜紫色葉球基因BrPur連鎖的SSR分子標記擴增產物序列

<160> 16

<210> 1

<211> 152bp

<212> DNA

<213> B-76-14S839.sep

<400> 1

TGGAACGCAA ATGAACCCTC ATAGAACACT TTCGTTTTGA TTTTAGTTGA TAAAT 55

TTTCTCTTAG GATTAAATTT TGATATATAT ATATATATAT ATA....... .ACTT 102

TAATTGATCT TCTGATACGC TAAAACTGAA CTTATGTGAA TTTTGCCATC 152

<210> 2

<211> 160bp

<212> DNA

<213> B-76-14S162.sep

<400> 2

TGGAACGCAA ATGAACCCTC ATAGAACACT TTCGTTTTGA TTTTAGTTGA TAAAT 55

TTTCTCTTAG GATTAAATTT TGATATATAT ATATATATAT ATATATATAT AACTT 110

TAATTGATCT TCTGATACGC TAAAACTGAA CTTATGTGAA TTTTGCCATC 160

<210> 3

<211> 140bp

<212> DNA

<213> SSR14-36-14S839.sep

<400> 3

TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCCATATA TATATATATA TATATATATA ACAAT 55

GATATACTAC ATTTTATCAA AATAAATTAA TAATCTATAT TAGTATTTAA AAAGT 110

AATTTTTCGC ATTCAAGCTC TCACGTTAAA 140

<210> 4

<211> 128bp

<212> DNA

<213> SSR14-36-14S162.sep

<400> 4

TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCCATATA TATATGTA.. .......... ACAAT 43

GATATACT ACATTTTA TCAAAATA AATTAATA ATCTATAT TAGTATTT AAAAAGT 98

AATTTTTC GCATTCAA GCTCTCAC GTTAAA 128

<210> 5

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 引物對B-76上游人工序列

<400> 5

TGGAACGCAA ATGAACCCTC 20

<210> 6

<211> 25bp

<212> DNA

<213> 引物對B-76下游人工序列

<400> 6

GATGGCAAAA TTCACATAAG TTCAG 25

<210> 7

<211> 25bp

<212> DNA

<213> 引物對SSR14-36上游人工序列

<400> 7

TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCC 25

<210> 8

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物對SSR14-36上游人工序列

<400> 8

TTTAACGTGA GAGCTTGAAT GC 22

<210> 9

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物對B-31上游人工序列

<400> 9

GGTCAAAACC TTTCAGAACT CCC 23

<210> 10

<211> 25p

<212> DNA

<213> 引物對B-31下游人工序列

<400> 10

AATCTTATCT TTTGGTTTGG TGCTG 25

<210> 11

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物對B-51上游人工序列

<400> 11

TGGATTTGGT TAGGTGGTCA GC 22

<210> 12

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物對B-51下游人工序列

<400> 12

CATGCACTTT GGGTGGAGAT AC 22

<210> 13

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 引物對SSR14上游人工序列

<400> 13

CGAGTTGACC TGCGAACATT G 21

<210> 14

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 引物對SSR14下游人工序列

<400> 14

CGATTCCTTC ATATTTGGTT TCAC 24

<210> 15

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物對SSR17上游人工序列

<400> 15

CTCTCAATCC CTCAATCAAA CC 22

<210> 16

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 引物對SSR17下游人工序列

<400> 16

AGGAGGCGTG CGGTTATG 18