本發明屬于醫學
技術領域：
，尤其涉及一種腺病毒介導基因轉染自體骨髓間充質干細胞的檢測方法。
背景技術：
：最新研究發現，股骨頭缺血性壞死(ANFH)病人的骨髓間充質干細胞的活性和數量都出現下降，這提示該疾病的發病原因可能不是成骨細胞本身而是間充質干細胞的增殖或分化受到抑制。而干細胞移植又存在細胞表型變異失去成骨能力現象，股骨頭缺血性壞死(avascularnecrosisoffemoralhead，ANFH)是臨床上常見的骨科疾病，致殘率極高。目前的治療措施包針對早期病例的髓芯減壓、鉆孔植骨等,以及晚期病例的股骨頭置換術。這些方法效果都不甚滿意,且存在爭議。近來的研究顯示股骨頭壞死病人的骨髓中間充質干細胞的活性和數量都出現下降，這表明該疾病的發病原因可能是間充質干細胞的增殖或定向分化受到抑制。因此，利用骨髓間充質干細胞移植將成為未來治療股骨頭缺血性壞死的研究熱點。但人們用各種方法從自體紅骨髓中提純的骨髓間充質干細胞很難達到臨床應用的細胞數量，且無論是體外培養擴增還是體內移植中發現均存在細胞表型變異問題，即細胞去分化成纖維細胞特征，失去成骨能力，導致細胞數量受到限制，達不到組織構建的要求。本發明在廣西壯族自治區衛生廳計劃項目《TGF-β1誘導骨髓間充質干細胞修復全層關節軟骨缺損》的分析中也發現，單純的干細胞雖然具有很強的組織修復潛能，但其所修復的組織在3個月左右即出現退變，遠期治療效果不佳。選擇合適的細胞生長支架是任何組織構建過程中必須面對的難題，也是本發明著力要解決的問題之一。廣泛使用選取人骨形態發生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強的促成骨細胞增殖、分化的作用。在體外對骨髓間充質干細胞有強烈的成骨轉化作用。在眾多的骨生長因子中，骨形態發生蛋白2在促進骨缺損修復和骨折愈合過程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長因子。BMP-2位于骨形成過程級聯反應的上游，調控胞核內相關基因的表達，誘導細胞的成骨向分化，且成骨過程中間充質細胞、成軟骨細胞、成骨細胞等又不斷合成、分泌BMP，通過正反饋機制不斷促進成骨。本發明在桂林市科委的資助下對hBMP促進成骨作用在骨質疏松和椎體滑脫治療的研究中也證實了hBMP-2的良好的成骨誘導活性。廣泛使用的各種合成材料，即使進行了表面改性及修飾處理，但在生物學和力學性能上總是不盡人意。這使得近年來人們又將目光投向天然人工骨材料。迄今為止，研究同行在這一命題的研究多限于基因轉染細胞的體外成骨效果，而對體內如何控制骨髓間充質干細胞移植到體內后的分化方向及細胞誘導因子的持續有效的釋放等方面的研究還很不成熟，這離完整地理解并應用組織工程這一原理來修復病變組織相差甚遠。結合國內外同行的研究報道和本發明的研究基礎，不難推斷，如能將使hBMP在整個組織修復過程中持續地對細胞發生作用，使之朝我們需要的組織細胞形態分化，必將把組織工程學理論在股骨頭缺血性壞死的研究和治療向前推進一大步。綜上所述，本發明擬在股骨頭缺血性壞死的研究中，重點研究腺病毒介導的骨形態發生蛋白-2基因轉染骨髓間充質干細胞與支架材料復合修復股骨頭壞死的作用，并對其機理做更加深入的探討，為這一理論成果最終在臨床應用提供理論與實踐基礎。這一模式應用于臨床的前景十分廣闊。它將有力地促進我國在該領域的研究在世界上占有一席之地。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種腺病毒介導基因轉染自體骨髓間充質干細胞的檢測方法，旨在解決基因轉染對BMSCs增殖的影響及基因轉染的干細胞對ANFH的修復治療作用和干細胞的增殖、分化及退變過程對ANFH影響，并且目前的細胞生長支架在組織構建過程中存在生物學和力學性能上缺陷的問題。本發明是這樣實現的，一種腺病毒介導基因轉染自體骨髓間充質干細胞的檢測方法，該腺病毒介導基因轉染自體骨髓間充質干細胞的檢測方法包括：將hBMP-2基因以重組缺陷型腺病毒表達載體Ad-hBMP-2轉染骨髓基質干細胞BMSCs；根據病毒滴度以感染復數(MOI)50、100、200感染兔BMSCs。轉染48h后，熒光顯微鏡下觀察，可見感染復數為100轉染的細胞，轉染效率達95％以上；感染復數為50轉染的細胞狀態良好，但細胞內出現綠色熒光蛋白相對比較少，轉染效率約為60％左右；當感染倍數為200時的感染效率較感染倍數為100時的感染效率無明顯增加，熒光顯微鏡下見EGFP的表達說明Ad-BMP-2/EGFP包裝成功。并將轉染后的細胞與同種異體脫鈣骨DBM支架材料在體外復合；選取脫鈣骨基質24塊，放入體積分數為15％胎牛血清的DMEM培養液中浸泡12h，無菌濾紙吸干備用。選取BMP-2基因轉染48h后的BMSCs與同期對照組細胞接種，細胞懸液充分滲入后放入37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱中貼附4h，再緩慢加入體積分數為15％胎牛血清的DMEM培養液靜置培養，隔天換液。培養48h后倒置顯微鏡、熒光顯微鏡觀察細胞黏附情況，材料與細胞復合培養第7天，取各組部分樣品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，噴金后觀察。通過掃描電鏡觀察到細胞與脫鈣骨基質材料復合體外培養7天后掃描電鏡觀察可見脫鈣骨表面的細胞粘連成片，細胞布滿孔隙，呈伸展狀、立體狀生長。植入ANFH的動物模型并對所修復股骨頭進行X線、透射電鏡、組織學、免疫組化分析(半定量)及力學性能的檢測。X線檢測：術后第4、8、12周，所有實驗動物在全麻下拍攝雙髖關節正位片，X線片拍攝在放射科完成，拍攝條件為45kV、125mA，投照距離為100cm，曝光時間為32ms，其結果示：A組術后4w時，實驗側股骨頭鉆孔清晰可見，邊緣銳利，骨缺損區呈現低密度影，部分標本出現了小囊性變，股骨頭輪廓欠規則，扁平塌陷，密度不均；術后8w時，低密度透光區仍然清晰可見，缺損區周圍有骨吸收現象，股骨頭關節面進一步塌陷，且骨小梁結構不清晰；12w時股缺損區仍然透亮，股骨頭外形縮小，缺損嚴重，完全塌陷，B組術后4w時，股骨頭骨密度降低，缺損區仍然存在，填充材料呈高密度影，未見明顯吸收，周圍見明顯透光區，股骨頭無塌陷；術后8w時，股骨頭形態仍正常，填充材料周圍透光區仍清晰，鉆孔區密度高而均勻，鉆孔邊緣出現放射狀骨小梁接合現象，但骨小梁結構比較紊亂；12w股骨頭缺損區仍然存在，填充材料呈高密度影，體積較前略變小，與周圍邊界模糊，缺損區可見少許成骨反應及松散骨小梁結構，C組4、8、12w變化與B組大致相同，D組術后4w時，人工骨影模糊，鉆孔區有密度增高影，質地均勻，鉆孔邊緣變得模糊；術后8w時，人工骨影縮小，邊界不清，周圍透光區影模糊；12w股骨頭內出現規則連續骨小梁，鉆孔邊緣與人工骨交界區骨小梁接合很好，界限模糊，看不到骨缺損的低密度影，鉆孔區骨密度接近周圍骨質，未出現股骨頭塌陷和關節間隙狹窄等骨性關節炎表現；Lane-SandhuX線評分整理各組動物X線檢查結果，參照Lane-SandhuX線評分標準對各組股骨頭修復情況進行評分；HE染色和鏡檢測：取出股骨頭標本和一塊正常股骨頭，沿轉子間連線鋸斷股骨頭，行HE染色，其步驟如下：①股骨頭標本用4％多聚甲醛固定5天。②用蒸餾水將固定標本沖洗3次，然后沿轉子間連線鋸斷，投入體積分數10％硝酸溶液中進行脫鈣5天。③用梯度酒精脫水：體積分數60％酒精脫水1h，體積分數70％酒精脫水1h，體積分數80％酒精脫水過夜，體積分數90％酒精脫水lh，體積分數95％酒精脫水30min，無水乙醇脫水1h，再無水乙醇脫水1h，純氯仿中靜置48h，使組織變得透明，5.5h后更換一次純氯仿。④對上述標本進行浸蠟處理，第一蠟2h，第二蠟2h，然后用蠟塊包埋標本，行5μm厚冠狀切片，連續5張。A、B、C、D組及正常組(健側股骨頭)標本于倒置顯微鏡下觀察觀察骨小梁形態、成骨細胞并計算空骨陷窩率。空骨陷窩率＝空骨陷窩數/總骨陷窩數；其結果顯示：股骨頭正常結構可見大量骨髓組織，骨小梁規則，骨細胞形態正常，A組術后4w時骨小梁疏松，部分斷裂，大量骨細胞壞死；8w時骨小梁結構紊亂、壞死，部分壞死骨小梁開始吸收，出現較多破骨細胞；12w時骨小梁廣泛斷裂、壞死、吸收，髓腔內出現大量壞死組織，空骨陷窩被擠壓變形，B組術后4w骨小梁結構不規則，少許斷裂，軟骨細胞、骨細胞、骨髓細胞壞死量較A組少；8w時可見成骨反應，出現少許結構不規則的幼稚骨小梁；12w時缺損區周邊有成骨反應，有向中心部生長的趨向，新生骨小梁較前增多，但仍為幼稚骨小梁，仍可見壞死骨組織，C組變化與B組大致相當，D組術后4w充填區周邊出現反應帶，周邊為軟骨性骨痂形成，孔隙內見纖維肉芽組織及毛細血管長入，未見淋巴細胞浸潤等炎癥反應；8w周邊新骨帶明顯增寬，成骨反應向中心部推進,而中心部空腔面積明顯減小，部分充填區基本為幼稚的骨小梁所占據,表面有較多的成骨細胞；12w時充填區廣布相對較成熟的骨小梁,致密飽滿，無硬化帶形成，表面骨細胞數量較多且清晰可見，B和C組術后各時間點空陷細胞率、D組和正常側組12W時差異無統計學意義；微觀形貌觀察與能譜分析：取4、8、12周的四組標本和一塊正常兔股骨頭標本，每個標本剖面隨機挖取3塊1mm×1mm×0.5mm的樣本，浸入雙蒸水震蕩30min，共3次；4％多聚甲醛固定15min；25％、50％、75％、95％、100％酒精各脫水15min，自然晾干；真空鍍膜儀噴金處理；置入Quanta200FEG場發射環境掃描電鏡和X-射線能譜儀，電鏡觀察樣品表面微觀形貌，X線能譜分析儀(EnergyDispersiveSpectrometer，EDS)測定微區主要元素(碳、氮、氧、鈣、硫、磷元素)的重量百分比和原子百分比百分含量，重復3次，然后計算鈣磷比；其結果顯示：電鏡下正常骨組織板層結構致密、完整、排列方向一致，鈣化良好，表面光滑，板層之間纖維成交交錯，未見骨板斷裂、扭曲等現象，4周時，A組骨板裂痕仍然清晰，出現纖維增生；8周時見骨小梁變細，部分斷裂，纖維增生較前增加，欠規則，未見鈣化顆粒；12周時見大量扭曲纖維增生充滿視野，表面未見鈣化物，骨小梁大部分消失，無明顯新生成骨表現；B、C兩組在4～8周時可見骨小梁變細，但未出現大量斷裂現象，骨小梁表面出現“云翳狀覆蓋物”，覆蓋物表面出現鈣化顆粒沉積；12周時可見纖維表面鈣化顆粒進一步增多，部分鈣化顆粒堆積成團塊，附著于骨小梁上，但是新生骨小梁形態欠佳，新生骨版結構不整，仍不成熟，D組在4周時出現大量新生膠原纖維，形態規則，方向一致，表面可見顆粒性鈣化物，出現低鈣化類骨質；8周時鈣化物電子密度進一步增大，低密度類骨質逐漸融合成粗大骨小梁，骨小梁表面細胞漸豐富；12周時新生骨繼續改建，新生骨板致密、規則，骨小梁結構趨向正常，并出現規則的骨陷窩及骨細胞，與正常骨組織形態大致相同；正常骨組織的主要成分為鈣、磷酸鹽沉積，Ca、P含量較高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆蓋面積約為P元素峰覆蓋面積的兩倍，即Ca/P＝2.06，A組在4-12W的鈣磷含量均較低，各元素水平未見明顯變化，Ca/P為0.82，B、C兩組在4W時鈣磷含量較低；8W時Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12W時Ca、P元素含量進一步上升，P元素增速明顯減慢，各元素含量處于比較穩定狀態，Ca含量超過了P元素，B組Ca/P＝1.33,C組Ca/P＝1.52，D組在4W時即見到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加較快，呈雙峰；8W時Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P達到2.85；12W時Ca、P含量增速變緩，各元素含量逐漸穩定，Ca/P＝1.99，與正常骨組織含量及鈣磷比無較大差異，所述同種異體脫鈣骨DBM支架材料為在體外構建具有生物活性的載體-細胞因子基因轉染干細胞復合物，該同種異體脫鈣骨DBM支架材料制備方法為：健康新西蘭大白兔處死后取其四肢骨干骺端骨及椎體松質骨，根據Urist等方法經-80℃低溫凍存72h，剔除骨組織以外組織，脫鈣液脫鈣72h，置乙醚、乙醇中脫脂各24h，以無菌蒸餾水反復沖洗、浸泡，直至浸泡液呈中性為止。此時松質骨塊呈白色海綿狀，能壓縮變形并自動恢復至原狀。去酸處理后的骨塊繼續在蒸餾水中浸泡24h，取出后自然晾干,制成4mm×4mm×3mm脫鈣骨基質,環氧乙烷消毒，4℃保存備用。倒置顯微鏡下觀察支架材料有良好的孔隙結構，取部分樣品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，噴金后觀察。通過掃描電鏡觀察脫鈣骨基質材料表面較平整，可見脫鈣骨基質呈現疏松多孔結構，孔徑大小不一，形狀不規則并相互交通。脫鈣骨基質的孔隙直徑為215±86μm，孔隙率達76±3.51％，所述同種異體脫鈣骨DBM支架材料為具有天然網狀孔隙系統的原骨鹽支架三維結構。本發明按照計劃，掌握了密度梯度離心法提取兔BMSCs的實驗方法，并成功完成了兔BMSCs培養、傳代工作，之后對其表型進行了鑒定。通過探討凍存技術對細胞的影響，本發明得出短期凍存(30天以內)對細胞生物活性的影響沒有統計學意義，同時通過檢測ALP、Ⅰ型膠原蛋白實驗證明兔BMSCs在體外誘導作用下能夠像成骨細胞分化。通過病毒轉染實驗，本課題組采用腺病毒MOI為50、100、200三種實驗組進行比較，發現MOI50轉染率豬油60％，MOI100時轉染率為96％，且細胞形狀未見明顯改變，當MOI200時，轉染率也為96％，但是此時細胞形狀發生明顯改變，病毒對細胞產生了較強的細胞毒性。因此認為腺病毒的最佳MOI為100。轉染后運用PCR、Weston-blot。免疫組化方法檢測BMP-2基因在BMSCs內能夠穩定表達。本課題組根據Urist法成功構建DBM，并運用SEM檢測發現其孔隙率接近正常骨組織，最為支架材料其性能明顯優于其他支架材料。BMSCs復合DBM后，運用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡和SEM檢測，發現BMSCs與DBM復合情況良好，且復合BMSCs能在DBM表面生存，并產生細胞分泌物,證明很課題組成功構建組織工程骨。將組織工程骨進行體成骨誘導，通過茜素紅染色、SEM、EDS方法檢測鈣結節、表面微觀形貌、能譜分等指標，證明體外組織工程骨具有良好的成骨效應。經過試驗，本課題組成功掌握兔缺血性股骨頭壞死模型的制作方法，并成功制造合格的股骨頭壞死模型。將組織工程骨植入兔股骨頭壞死模型后，通過PCR、TRFQ-PCR和Wseton-blot方法檢測hBMP-2表達情況，證明hBMP-2基因能夠在異種體內表達，為后續實驗奠定了基礎。組織工程骨植入動物模型后，同意標準化飼養，盡量排出外界因素對實驗結果的影響，運用X線、解剖學觀察、HE染色、SEM、EDS方法檢測股骨頭壞死修復情況，發現植入組織工程骨的實驗組比未植入組織工程的對照組有明顯的修復效果。證明本發明的Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對缺血性股骨頭壞死有明顯的修復效果。本發明用腺病毒介導的人骨形態發生蛋白-2基因(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein-2gene,Ad-hBMP-2)轉染MSCs并與同種異體脫鈣骨(demineralizedbonematrix，DBM)支架材料在體外復合，植入股骨頭缺血性壞死(ANFH)的動物模型，期望成功修復缺血壞死的股骨頭，并使其具備正常關節所需的生物學及力學特性。基因轉染細胞后合成的蛋白經過自身細胞翻譯后修飾，能更有效地同細胞表面受體結合，調控靶細胞的生長分化。腺病毒表達載體因具有轉染效率高、目的基因高水平表達、免疫排斥反應低、安全系數高等優點，亦成為臨床基因治療的主要載體。因為骨修復是一個階段性過程，不需要轉染的目的基因長久表達，因此利用其將目的基因導入干細胞促進骨再生比較理想。選取人骨形態發生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強的促成骨細胞增殖、分化的作用。在體外對骨髓間充質干細胞有強烈的成骨轉化作用。在眾多的骨生長因子中，骨形態發生蛋白2在促進骨缺損修復和骨折愈合過程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長因子。BMP-2位于骨形成過程級聯反應的上游，調控胞核內相關基因的表達，誘導細胞的成骨向分化，且成骨過程中間充質細胞、成軟骨細胞、成骨細胞等又不斷合成、分泌BMP，通過正反饋機制不斷促進成骨。選擇合適的細胞生長支架是任何組織構建過程中必須面對的難題，也是本發明著力要解決的問題之一。廣泛使用選取人骨形態發生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強的促成骨細胞增殖、分化的作用。在體外對骨髓間充質干細胞有強烈的成骨轉化作用。在眾多的骨生長因子中，骨形態發生蛋白2在促進骨缺損修復和骨折愈合過程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長因子。BMP-2位于骨形成過程級聯反應的上游，調控胞核內相關基因的表達，誘導細胞的成骨向分化，且成骨過程中間充質細胞、成軟骨細胞、成骨細胞等又不斷合成、分泌BMP，通過正反饋機制不斷促進成骨。本發明在桂林市科委的資助下對hBMP促進成骨作用在骨質疏松和椎體滑脫治療的研究中也證實了hBMP-2的良好的成骨誘導活性。廣泛使用的各種合成材料，即使進行了表面改性及修飾處理，但在生物學和力學性能上總是不盡人意。這使得近年來人們又將目光投向天然人工骨材料。因此，本發明選擇同種異體脫鈣骨基質材料在體外構建具有生物活性的載體-細胞因子基因轉染干細胞復合物將有助于解決細胞增殖及細胞因子持續發揮作用這一難題。通過體內植入法證實同種異體脫鈣骨基質(demineralizedbonematrix,DBM)與MSCs具有良好的生物相容性，且具有體內成骨及成軟骨能力。用同種異體或異種骨制備的生物衍生骨支架材料具有天然網狀孔隙系統，原骨鹽支架的三維結構，其組成及結構符合生理要求，具有良好的組織相容性，有利于細胞的粘附生長與分化。天然骨從形態學和力學的觀點來看，都具有合成材料無法比擬的優勢。脫鈣松質骨的吸收與新骨的形成基本同步,既為新骨生成提供支架,又不影響新骨的塑形，具有較好的細胞界面，利于細胞貼附、遷移與增殖。本發明也對脫鈣骨材料的生物學特征以及與干細胞的生物相容性方面進行了比較系統的分析，已證實它是一種比較理想的生物支架材料。在細胞增殖的整個周期，其降解速度與細胞增殖及分泌細胞外基質的速度相吻合，其降解率及生物黏附性能均能滿足骨髓間充質干細胞的增殖需要。迄今為止，研究同行在這一命題的研究多限于基因轉染細胞的體外成骨效果，而對體內如何控制骨髓間充質干細胞移植到體內后的分化方向及細胞誘導因子的持續有效的釋放等方面的研究還很不成熟，這離完整地理解并應用組織工程這一原理來修復病變組織相差甚遠。通過本發明使hBMP在整個組織修復過程中持續地對細胞發生作用，使之朝需要的組織細胞形態分化，必將把組織工程學理論在股骨頭缺血性壞死的研究和治療向前推進一大步。綜上所述，本發明擬在股骨頭缺血性壞死的研究中，重點研究腺病毒介導的骨形態發生蛋白-2基因轉染骨髓間充質干細胞與支架材料復合修復股骨頭壞死的作用，并對其機理做更加深入的探討，為這一理論成果最終在臨床應用提供理論與實踐基礎。這一模式應用于臨床的前景十分廣闊。它將有力地促進我國在該領域的研究在世界上占有一席之地。通過本發明，闡明干細胞的增殖、定向分化及退變的條件及影響因素；通過體外測試，選擇最適合的細胞移植濃度并制定相應參數，為干細胞治療ANFH提供細胞學理論支持。通過本發明，證實干細胞的基因修飾對維持其細胞表型、控制其定向分化的重要性。通過對Ad-hBMP-2轉染MSCs復合DBM體內植入后所修復壞死股骨頭的數據分析，成功論證骨髓間充質干細胞的數量、分化及退變等與股骨頭缺血性壞死的關系，闡明這一模式治療ANFH的機理，為干細胞治療股骨頭缺血性壞死這一理論成果最終向臨床過渡提供依據與支持。通過本發明，培養研究生掌握組織工程學理論的實驗技術，為他們以后的研究奠定扎實的基礎。附圖說明圖1是本發明實施例提供的腺病毒介導基因轉染自體骨髓間充質干細胞的檢測方法流程圖。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。下面結合試驗對本發明的應用原理作進一步描述。1.自體MSCs的體外分離、培養、擴增、細胞表型的鑒定及體外定向誘導分化試驗。1.1骨髓液提取：0.7％無巴比妥1ml/Kg耳緣靜脈注射，待兔子麻醉后剔除剔除股骨粗隆周圍毛發，用碘伏消毒，用12號骨穿針外接10ml注射器，注射器內含稀釋的肝素103U/L0.2ml，從股骨大轉子處穿刺抽取骨髓7ml，加入含有5mlDMEM培養基的離心管中充分混勻，在轉速為1500rap/min離心5min。棄上清，加入3mlDMEM培養基重懸浮。1.2原代細胞培養：將重懸浮的骨髓液用吸管緩慢注入預置有等體積70％的percoll分離液，在轉速2500r/min離心20min。提取中間絮狀層，加入DMEM培養基至5ml，在轉速為1500r/min的轉速下離心5min，棄上層清液加入含有15％胎牛血清的DMEM培養基7ml重懸浮接種于60mm培養皿中。放入CO2濃度為5％，溫度為37℃的恒溫箱中培養。接種24小時在倒置顯微鏡下觀察，見呈圓形的單核細胞，未見貼壁細胞。接種72小時后，在倒置顯微鏡下觀察見好量細胞貼壁，成短梭性。在接種后的第5天棄原培養基，PBS洗滌3次。加入含15％FBS的DMEM5ml，以后每周換液兩次。在接種后的第10天，在顯微鏡下觀察見細胞的大部分貼壁，并且呈旋渦狀，生長狀態良好。原代骨髓間充質干細胞1.3傳代細胞培養：接種后7天，將細胞從培養箱取出，在倒置顯微鏡下觀察見細胞生長良好，并且呈現長梭狀，融合率達80％。將原培養基棄除，用PBS洗滌3次。加入0.25％含有EDTA的胰蛋白酶0.5ml，放置于溫室孵育箱3～5min后，在倒置顯微鏡下觀察見大部分細胞呈圓形脫落，隨液體流動。加入5mlDMEM終止消化，用吸管反復吹打，使貼壁細胞盡可能的完全脫落下來，移入離心管中，1500rap/min，離心5min后，棄上層清液，加入5ml含有15％FBS的DMEM反復吹打，使細胞呈單個細胞。將細胞液按1:2接種于新的60mm培養皿中進行傳代培養。記為P1放置于培養箱中繼續培養。以后的傳代細胞記為P2，P3…代細胞。第20代BMSCs1.4MTT檢測：取生長狀態良好地P2，P4代細胞，棄培養基，PBS洗滌3次后，加入0.25％含有EDTA的胰蛋白酶0.5ml，放置于溫室孵育箱1～2min后，在倒置顯微鏡下觀察見大部分細胞呈圓形脫落，隨液體流動。加入4mlDMEM終止消化，用吸管反復吹打，使貼壁細胞盡可能的完全脫落下來，移入離心管，1500rap/min，離心5min后，棄上層清液，加入4mlDMEM,用吸管反復吹打使細胞呈單細胞懸液，滴加10ul在細胞計數板上，在顯微鏡下進行細胞計數。細胞濃度＝(A1+A2+A3+A4)÷4×10000.所需細胞懸液體積＝細胞數÷細胞濃度。以2.5×103個細胞/孔移入7個96孔板(一天用一塊96孔板防止污染)，每孔100μl，每組設5孔，再在每孔加入含5％FBS的DMEM培養基。分別于接種后1、2、3、4、5、6、7天加MTT液(MTT用PBS溶解濃度為5mg/ml，過濾滅菌，4℃避光保存)10μl，37℃孵育4小時，小心棄除培養液，加入DMSO150μl，振蕩待甲臜產物充分溶解，置酶標儀測定OD值(波長490nm)，計算每組5個孔OD的平均值，以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞增殖。1.5流式細胞儀檢測細胞周期：取生長狀態良好的P1,P4代細胞，加入0.25％的胰蛋白酶(含有EDTA)0.5ml，放置在溫室孵育箱孵育3～5分鐘。在倒置顯微鏡下觀察，見大部分細胞脫落，呈圓形并隨液體流動，加入5mlDMEM培養基終止消化，1500rap/min，離心5min，棄上層清液。加入3mlPBS洗滌3遍，1500rap/min，離心5min。離心后棄上層清液，加入1mlPBS重懸浮，震蕩加入9ml70％冰乙醇。放置于4℃冰箱固定30min。1500rap/min，離心5min，離心后去上層清液，加入冷PBS洗滌1次，加入400ulPI染液，室溫避光放置15min。1.6BMSCs表型檢測：取第10代兔BMSCs約1.5×106個，胰酶消化，1500轉/min離心5min，PBS洗滌2次，加入100ul的PBS重懸細胞；分別加一抗鼠抗兔CD44、CD45，室溫放置30min；用PBS洗滌2次，100ulPBS重懸細胞，加入相應二抗山羊抗小鼠PerCP標記單克隆抗體，室溫避光放置30min；加PBS洗滌3次，以300ulPBS重懸細胞，上機。1.7探究凍存技術對BMSCs的影響以及體外定向誘導分化實驗：1.7.1凍存與復蘇：取對數生長期的第5代兔BMSCs消化、離心，加入凍存保護液，程序降溫過夜后轉入液氮中30d復蘇，凍存后細胞復蘇后24小時內細胞可貼壁，但不貼壁細胞數目較對照組增加，細胞梭形，較瘦長，部分細胞出現老化，傳代時間延長，多次傳代后細胞可逐漸恢復凍存前狀態，1.7.2.BMSCs復蘇后計算細胞存活率、MTT吸光度發現：短期凍存后BMSCs的存活率為(84.38士3.78)％，實驗組細胞生長潛伏期延長，MTT吸光值從第3天開始增加(即細胞增殖速度)，第4天后增殖速度能夠與對照組持平(P>0.05，n＝8)，隨后進入平臺期。1.7.3細胞周期檢測實驗組對照組各選1皿細胞消化、離心、洗滌，流式細胞儀進行細胞周期檢測。實驗組對照組G1、S、G2/M期的細胞比例及增殖指數(PI)差異無統計學意義(P>0.05，n＝9)。1.7.4BMSCs表面標志實驗組對照組表面抗原陽性率(％)分別為CD44：93.62±1.05、93.95±0.71；CD45：0.24±0.11、0.29±0.10，經統計學處理差異無統計學意義(P>0.05，n＝3)，凍存復蘇對BMSCs表面抗原無明顯影響，細胞并未因凍存而發生變異。1.7.5.ALP表達情況實驗組和對照組經成骨誘導后7d、14d后ALP含量，隨誘導時間增加，ALP含量呈遞增趨勢，兩個時間點，實驗組和對照組ALP含量變化均無統計學差異(P>0.05，n＝9)。1.7.6Ⅰ型膠原免疫組織化學染色成骨誘導14d，實驗組和對照組Ⅰ型膠原染色均呈陽性表達，細胞胞漿出現棕黃色顆粒，大小形態均一，經凍存后BMSCsⅠ型膠原蛋白表達量(平均光密度分析)變化與未凍存組相比無統計學意義(P>0.05，n＝9)。1.7.7鈣結節茜素紅染色實驗組和對照組成骨誘導分化培養到約10d左右細胞呈梭形表面粗糙，細胞間隙緊密，細碎顆粒、扁平樣改變，14d左右漩渦中心形成細胞團，21d形成鈣化結節，肉眼可見培養皿底散在白色狀物，染色后均為紅色，兩組鈣結節面積差異無統計學意義(P>0.05，n＝9)。2.Ad-hBMP-2轉染MSCs的試驗，轉染后檢測目的基因骨形態發生蛋白-2的表達。2.1Ad-BMP-2/GFP轉染兔BMSCs根據病毒滴度以感染復數(MOI)50、100、200感染兔BMSCs。轉染48h后，熒光顯微鏡下觀察，可見感染復數為100轉染的細胞，轉染效率達95％以上，感染復數為50轉染的細胞狀態良好，但細胞內出現綠色熒光蛋白相對比較少，轉染效率約為60％左右，當感染倍數為200時的感染效率較感染倍數為100時的感染效率無明顯增加，熒光顯微鏡下見EGFP的表達說Ad-BMP-2/EGFP包裝成功。Ad-BMP-2/GFP染兔BMSCsa:MOI:50,b:MOI:100,c:MOI:200。2.2免疫組化取Ad-BMP-2轉染48h后的細胞消化后爬片，按S-P免疫組化試劑盒進行操作，DAB顯色，封片，倒置顯微鏡觀察，未轉染組當對照。轉染后BMP-2、免疫組化檢測結果示兔BMSCs細胞胞漿呈陽性表達，可見棕黃色染色，而未轉染細胞呈陰性，可能由于細胞內分泌的BMP-2蛋白量較少，抗原抗體結合量不足，估胞漿無染色，2.3Westen-blot檢測轉染后細胞BMP-2的表達轉染后48h，分別提取轉染48h后及未轉染的細胞蛋白，Western-blot檢測到約Mr30000大小的陽性條帶，而Ad-EGFP組及未轉染組的條帶較弱，說明Ad-BMP-2/EGFP轉染兔BMSCs后BMP2目的蛋白在細胞內有高表達。3.同種異體DBM材料的制備、生物相容性檢測及力學性能分析。健康新西蘭大白兔處死后取其四肢骨干骺端骨及椎體松質骨，根據Urist等方法經-80℃低溫凍存72h，剔除骨組織以外組織，脫鈣液(桂林醫學院附屬醫院病理科提供)脫鈣72h，置乙醚、乙醇中脫脂各24h，以無菌蒸餾水反復沖洗、浸泡，直至浸泡液呈中性為止。此時松質骨塊呈白色海綿狀，能壓縮變形并自動恢復至原狀。去酸處理后的骨塊繼續在蒸餾水中浸泡24h，取出后自然晾干,制成4mm×4mm×3mm脫鈣骨基質,環氧乙烷消毒，4℃保存備用。倒置顯微鏡下觀察支架材料有良好的孔隙結構，取部分樣品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，噴金后觀察。通過掃描電鏡觀察脫鈣骨基質材料表面較平整，可見脫鈣骨基質呈現疏松多孔結構，孔徑大小不一，形狀不規則并相互交通。脫鈣骨基質的孔隙直徑為215±86μm，孔隙率達76±3.51％，4.Ad-hBMP-2轉染MSCs與DBM的體外復合試驗，掌握兩者之間最佳復合條件。選取脫鈣骨基質24塊，放入體積分數為15％胎牛血清的DMEM培養液中浸泡12h，無菌濾紙吸干備用。選取BMP-2基因轉染48h后的BMSCs與同期對照組細胞接種，細胞懸液充分滲入后放入37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱中貼附4h，再緩慢加入體積分數為15％胎牛血清的DMEM培養液靜置培養，隔天換液。培養48h后倒置顯微鏡、熒光顯微鏡觀察細胞黏附情況，所示。材料與細胞復合培養第7天，取各組部分樣品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，噴金后觀察。通過掃描電鏡觀察到細胞與脫鈣骨基質材料復合體外培養7天后掃描電鏡觀察可見脫鈣骨表面的細胞粘連成片，細胞布滿孔隙，呈伸展狀、立體狀生長，5.DBM/Ad-hBMP-2轉染MSCs的體內植入試驗，并對所修復股骨頭進行放射學(X線及MRI)、解剖學、組織學、電鏡掃描、能譜分析檢測，評估其對股骨頭壞死的修復效果。5.1制造兔股骨頭壞死模型：實驗動物均右側參與實驗，參照髓芯減壓術聯合液氮冰凍的操作步驟，實驗動物取俯臥位，10％水合氯醛水溶液耳緣靜脈注射(3ml/kg)麻醉。找到股骨頭體表投影位置，橫線為脊柱位置，“●”為股骨大轉子，“+”為股骨頭體表投影。由臀大肌與闊筋膜張肌的間隙進入，暴露臀小肌及髓關節外旋肌群，并貼骨面將其切斷，暴露關節囊以后小十字口切開，外旋股骨頭，使股骨頭暴露而不使其脫位，在骨與軟骨的交界處用直徑為3.5mm的無菌鉆頭，向股骨頭方向打孔，深度為4mm，用小刮匙刮除股骨頭內骨質，造成約50％的缺損，然后用液氮持續冷凍股骨頭，約5min，手術后飼養四周，X線確認造模是否成功，5.2將組織工程骨植入動物模型體內，用RT-PCR、RTFQ-PCR和Westen-blot檢測hBMP-2在動物體內的活性：5.2.1選取36只造模成功實驗動物，隨機分為A、B、C三組，分別向股骨頭壞死部位填塞DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，然后用醫用凝膠海綿封閉隧道口，逐層關閉切口；術后各組實驗動物臀大肌處注射青霉素鈉注射液預防感染(40萬單位/只·天，連續3天)。5.2.2PCR檢測hBMP-2基因的表達:術后1、2、3周各組分別處死4只兔子，取部分股骨頭樣品放入研缽，加入液氮，研磨成粉末后加入1.5mlEP管，然后按照總RNA提取試劑盒(離心柱型)操作步驟操作，并通過凝膠電泳進行質量檢測，使用分光光度計進行純度濃度測定，計算出RT-PCR反應體系(20μl體系)中所需1μgRNA所需的體積量。使用PCR儀與M-MLVFirstStrandKit試劑盒合成cDNA。根據hBMP-2的基因序列利用primer5.0合成引物，使用PCR儀與2×TaqPCRMasterMix試劑盒進行PCR擴增，擴增產物采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用培清JS-780全自動凝膠成像分析系統進行拍照、分析。結果顯示：凝膠成像分析系統顯示:DNAMarker大小為100-600bp，GAFDH大小為221bp，目的條帶(hBMP-2)大小為180bp。術后1、2、3周，A組和B組hBMP-2目的基因均為陰性表達，C組在植入后第1、2、3W后hBMP-2目的基因均為陽性表達，5.2.3RTFQ-PCR技術檢測hBMP-2基因的表達:取1.2.3中C組1、2、3WRNA1μg，逆轉錄合成為cDNA。逆轉錄產物用7500Fast實時熒光定量PCR儀檢測分析。結果顯示：RTFQ-PCR:C組兔子植入hBMP-2/BMSCs/DBM后，第1、2、3周時hBMP-2基因均有表達。設C組術后1周時hBMP-2基因的相對表達量為(RQ)＝1，2、3WRQ值分別為0.947±0.025、0.895±0.059。1周與2周比較P＝0.072＞0.05，2周與3周比較P＝0.081＞0.05，無統計學差異。5.2.4WesternBlot檢測hBMP-2蛋白的表達:術后1、2、3周各組分別處死4只兔子，取部分股骨頭樣品放入研缽，加入液氮，研磨成粉末后按照總蛋白提取盒步驟提取總蛋白。提取物用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，轉膜，一抗，二抗，顯影，Bio-RadChemiDocXRS+化學發光成像系統曝光，以內參為標準，計算出每組蛋白的相對表達量。其結果顯示：術后1、2、3周A組和B組hBMP-2蛋白均為陰性表達，C組hBMP-2蛋白均為陽性表達，凝膠成像系統灰度分析顯示:C組術后1、2、3周hBMP-2蛋白目的/內參表達量的值分別為0.530±0.056、0.507±0.066、0.475±0.086，且1周與2周、1周與3周、2周與3周兩兩比較的P值分別為:0.702、0.382、0.607，均大于0.05，無統計學差異，5.3將組織工程骨植入動物模型，評估其對股骨頭壞死的修復效果。5.3.1選取48只動物模型，隨機分為A、B、C、D組，每組12只。A組為造模組，不做處理，復溫后立即逐層關閉切口；B、C、D各組動物在造模復溫后沿向鉆孔內分別填塞體積為3mm×3mm×3mm大小的DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，醫用凝膠海綿封閉隧道口，逐層關閉切口；術后各組動物臀大肌注射青霉素鈉預防感染(40萬U/只/d，連續3d)。5.3.2X線檢查：術后第4、8、12周，所有實驗動物在全麻下拍攝雙髖關節正位片，X線片拍攝在桂林醫學院附屬醫院醫院放射科完成，拍攝條件為45kV、125mA，投照距離為100cm，曝光時間為32ms。其結果示：A組術后4w時，實驗側股骨頭鉆孔清晰可見，邊緣銳利，骨缺損區呈現低密度影，部分標本出現了小囊性變，股骨頭輪廓欠規則，扁平塌陷，密度不均；術后8w時，低密度透光區仍然清晰可見，缺損區周圍有骨吸收現象，股骨頭關節面進一步塌陷，且骨小梁結構不清晰；12w時股缺損區仍然透亮，股骨頭外形縮小，缺損嚴重，完全塌陷，B組術后4w時，股骨頭骨密度降低，缺損區仍然存在，填充材料呈高密度影，未見明顯吸收，周圍見明顯透光區，股骨頭無塌陷；術后8w時，股骨頭形態仍正常，填充材料周圍透光區仍清晰，鉆孔區密度高而均勻，鉆孔邊緣出現放射狀骨小梁接合現象，但骨小梁結構比較紊亂；12w股骨頭缺損區仍然存在，填充材料呈高密度影，體積較前略變小，與周圍邊界模糊，缺損區可見少許成骨反應及松散骨小梁結構，C組4、8、12w變化與B組大致相同，D組術后4w時，人工骨影模糊，鉆孔區有密度增高影，質地均勻，鉆孔邊緣變得模糊；術后8w時，人工骨影縮小，邊界不清，周圍透光區影模糊；12w股骨頭內出現規則連續骨小梁，鉆孔邊緣與人工骨交界區骨小梁接合很好，界限模糊，看不到骨缺損的低密度影，鉆孔區骨密度接近周圍骨質，未出現股骨頭塌陷和關節間隙狹窄等骨性關節炎表現，5.3.3Lane-SandhuX線評分整理各組動物X線檢查結果，參照Lane-SandhuX線評分標準對各組股骨頭修復情況進行評分，其標準見表1：表1.Lane-SandhuX線評分標準含義分值骨形成無骨形成0骨形成占缺損25％1骨形成占缺損50％2骨形成占缺損75％3骨形成充滿缺損4骨連接骨折線清楚0骨折線消失2骨折線部分存在4骨塑形未見骨塑形0骨髓腔形成2皮質骨塑形45.3.4股骨頭大體觀察術后4周、8周、12周行X線檢查后，每組隨機選取4只實驗動物，以空氣栓塞法處死，取出雙側股骨，清除表面組織，觀察股骨頭形態，測量鉆孔孔徑，測量完畢后置入-80℃超低溫冰箱保存，以備后續實驗使用。其結果顯示：A組術后4w鉆孔存在，孔徑(3.200±0.163)mm，鉆孔周圍可見少許纖維組織，股骨頭部分塌陷；8w孔徑(3.225±0.150)mm，纖維組織繼續增生；12w鉆孔依然存在，孔徑(3.275±0.096)mm，股骨頸縮短，周圍可見大量鮮紅色纖維組織覆蓋，股骨頭完全塌陷，B組術后4w鉆孔清晰可見，孔徑(3.000±0.141)mm，股骨頭未見塌陷；8w時孔徑呈橢圓形，周圍可見少許成骨，股骨頭無塌陷；12w時鉆孔呈不規則形，長徑(2.500±0.141)mm，股骨頭無塌陷，C組術后4w仍可見鉆孔，孔徑(3.200±0.163)mm，股骨頭無塌陷；8w時孔徑(2.825±0.126)mm，鉆孔周圍有少許成骨，股骨頭未見塌陷；12w時鉆孔徑(2.475±0.170)mm，可見成骨反應，股骨頭無塌陷，D組術后4w可見鉆孔不規則改變，孔徑(2.475±0.170)mm，周圍可見少許成骨反應，股骨頭未見塌陷；8w時孔徑(1.500±0.216)mm，周邊可見明顯成骨反應，開始有新生骨長入缺損區，色澤近似周圍組織；12w鉆孔已經完全消失，完全被新生骨替代，鉆孔區僅殘留少許結節樣修復痕跡，新生骨色澤與正常組織無明顯差異，股骨頭完好，5.3.5HE染色和鏡檢：取出1.2.6中股骨頭標本和一塊正常股骨頭，沿轉子間連線鋸斷股骨頭，行HE染色，其步驟如下：①股骨頭標本用4％多聚甲醛固定5天。②用蒸餾水將固定標本沖洗3次，然后沿轉子間連線鋸斷，投入體積分數10％硝酸溶液中進行脫鈣5天。③用梯度酒精脫水：體積分數60％酒精脫水1h，體積分數70％酒精脫水1h，體積分數80％酒精脫水過夜，體積分數90％酒精脫水lh，體積分數95％酒精脫水30min，無水乙醇脫水1h，再無水乙醇脫水1h，純氯仿中靜置48h，使組織變得透明，5.5h后更換一次純氯仿。④對上述標本進行浸蠟處理，第一蠟2h，第二蠟2h，然后用蠟塊包埋標本，行5μm厚冠狀切片，連續5張。A、B、C、D組及正常組(健側股骨頭)標本于倒置顯微鏡下觀察觀察骨小梁形態、成骨細胞并計算空骨陷窩率。空骨陷窩率＝空骨陷窩數/總骨陷窩數。其結果顯示：股骨頭正常結構可見大量骨髓組織，骨小梁規則，骨細胞形態正常，A組術后4w時骨小梁疏松，部分斷裂，大量骨細胞壞死；8w時骨小梁結構紊亂、壞死，部分壞死骨小梁開始吸收，出現較多破骨細胞；12w時骨小梁廣泛斷裂、壞死、吸收，髓腔內出現大量壞死組織，空骨陷窩被擠壓變形，B組術后4w骨小梁結構不規則，少許斷裂，軟骨細胞、骨細胞、骨髓細胞壞死量較A組少；8w時可見成骨反應，出現少許結構不規則的幼稚骨小梁；12w時缺損區周邊有成骨反應，有向中心部生長的趨向，新生骨小梁較前增多，但仍為幼稚骨小梁，仍可見壞死骨組織，C組變化與B組大致相當，D組術后4w充填區周邊出現反應帶，周邊為軟骨性骨痂形成，孔隙內見纖維肉芽組織及毛細血管長入，未見淋巴細胞浸潤等炎癥反應；8w周邊新骨帶明顯增寬，成骨反應向中心部推進,而中心部空腔面積明顯減小，部分充填區基本為幼稚的骨小梁所占據,表面有較多的成骨細胞；12w時充填區廣布相對較成熟的骨小梁,致密飽滿，無硬化帶形成，表面骨細胞數量較多且清晰可見，B和C組術后各時間點空陷細胞率、D組和正常側組12W時差異無統計學意義，見表2。術后12w骨小梁觀察(HE，×100)a～e分別為正常組織、A、B、C及D組；箭頭示骨小梁；表42空骨陷窩率(n＝12,x±s)；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組，P＜0.055.3.6微觀形貌觀察與能譜分析：取4、8、12周的四組標本和一塊正常兔股骨頭標本，每個標本剖面隨機挖取3塊1mm×1mm×0.5mm的樣本，浸入雙蒸水震蕩30min，共3次；4％多聚甲醛固定15min；25％、50％、75％、95％、100％酒精各脫水15min，自然晾干；真空鍍膜儀噴金處理；置入Quanta200FEG場發射環境掃描電鏡和X-射線能譜儀，電鏡觀察樣品表面微觀形貌，X線能譜分析儀(EnergyDispersiveSpectrometer，EDS)測定微區主要元素(碳、氮、氧、鈣、硫、磷元素)的重量百分比和原子百分比百分含量，重復3次，然后計算鈣磷比。其結果顯示：電鏡下正常骨組織板層結構致密、完整、排列方向一致，鈣化良好，表面光滑，板層之間纖維成交交錯，未見骨板斷裂、扭曲等現象，4周時，A組骨板裂痕仍然清晰，出現纖維增生；8周時見骨小梁變細，部分斷裂，纖維增生較前增加，欠規則，未見鈣化顆粒；12周時見大量扭曲纖維增生充滿視野，表面未見鈣化物，骨小梁大部分消失，無明顯新生成骨表現。B、C兩組在4～8周時可見骨小梁變細，但未出現大量斷裂現象，骨小梁表面出現“云翳狀覆蓋物”，覆蓋物表面出現鈣化顆粒沉積；12周時可見纖維表面鈣化顆粒進一步增多，部分鈣化顆粒堆積成團塊，附著于骨小梁上，但是新生骨小梁形態欠佳，新生骨版結構不整，仍不成熟，D組在4周時出現大量新生膠原纖維，形態規則，方向一致，表面可見顆粒性鈣化物，出現低鈣化類骨質；8周時鈣化物電子密度進一步增大，低密度類骨質逐漸融合成粗大骨小梁，骨小梁表面細胞漸豐富；12周時新生骨繼續改建，新生骨板致密、規則，骨小梁結構趨向正常，并出現規則的骨陷窩及骨細胞，與正常骨組織形態大致相同，正常骨組織的主要成分為鈣、磷酸鹽沉積，Ca、P含量較高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆蓋面積約為P元素峰覆蓋面積的兩倍，即Ca/P＝2.06，A組在4-12W的鈣磷含量均較低，各元素水平未見明顯變化，Ca/P為0.82，B、C兩組在4W時鈣磷含量較低；8W時Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12W時Ca、P元素含量進一步上升，P元素增速明顯減慢，各元素含量處于比較穩定狀態，Ca含量超過了P元素，B組Ca/P＝1.33,C組Ca/P＝1.52，D組在4W時即見到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加較快，呈雙峰；8W時Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P達到2.85；12W時Ca、P含量增速變緩，各元素含量逐漸穩定，Ca/P＝1.99，與正常骨組織含量及鈣磷比無較大差異；本發明描述了密度梯度離心法提取兔BMSCs的實驗方法，并成功完成了兔BMSCs培養、傳代工作，之后對其表型進行了鑒定。通過探討凍存技術對細胞的影響，我課題組得出短期凍存(30天以內)對細胞生物活性的影響沒有統計學意義，同時通過檢測ALP、Ⅰ型膠原蛋白實驗證明兔BMSCs在體外誘導作用下能夠像成骨細胞分化。通過病毒轉染實驗，本課題組采用腺病毒MOI為50、100、200三種實驗組進行比較，發現MOI50轉染率豬油60％，MOI100時轉染率為96％，且細胞形狀未見明顯改變，當MOI200時，轉染率也為96％，但是此時細胞形狀發生明顯改變，病毒對細胞產生了較強的細胞毒性。因此認為腺病毒的最佳MOI為100。轉染后運用PCR、Weston-blot。免疫組化方法檢測BMP-2基因在BMSCs內能夠穩定表達。本發明根據Urist法成功構建DBM，并運用SEM檢測發現其孔隙率接近正常骨組織，最為支架材料其性能明顯優于其他支架材料。BMSCs復合DBM后，運用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡和SEM檢測，發現BMSCs與DBM復合情況良好，且復合BMSCs能在DBM表面生存，并產生細胞分泌物,證明很課題組成功構建組織工程骨。將組織工程骨進行體成骨誘導，通過茜素紅染色、SEM、EDS方法檢測鈣結節、表面微觀形貌、能譜分等指標，證明體外組織工程骨具有良好的成骨效應。經過試驗，本課題組成功掌握兔缺血性股骨頭壞死模型的制作方法，并成功制造合格的股骨頭壞死模型。將組織工程骨植入兔股骨頭壞死模型后，通過PCR、TRFQ-PCR和Wseton-blot方法檢測hBMP-2表達情況，證明hBMP-2基因能夠在異種體內表達，為后續實驗奠定了基礎。組織工程骨植入動物模型后，同意標準化飼養，盡量排出外界因素對實驗結果的影響，運用X線、解剖學觀察、HE染色、SEM、EDS方法檢測股骨頭壞死修復情況，發現植入組織工程骨的實驗組比未植入組織工程的對照組有明顯的修復效果。證明本發明設計的Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對缺血性股骨頭壞死有明顯的修復效果。下面結合附圖1對本發明進一步說明。一種腺病毒介導基因轉染自體骨髓間充質干細胞的檢測方法，該腺病毒介導基因轉染自體骨髓間充質干細胞的檢測方法包括：S101：將hBMP-2基因以重組缺陷型腺病毒表達載體Ad-hBMP-2轉染骨髓基質干細胞BMSCs；S102：并將轉染后的細胞與同種異體脫鈣骨DBM支架材料在體外復合；S103：植入ANFH的動物模型并對所修復股骨頭進行X線、透射電鏡、組織學、免疫組化分析(半定量)及力學性能的檢測。下面結合實施例對本發明的應用原理作進一步描述。本發明提供的旨在探討基因轉染對BMSCs增殖的影響及基因轉染的干細胞對ANFH的修復治療作用，闡明干細胞的增殖、分化及退變過程與ANFH的關系及其影響因素，為基因組織工程治療ANFH提供實驗依據。該課題是在總結國內外體外實驗基礎上的一個大膽嘗試和創新。本發明在廣西壯族自治區衛生廳計劃項目《TGF-β1誘導骨髓間充質干細胞修復全層關節軟骨缺損》的分析中也發現，單純的干細胞雖然具有很強的組織修復潛能，但其所修復的組織在3個月左右即出現退變，遠期治療效果不佳。本發明針對這一問題，用腺病毒介導的人骨形態發生蛋白-2基因(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein-2gene,Ad-hBMP-2)轉染MSCs并與同種異體脫鈣骨(demineralizedbonematrix，DBM)支架材料在體外復合，植入股骨頭缺血性壞死(ANFH)的動物模型，期望成功修復缺血壞死的股骨頭，并使其具備正常關節所需的生物學及力學特性。基因轉染細胞后合成的蛋白經過自身細胞翻譯后修飾，能更有效地同細胞表面受體結合，調控靶細胞的生長分化。腺病毒表達載體因具有轉染效率高、目的基因高水平表達、免疫排斥反應低、安全系數高等優點，亦成為臨床基因治療的主要載體。因為骨修復是一個階段性過程，不需要轉染的目的基因長久表達，因此利用其將目的基因導入干細胞促進骨再生比較理想。選取人骨形態發生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強的促成骨細胞增殖、分化的作用。在體外對骨髓間充質干細胞有強烈的成骨轉化作用。在眾多的骨生長因子中，骨形態發生蛋白2在促進骨缺損修復和骨折愈合過程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長因子。BMP-2位于骨形成過程級聯反應的上游，調控胞核內相關基因的表達，誘導細胞的成骨向分化，且成骨過程中間充質細胞、成軟骨細胞、成骨細胞等又不斷合成、分泌BMP，通過正反饋機制不斷促進成骨。選擇合適的細胞生長支架是任何組織構建過程中必須面對的難題，也是本發明著力要解決的問題之一。廣泛使用選取人骨形態發生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強的促成骨細胞增殖、分化的作用。在體外對骨髓間充質干細胞有強烈的成骨轉化作用。在眾多的骨生長因子中，骨形態發生蛋白2在促進骨缺損修復和骨折愈合過程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長因子。BMP-2位于骨形成過程級聯反應的上游，調控胞核內相關基因的表達，誘導細胞的成骨向分化，且成骨過程中間充質細胞、成軟骨細胞、成骨細胞等又不斷合成、分泌BMP，通過正反饋機制不斷促進成骨。本發明在桂林市科委的資助下對hBMP促進成骨作用在骨質疏松和椎體滑脫治療的研究中也證實了hBMP-2的良好的成骨誘導活性。廣泛使用的各種合成材料，即使進行了表面改性及修飾處理，但在生物學和力學性能上總是不盡人意。這使得近年來人們又將目光投向天然人工骨材料。因此，本發明選擇同種異體脫鈣骨基質材料在體外構建具有生物活性的載體-細胞因子基因轉染干細胞復合物將有助于解決細胞增殖及細胞因子持續發揮作用這一難題。ZhengD等通過體內植入法證實同種異體脫鈣骨基質(demineralizedbonematrix,DBM)與MSCs具有良好的生物相容性，且具有體內成骨及成軟骨能力。用同種異體或異種骨制備的生物衍生骨支架材料具有天然網狀孔隙系統，原骨鹽支架的三維結構，其組成及結構符合生理要求，具有良好的組織相容性，有利于細胞的粘附生長與分化。天然骨從形態學和力學的觀點來看，都具有合成材料無法比擬的優勢。脫鈣松質骨的吸收與新骨的形成基本同步,既為新骨生成提供支架,又不影響新骨的塑形，具有較好的細胞界面，利于細胞貼附、遷移與增殖。本發明在過去的幾年中，在廣西衛生廳計劃《TGF-β1誘導骨髓間充質干細胞修復全層關節軟骨缺損》的研究中，也對脫鈣骨材料的生物學特征以及與干細胞的生物相容性方面進行了比較系統的研究，已證實它是一種比較理想的生物支架材料。在細胞增殖的整個周期，其降解速度與細胞增殖及分泌細胞外基質的速度相吻合，其降解率及生物黏附性能均能滿足骨髓間充質干細胞的增殖需要。迄今為止，研究同行在這一命題的研究多限于基因轉染細胞的體外成骨效果，而對體內如何控制骨髓間充質干細胞移植到體內后的分化方向及細胞誘導因子的持續有效的釋放等方面的研究還很不成熟，這離完整地理解并應用組織工程這一原理來修復病變組織相差甚遠。結合國內外同行的研究報道和本發明的研究基礎，不難推斷，如能將使hBMP在整個組織修復過程中持續地對細胞發生作用，使之朝我們需要的組織細胞形態分化，必將把組織工程學理論在股骨頭缺血性壞死的研究和治療向前推進一大步。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3