制備高純度木脂素類化合物的方法與流程

本發明涉及的是一種生物醫藥領域的技術，具體是一種從蕁麻地上部分中同時制備兩個高純度新化合物—蕁麻內酯A及蕁麻內酯B的方法。

背景技術：

蕁麻(Urtica fissa E.Pritz.)為蕁麻科蕁麻屬的多年生草本植物，是一常用的民族藥、民間藥。廣布于我國貴州、四川、重慶、福建、廣西、湖南、湖北、江蘇、浙江、安徽、甘肅、陜西、河南等地，藥用資源豐富；藥用始載于宋·《圖經本草》，歷史悠久。以全草(地上部分)入藥，性溫，味苦、辛，有祛風除濕、平肝定驚、活血止痛、解毒等功效。在我國民族醫學中，蕁麻被廣泛地用于治療風濕疼痛、皮膚濕疹、蕁麻疹、小兒驚風、等疾病。在現代醫學中，蕁麻主要用于風濕性關節炎、類風濕性關節炎等疾病的治療，療效顯著，且無明顯的毒副作用。然而，蕁麻抗風濕活性成分尚不清楚。

然而，蕁麻化學成分十分復雜，含有蕁麻醇、橄欖脂素、異落葉松脂醇、蕁麻苷等一系列木脂素類成分；除此之外，還含有大量葉綠素、黃酮、核苷、生物堿、脂肪酸類成分。因此，蕁麻內酯A、蕁麻內酯B分離難度很大。

技術實現要素：

本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種制備高純度木脂素類化合物的方法，能夠用于蕁麻藥材的準確、快速鑒定及質量評價。該方法具有簡便、快速、所得產品純度高、生產成本低等優點。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明涉及一類木脂素類化合物，包括蕁麻內酯A(Urticalactone A)和蕁麻內酯B(Urticalactone B)，其化學結構為：

本發明涉及上述木脂素類化合物的應用，將其用于制備抗類風濕類藥物，對脂多糖誘導的RAW264.7細胞分泌TNF‐α、NO等炎癥因子均有顯著抑制作用。

本發明涉及上述木脂素類化合物的提取方法，通過從蕁麻(Urtica fissa E.Pritz.)中萃取得到的浸膏經樹脂洗脫得到蕁麻內酯A粗提物和蕁麻內酯B粗提物后，再通過二次柱層析后重結晶得到蕁麻內酯A和蕁麻內酯B精制品。

所述的蕁麻全草為蕁麻(Urtica fissa E.Pritz.)的干燥地上部分。

所述的萃取，通過乙酸乙酯實現。

所述的樹脂洗脫，采用但不限于D101大孔樹脂柱，通過二氯甲烷‐甲醇溶液梯度洗脫。

所述的樹脂洗脫，通過洗脫后經TLC A法或TLC B法檢測后合并主斑點相同的流份。

所述的二次柱層析是指：針對蕁麻內酯A粗提物，采用硅膠柱進行第二次層析；針對蕁麻內酯B粗提物，采用ODS柱進行層析；

所述的ODS柱進行層析，優選采用C₁₈反相硅膠。

所述方法具體包括以下步驟：

1)先將蕁麻全草粉碎，加入乙醇回流提取，提取液過濾回收乙醇(可再次用于提取)得醇浸膏。醇浸膏懸浮于水，經石油醚脫脂、脫色素后，用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯(回收乙酸乙酯用于下次萃取)，得乙酸乙酯浸膏。

所述的回流提取中，乙醇和蕁麻干粉的料液比為1:10～1:16(g/mL)，所用的乙醇濃度為70％～95％(v/v)，提取次數為2～3次，提取時間為1～3h。

所述的石油醚萃取和乙酸乙酯萃取次數各為2～3次。

2)將乙酸乙酯浸膏進行第一次硅膠柱層析(二氯甲烷‐甲醇溶液梯度洗脫)，收集流份并回收溶劑(可再次用于洗脫)，用TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值為0.65‐0.80(相對β‐谷甾醇)的流份，得蕁麻內酯A粗提物；用TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值為0.9‐1.1(相對胡蘿卜苷)的流份，得蕁麻內酯B粗提物。

所述的第一次硅膠柱層析硅膠為200～300目，上樣量為1:30～1:50(w/w)；二氯甲烷‐甲醇溶液梯度洗脫中，二氯甲烷‐甲醇溶液其體積比為100：0、97.5：2.5、95：5、90：10，每個梯度洗脫3個柱體積。

所述的TLC A法檢測為：將樣品與β‐谷甾醇共薄層(硅膠G預制板)，以二氯甲烷‐甲醇95：5為展開劑，展于后電吹風吹干展開劑，以10％硫酸乙醇溶液為顯色劑，加熱顯色進行檢測，計算樣品主斑點與β‐谷甾醇的相對Rf值。

所述的TLC B法檢測為：將樣品與胡蘿卜苷共薄層(硅膠G預制板)，以二氯甲烷‐甲醇9：1為展開劑，展于后電吹風吹干展開劑，以10％硫酸乙醇溶液為顯色劑，加熱顯色進行檢測，計算樣品主斑點與β‐谷甾醇的相對Rf值。

3)將步驟2所得蕁麻內酯A粗提物進行第二次硅膠柱層析(二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫)收集流份并回收溶劑(可再次用于洗脫)，用TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值為0.65‐0.80(相對β‐谷甾醇)的流份，即得蕁麻內酯A粗品，或將步驟2所得蕁麻內酯B粗提物經ODS柱層析用(甲醇‐水溶液梯度洗脫)，收集流份并回收溶劑(可再次用于洗脫)，用TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值為0.9‐1.1(相對胡蘿卜苷)的流份，得到蕁麻內酯B粗品。

所述的第二次硅膠柱層析的上樣量為1:300～1:500；硅膠為200～300目。二氯甲烷‐甲醇溶液梯度洗脫中，二氯甲烷‐甲醇溶液其體積比為100：1、100：2、100：3，每個梯度洗脫5個柱體積。

所述的ODS柱層析采用C₁₈反相硅膠(ODS)，粒徑為45～75μm，樣量比為1:200～1:300(樣品比反相硅膠，w/w)。

所述的甲醇‐水溶液梯度洗脫中，甲醇‐水溶液其體積比為6：4、7：3、8：2、9：1，每個梯度洗脫3個柱體積。

4)將蕁麻內酯A粗品、蕁麻內酯B粗品分別利用甲醇重結晶1次，得到白色粉末狀蕁麻內酯A精制品、蕁麻內酯B精制品。

技術效果

與現有技術相比，本發明可以同時制備兩種新化合物蕁麻內酯A、B兩種精制品；所得產品純度高，均在95％以上。以蕁麻地上部分作為原料，豐富易得；同時，又有利于蕁麻的再生，保護生態及蕁麻資源。采用乙醇提取藥材，既提高了收率，同時又去除了蕁麻中水溶性大分子成分(如多糖、蛋白質)的干擾，簡化了制備工藝。采用石油醚萃取，去除了大部分葉綠素及脂肪酸的干擾；采用乙酸乙酯萃取，既富集了目標成分，又進一步排除了水溶性成分的干擾，且目標產物損失少，樣品收率高；同時，綜合運用正相、反相這兩種分離機制不同的層析介質，大大提高了分離效果；使用TLC檢測，對豐富易得的β‐谷甾醇、胡蘿卜苷作為對照，避免了濕度、濕度等對Rf值的影響，有利于準確鎖定目標產物。整個制備過程使用的溶劑乙醇、石油醚、乙酸乙酯，以及分離中用到的填料均可反復使用，且無需HPLC等精密儀器進行純化，生產成本低。

附圖說明

圖1為TLC A法代表性色譜圖；

圖中的展開劑：二氯甲烷‐甲醇95：5；顯色劑：10％硫酸乙醇；1.蕁麻內酯A；2.β‐谷甾醇；

圖2為TLC B法代表性色譜圖；

圖中的展開劑：二氯甲烷‐甲醇9：1；顯色劑：10％硫酸乙醇；1.蕁麻內酯B；2.胡蘿卜苷；

圖3為蕁麻內酯A的13C‐NMR圖(DMSO‐d6,150MHz)；

圖4為蕁麻內酯B的13C‐NMR圖(DMSO‐d6,150MHz)。

具體實施方式

實施例1

本實施例1是在以下實施條件和技術要求條件下實施的：

1.蕁麻全草200g，加入2L 70％乙醇回流2次，每次1h，提取液濾過，回收乙醇得醇浸膏(31.2g)。

2.醇浸膏懸浮于300mL水中，300mL石油醚萃取2次，回收石油醚，棄去提取物；繼用300mL乙酸乙酯萃取2次，減壓回收乙酸乙酯，得浸膏4.1g。

3.取上述浸膏4.0g進行第一次硅膠柱層析(120g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，每份100mL。TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80(相對β‐谷甾醇)的流份，得蕁麻內酯A提取物(213mg)；TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份(相對胡蘿卜苷)，得蕁麻內酯B提取物(627mg)。

4.取蕁麻內酯A提取物(200mg)進行第二次硅膠柱層析(60g硅膠，CH₂Cl₂‐MeOH梯度)，TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，即得蕁麻內酯A粗品(41mg)。取蕁麻內酯B提取物(500mg)進行ODS柱層析(100g反相硅膠，MeOH‐H₂O梯度洗脫)，TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，即得蕁麻內酯B粗品(117mg)。

5.將蕁麻內酯A、B粗品分別用甲醇重結晶1次，干燥后，得蕁麻內酯A精品22mg(純度為95.2％，HPLC法)、蕁麻內酯B精品75mg(純度為95.5％，HPLC法)。

實施例2

本實施例2是在以下實施條件和技術要求條件下實施的：

1.蕁麻全草100g，加入1.3L乙醇回流2次，每次2h，提取液濾過，回收乙醇至干得醇浸膏(24.7g)。

2.取醇浸膏20g懸浮于200mL水，200mL石油醚萃取3次，回收石油醚，棄去提取物；繼用200mL乙酸乙酯萃取2次，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏3.2g。

3.取乙酸乙酯浸膏3.0g進行第一次硅膠柱層析(120g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，每份50mL。TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，得蕁麻內酯A提取物(141mg)；TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，得蕁麻內酯B提取物硅膠TLC檢測(展開劑顯色方法)，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，得蕁麻內酯B提取物(409mg)。

4.取蕁麻內酯A提取物(100mg)進行第二次硅膠柱層析(40g硅膠，CH₂Cl₂‐MeOH梯度)，TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，即得蕁麻內酯A粗品(30mg)。取蕁麻內酯B提取物(400mg)進行ODS柱層析(100g反相硅膠，MeOH‐H₂O梯度洗脫)，TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，即得蕁麻內酯B粗品(82mg)。

5.將蕁麻內酯A、B用甲醇重結晶1次，干燥后，得蕁麻內酯A精品14mg(純度為96.2％)、蕁麻內酯B精品52mg(純度為96.0％)。

實施例3

本實施例3是在以下實施條件和技術要求條件下實施的：

1.蕁麻全草200g，加入3.2L 95％乙醇回流3次，每次3h，濾過，提取液濾過，回收乙醇至干得醇浸膏(46.4g)。

2.取醇浸膏40g懸浮于400mL水中，400mL石油醚萃取3次，回收石油醚，棄去提取物；繼用400mL乙酸乙酯萃取3次，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏6.7g。

3.取乙酸乙酯浸膏6g進行第一次硅膠柱層析(300g硅膠)，用二氯甲烷‐甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，每份150mL。TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，得蕁麻內酯A提取物(274mg)；TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，得蕁麻內酯B提取物硅膠TLC檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，得蕁麻內酯B提取物(909mg)。

4.取蕁麻內酯A提取物(240mg)進行第二次硅膠柱層析(120g硅膠，CH₂Cl₂‐MeOH梯度)，TLC A法檢測，合并主斑點相對Rf值0.65‐0.80的流份，即得蕁麻內酯A粗品(60mg)。取蕁麻內酯B提取物(800mg)進行ODS柱層析(240g反相硅膠，MeOH‐H₂O梯度洗脫)，TLC B法檢測，合并主斑點相對Rf值0.9‐1.1的流份，即得蕁麻內酯B粗品(154mg)。

5.將蕁麻內酯A、B用甲醇重結晶1次，干燥后，得蕁麻內酯A精品43mg(純度為96.6％)、蕁麻內酯B精品84mg(純度為95.3％)。

通過上述實施例制備得到的藥物均具有以下顯著的抗類風濕作用：

1)抗炎作用：觀察樣品對脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎癥因子分泌的影響。結果發現：不同濃度(0.1、0.5、2.5、12.5、62.25)的蕁麻內酯A、蕁麻內酯B對于1μg/mL LPS刺激RAW264.7細胞分泌TNF‐α、NO炎癥因子的分泌有抑制作用，其半數抑制濃度(IC₅₀)如表1所示：

表1蕁麻內酯對LPS誘導RAW264.7細胞24h分泌TNF‐α、NO的抑制作用

(n＝3，)

2)免疫調節作用：脾臟是機體最大的免疫器官，而淋巴細胞和巨噬細胞是脾臟里面主要細胞，是機體免疫和體液免疫的中心。研究發現類風濕模型大鼠的脾臟變大，而且脾臟中淋巴細胞的百分含量增加。本實驗采用類風濕大鼠模型的脾淋巴細胞，觀察在ConA的刺激下，樣品對脾淋巴細胞增殖的影響。結果顯示：蕁麻內酯A、蕁麻內酯B在0.5μg/mL濃度即有明顯抑制淋巴細胞增殖作用(結果見表2)。

表2蕁麻內酯對類風濕模型大鼠脾淋巴細胞增殖的抑制作用

上述具體實施可由本領域技術人員在不背離本發明原理和宗旨的前提下以不同的方式對其進行局部調整，本發明的保護范圍以權利要求書為準且不由上述具體實施所限，在其范圍內的各個實現方案均受本發明之約束。