本發明屬于分子生物學
技術領域：
，具體涉及一種T1R2基因過表達慢病毒載體、T1R2慢病毒及其構建方法。
背景技術：
：味覺功能學研究表明，甜味主要由味覺細胞的G蛋白偶聯受體(Gproteincoupledreceptors，GPCRs)家族所介導，即味覺受體第1家族(tastereceptorfamily1members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受體，它們以T1R2+T1R3異二聚體的形式發揮作用，共同對甜味進行識別。甜味受體在結合配體后，下游G蛋白被激活，其α亞基與β、γ亞基分離，Gα亞基進入胞漿進而激活下游效應器，最終導致細胞內鈣離子濃度升高。因此，通過構建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，可用鈣流檢測方法對甜味物質進行識別。構建共表達人T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，需要使用到帶有人T1R2基因的過表達載體。現有的方法采用的是將整合有T1R2基因的質粒載體通過脂質體對宿主細胞進行轉染，但是脂質體轉染質粒載體的轉染效率較低，要構建能穩定共表達T1R2、T1R3和Gα三種基因的細胞系成功率也較低。因此，如何提高T1R2基因過表達載體的轉染效率是目前亟需解決的問題。技術實現要素：本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種T1R2基因過表達慢病毒載體、T1R2慢病毒及其構建方法，該方法所構建的慢病毒載體，轉染效率高，并能將T1R2基因整合到宿主細胞的基因組中，因此能特異、持續、高效地促進T1R2基因在宿主細胞中的穩定表達。為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：一種T1R2基因過表達慢病毒載體，以慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表達載體為基礎進行構建，并整合有T1R2基因，得到T1R2基因過表達慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2。本發明還提供pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2慢病毒表達載體的構建方法，包括如下步驟：步驟(1)，人工合成T1R2基因；步驟(2)，以下列PCR擴增引物進行T1R2基因的PCR擴增：所述的PCR擴增引物為：T1R2-F：agattctagagctagcaccaccatggatggggcccagggcaaag；T1R2-R：accctaactgacacacggatccctagtccctcctcatggtg；步驟(3)，用限制性內切酶EcoRI和BamHI分別對T1R2基因的PCR產物和慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP進行雙酶切；步驟(4)，用T4DNA連接酶將酶切的得到的線性化的T1R2基因和慢病毒載體連接，將得到的連接液轉化DH5α感受態細胞，并進行PCR鑒定，對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對，比對正確的克隆即為構建成功的T1R2基因過表達慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2；其中，步驟(4)PCR鑒定采用的PCR擴增引物與步驟(2)所采用的PCR擴增引物相同。步驟(4)測序所用引物為：CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；EF13：ccaacttctcggggactgtg；T1R2seq1：cagctgatgctgcacttc；T1R2seq2：agctgcttgaggagatctg。本發明另外提供一種T1R2慢病毒的構建方法，采用上述T1R2基因過表達慢病毒載體，方法是：使用慢病毒包裝質粒pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G對T1R2基因過表達慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2進行包裝。，通過轉染HEK293細胞，得到T1R2慢病毒。本發明還要求保護上述T1R2慢病毒的構建方法構建得到的T1R2慢病毒。本發明與現有技術相比，其有益效果為：本發明所構建的T1R2基因過表達慢病毒載體對宿主細胞的轉染效率高達80％～90％，比起現有的質粒轉染法轉染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能將T1R2基因整合到宿主細胞的基因組中，因此使用該方法能特異、持續、高效地促進基因T1R2在宿主細胞中的穩定表達。過表達T1R2基因的細胞可用于構建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，可用鈣流檢測方法對甜味物質進行識別。附圖說明圖1是pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表達載體圖譜；圖2是pRSV-Rev慢病毒包裝質粒圖譜；圖3是pMDLg-pRRE慢病毒包裝質粒圖譜；圖4是pMD2.G慢病毒包裝質粒圖譜。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過購買獲得的常規產品。主要實驗試劑及廠家：大腸桿菌菌株DH5α(Invitrogen)胎牛血清FBS(Invitrogen)胰蛋白酶(Invitrogen)DMEM完全培養基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)(Invitrogen)限制性內切酶(Fermentas)T4DNA連接酶(NEB公司)質粒DNA提取試劑盒(Axygen公司)制備感受態試劑盒(BIOSCIENCES)PrimeSTARMaxPremix(2X)(Takara)逆轉錄酶MuLV(NEB)RNase抑制劑(NEB)SYBRGreenqPCRMasterMix(2X)(ThermoScientific)pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP、pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G，均可商購于上海比昂生物醫藥科技有限公司。實施例1：T1R2基因過表達慢病毒載體構建。1、人工合成T1R2基因，其DNA如SEQIDNO.1所示。2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的T1R2基因為模板，通過如表1所示引物進行的PCR擴增：表1PCR反應體系與條件如表2：表2試劑體積模板1μL上游引物T1R2-F(10μM)1μL下游引物T1R2-R(10μM)1μLPrimeSTARMax(2x)10μLddH2O7μL總體積20μLPCR程序如表3：表33、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物大小是否與預期一致，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的目的片段條帶，用DNA回收試劑盒回收純化；4、用EcoRI和BamHI限制性內切酶分別對T1R2基因的PCR產物和慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP進行雙酶切(于37℃酶切3h)，反應體系和反應條件如表4：表45、瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的T1R2基因片段條帶和線性化的慢病毒載體，用膠回收試劑盒回收DNA；6、用T4DNA連接酶于16℃水浴下，將兩種酶切產物進行連接，過夜。反應如表5：表5試劑體積10XT4DNA連接酶buffer2μLT4DNA連接酶(400U/μL)1μLT1R2基因片段10μL線性化的慢病毒表達載體4μLddH2O3μL總體積20μL7、轉化感受態細胞：從-80℃冰箱取出1管100μLDH5α感受態細胞，放冰上解凍(解凍至無冰狀態)后取10μL上述步驟6中的連接產物加到感受態細胞中混勻，靜置30min，42℃水浴熱激1min，冰上靜置2min。加LB液體培養基500μL，37℃振蕩培養1小時。3000rpm離心5min，留100μl左右上清液混勻細菌后涂到LB平板上，37℃倒置培養過夜。8、挑取數個菌落，做菌落PCR檢測轉化子，反應體系和條件見步驟2；9、將菌落PCR鑒定得到的陽性克隆進行測序驗證，測序引物如表6：表6實施例2：T1R2慢病毒包裝1、用胰蛋白酶消化對數生長期的HEK293細胞，細胞密度為5×106時；重新接種于含有25mL含10％(v/v)FBS的無抗生素DMEM培養基直徑為15cm的細胞培養皿中，37℃，50mL/LCO2培養箱內培養；2、制備慢病毒包裝系統中四種質粒DNA溶液：將以上質粒加入無菌水定容至1800μL，再加入CaCl2(2.5mol/L)溶液200μL，混勻，加入2×PBS緩沖鹽溶液2000μL，室溫放置20～30min；3、當細胞密度達60％～70％時進行轉染。此時將步驟2中制備的DNA溶液和磷酸鈣混合液轉移至步驟1得到的含單層細胞的細胞培養皿中，混勻，培養12h后棄去培養液，細胞用15mLPBS溶液沖洗，共洗3次。4、向上述細胞培養皿中加入含100mL/LFBS的DMEM細胞培養液15mL，繼續培養48h；5、收集轉染72h的HEK293細胞上清液；6、將收集的上清液于4℃，4000g離心10min，再次收集上清液；7、將再次收集得到的上清液以0.45μm濾器過濾；8、將濾液于40mL超速離心管中，4℃，25000r/min離心20min，棄上清液；9、而后以冰500ulPBS重旋病毒沉淀于4℃溶解過夜，得到慢病毒液，即T1R2慢病毒。實施例3：細胞轉染和篩選1、在6孔細胞培養板中培養HEK293細胞，待細胞完全貼壁匯合度為40％-50％后，即可進行細胞轉染；轉染前，每孔細胞換成500μL新鮮的DMEM完全培養基，并且每孔加入1μL的聚凝胺(polybrene)，放置于培養箱孵育1h。2、在上述6孔細胞培養板的2個孔中，分別加入5μL實施例2得到的T1R2慢病毒液，其中一孔細胞加10μL的空載慢病毒液(空載慢病毒液與T1R2慢病毒液的唯一區別是不含有T1R2基因，其余制備方法都相同)，另一孔做空白細胞對照，充分的搖勻后放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相對濕度的培養箱中培養3、轉染6小時后，吸走孔內的培養基，并用PBS洗兩次；換成新鮮的DMEM完全培養基，放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相對濕度的培養箱中培養。4、感染48小時后，與對照組相比較，于熒光顯微鏡下觀察感染效果。若觀察到明顯的綠色熒光，說明已轉染成功。此時將得到的HEK293-T1R2細胞移至10cm細胞培養皿擴大培養。實施例4：使用實時熒光定量PCR進行T1R2基因的表達檢測。1、HEK293-T1R2細胞總RNA提取：1)將10cm細胞培養皿中匯合度達80％的篩選得到的HEK293-T1R2細胞用預冷PBS緩沖液洗2遍，加1mlTrizol裂解液重懸。2)接著加入0.2ml三氯甲烷，劇烈搖動10s，室溫放置3分鐘。3)4℃，12000rpm離心20min。4)將上清水相轉移至另一新的無RNA酶離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻，-80℃放置1h。5)4℃，12000rpm離心10min，去上清。6)加入1ml體積濃度為75％乙醇洗滌沉淀。7)4℃，5000rpm離心3min，去上清，室溫晾干。8)加入40μLRNase-free水溶解RNA。2、去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。cDNA合成條件：RNA1μgdNTP(10mM)1μloligodT(40μM)1μl隨機引物(40μM)1μl加RNase-free水至34.5μl；至于75℃5min，冰上5min。向上述反應后的溶液中添加反轉錄試劑：MuLV1μl10Xbuffer4μlRNase抑制劑0.5ul42℃反應1h，75℃滅活酶10min，備用3、cDNA的實時熒光定量PCR將T1R2基因和內參基因actin的cDNA樣本分別取樣在熒光定量PCR儀上進行反應，每個樣本設置3個平行實驗。PCR反應體系為20μL，反應體系如表7：表7熒光定量PCR使用的引物如表8：表8反應條件為：循環結束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。本發明所構建的T1R2基因過表達慢病毒載體對宿主細胞的轉染效率高達80％～90％。實驗以actin為內參基因，采用2-△△Ct法進行分析，經所構建的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2慢病毒載體轉染的HEK293細胞中T1R2基因的相對表達量是未轉入T1R2基因的HEK293細胞的2.88倍。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。序列表當前第1頁1 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