一種靶向RegⅣ單鏈抗體的制作方法

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種靶向RegIV單鏈抗體的篩選，輕、重鏈可變區序列的獲得，表達載體的構建，RegIV單鏈抗體的制備、親和力的測定及其生物學活性驗證。

背景技術：

Reg蛋白家族屬于鈣依賴型植物凝集素超家族，根據其編碼蛋白的結構，Reg家族可分為四個亞型，即I、II、III、IV型，他們具有相似的基因結構，均含有5個內含子和6個外顯子，TATA盒和CCAAT盒位于轉錄起始位點上游的27和100bp處，編碼158-175個氨基酸長度不等的分泌蛋白。

RegIV是該基因家族的一員，其基因序列與Reg I部分同源，結構也有相似之處。人的RegIV基因位于1號染色體，屬于單拷貝基因，有5個內含子及6個外顯子，編碼158個氨基酸，包括22個氨基酸的信號肽及一個保守的鈣依賴碳氫化合物識別域。此碳水化合物識別域包括細胞識別、細胞遷移、細胞生長和細胞粘附在內多方面的生物學功能，從而使RegIV通過多種途徑在腫瘤的發展過程中起作用。

RegIV蛋白在結腸癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤細胞中呈過度表達，這種高表達能夠顯著促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，抵抗凋亡，加劇腫瘤細胞的未分化程度，并提高腫瘤細胞對化療藥物的耐受水平。RegIV蛋白對結腸癌細胞不僅有促有絲分裂作用，還有抗凋亡作用，并且有一部分是通過激活EGFR/Akt/AP-1信號通路發揮其作用。除此以外，RegIV蛋白也能加強腫瘤細胞對放射性殺傷的抵抗，其機制可能是通過上調Bcl-2、Bcl-xL和存活素等抗凋亡基因表達引起的。

RegIV蛋白能在多數癌癥患者中的血清中被檢出，且具有較高的準確性和靈敏度。在早期胃癌病人的血清中，RegIV的濃度顯著提高，血清RegIV的診斷靈敏度高于CEA和CA19-9兩個有效腫瘤標記物。此外，RegIV蛋白陽性的腫瘤患者存活時間顯著低于陰性患者(p＝0.013)。血清RegIV蛋白水平檢測有助于癌癥患者的早期診斷和預后。

抗體庫技術為全人源抗體的篩選提供了良好的技術平臺，它繞過了以往單抗研制過程中必須的雜交瘤過程，甚至不需要經過免疫過程即可獲得各種抗體基因及抗體分子片段。1994年Winter等人創建了噬菌體抗體庫技術，是目前為止最成熟、應用最廣泛的制備抗體的技術。用人的外周血制備抗體文庫，將不同特異性的抗體或其功能片段(Fab、Fv、ScFv)表達在噬菌體表面，用固相化抗原對表達產物的載體進行淘篩，通過數輪“吸附-洗滌-洗脫-擴增”的 過程，直至得到高親和力的、特異性強的抗體。

技術實現要素：

發明目的：

本發明目的一在于提供一種靶向RegIV單鏈抗體的重鏈和輕鏈可變區核苷酸序列

本發明目的二在于提供一種靶向RegIV單鏈抗體的重鏈和輕鏈可變區氨基酸序列

本發明目的三在于提供一種具有潛在醫學和藥學價值的靶向RegIV單鏈抗體。

本發明的詳細描述：

本發明提供了靶向RegIV單鏈抗體的篩選，編碼此抗體的核酸和氨基酸序列，靶向RegIV單鏈抗體的構建、制備方法，親和力測定及其生物學活性的驗證。

在一個實施方案中，本發明提供了特異性結合RegIV的單鏈抗體，其特征在于：

所提供的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區基因如SEQ ID NO：1～16所示；所提供的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO：17～32所示。

在一個實施方案中，本發明提供了一種滲透壓休克法，用于分離純化上述抗體。

在一個實施方案中，本發明提供了一種生物膜干涉技術，用于檢測抗體的親和力。

本發明涉及高親和力特異性結合RegIV的單鏈抗體，包括但不限于例如單鏈抗體。在實施方案中，本發明的抗體包含特定的結構特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR區。

在實施方案中，本發明的抗體是重組蛋白質，分離的蛋白質或基本上純的蛋白質。“分離的蛋白質至少伴隨一些其在天然狀態中所通常結合的物質，取決于情況，分離的蛋白質可構成總蛋白含量的5％至99.9％(按重量)。

在一個實施方案中，本發明涉及的抗體可以特異性結合RegIV蛋白，抑制高表達RegIV蛋白細胞的生長。

有益效果：

1.RegIV蛋白在胰腺癌細胞中高表達，能明顯促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，抵抗細胞凋亡，加劇癌細胞的未分化程度，并促進腫瘤細胞對化療藥物產生耐受。因此，特異性阻斷RegIV蛋白功能的scFv在理論上具備抗腫瘤的作用。

2.抗體藥物在抗腫瘤領域的應用發展迅速，抗體藥物的特點是在于能特異性結合靶抗原，封閉靶分子功能或殺傷靶細胞。scFv作為新一代基因工程抗體，在封閉蛋白質分子功能方面具有極大的優越性。因此，利用scFv識別腫瘤高表達的RegIV蛋白，進而抑制RegIV蛋白功能的方法是可行的。

附圖說明

圖1為用噬菌體抗體庫對anti-RegIV scFv的篩選統計圖。其中圖1A描述篩選過程中，五輪回收率的統計柱狀圖；圖1B描述的是篩選的噬菌體單克隆Elisa柱狀圖。

圖2為IMGT-VQUEST數據庫分析anti-RegIV scFv V_H和V_L的CDR區基因序列。其中圖2A描述的是anti-RegIV scFv V_H的CDR區基因序列；圖2B描述的是anti-RegIV scFv V_L的CDR區基因序列。

圖3為anti-RegIV scFv表達工程菌的構建電泳圖。其中圖3A為PCR擴增anti-RegIV scFv基因，目的基因大小約為750bp，泳道M為DNA Marker，泳道1、2為PCR擴增的目的基因，泳道3為pET-22b質粒；圖3B為anti-RegIV scFv基因插入pET-22b的表達質粒圖。

圖4為anti-RegIV scFv表達的SDS-PAGE圖。其中圖4A為SDS-PAGE檢測IPTG誘導大腸桿菌表達結果，泳道M為標準分子量蛋白，泳道1為IPTG誘導前的菌液樣品，泳道2為IPTG誘導后的菌液樣品；圖4B為SDS-PAGE檢測Ni親和層析柱純化產物結果，泳道M為標準分子量蛋白，泳道1為上樣前收集液，泳道2為上樣后收集液，泳道3為150mM咪唑洗脫液洗柱收集液。

圖5為Western Blot鑒定純化后anti-RegIV scFv，泳道M為標準分子量蛋白，泳道1為純化后的anti-RegIV scFv。

圖6為BLI技術檢測anti-RegIV scFv與RegIV蛋白之間的親和力。圖中描述了不同濃度(1500nM、750nM、375nM、187.5nM)的anti-RegIV scFv與RegIV之間的親和力，通過數據分析最終得到的Kd為8×10^-9。

圖7為MTT檢測anti-RegIV scFv抑制PANC-1腫瘤細胞生長的折線圖。圖中描述了不同濃度(17nM、35nM、70nM、140nM、280nM、560nM)對PANC-1細胞的生長抑制率。

具體實施方式

為使本發明的上述目的、特點能夠更加明顯易懂，下面對本發明的具體實施方式做詳細的說明。

實施例1噬菌體抗體庫篩選抗RegIV的單鏈抗體

1.抗原RegIV

本發明使用的RegIV蛋白(NP_001152824.1)購于北京義翹神州生物技術有限公，含有158個氨基酸構成，純度＞95％。

2.制備具有性纖毛的大腸桿菌宿主菌TG1

將TG1從甘油凍存管內平板劃線，接種于M9培養基平板，37℃倒置培養36h。挑取單克隆菌落，接種在5ml 2×YT培養基中，37℃搖床培養過夜。第二天，1/100稀釋接種于新鮮的2×YT培養基中，37℃搖床培養到對數期(OD₆₀₀為0.4～0.6)，然后感染噬菌體。

3.制備輔助噬菌體

將輔助噬菌體加入到200μL TG1菌培養液中(OD₆₀₀為0.5)，37℃水浴30分鐘后，加入到3mL融化的H-TOP瓊脂(42℃)中，然后鋪在溫熱的TYE平板上，冷卻后37℃培養過夜。挑取單個菌落接種到3～4mL處于對數期的TG1培養物中，37℃搖床培養2h。轉接到500mL 2×TY液體培養基(2L搖瓶)中，繼續培養1h，然后加入25mg/mL卡那霉素水溶液，至終濃度50～70μg/mL，繼續培養8～16h。10800g，4℃離心15分鐘，收集上清，加入1/5體積PEG/NaCl(20％PEG，2.5mol/LNaCl)，冰上放置30分鐘。再次10800g，4℃離心15分鐘，沉淀重懸于2mLPBS緩沖液中，0.45μm膜過濾除菌。測定滴度，稀釋至1×10¹²p.f.u/mL。

4.擴增噬菌體抗體庫

a.取1mL保存的噬菌體抗體庫(大約1×10¹⁰p.f.u)接種到500mL2×TY培養基中(含有100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖)。37℃搖床培養到對數期(OD₆₀₀為0.4～0.6)，大約1.5～2h。

b.取25mL培養液(大約1×10¹⁰個細菌)，用輔助噬菌體VCS-M13感染。感染比例為細菌數/輔助噬菌體數＝1/20。于37℃水浴中，靜置30min。3300g，4℃離心10min，將沉淀重懸在30mL 2×TY培養基中(含有100μg/mL氨芐青霉素和25μg/mL卡那霉素)。將上述菌液添加到470mL已經37℃預溫的2×TY培養基中(含有100μg/mL氨芐青霉素和25μg/mL卡那霉素)，30℃搖床培養過夜。

c.10800g，4℃離心10min或3300g，4℃離心30min。收集上清，加入1/5體積PEG/NaCl(20％PEG，2.5mol/LNaCl)，徹底混合后4℃放置1h。再次10800g，4℃離心10min，沉淀重懸于40mL水和8mL PEG/NaCl(20％PEG，2.5mol/L NaCl)。10800g，4℃離心10min或3300g，4℃離心30min，吸棄離心上清。再次重懸沉淀，再次10800g，4℃離心10min，徹底吸棄上清。

d.將沉淀重懸于5mL PBS中，11600g，離心10min，去除細菌碎片(沉淀)。

5.固相親和篩選

a.取4mL CBS稀釋的蛋白(第1至第5輪淘選固定抗原的濃度分別為80，80，40，25，15μg/mL)，加入到免疫試管中，室溫包被過夜。

b.棄上清，以PBS迅速洗管3次。免疫管中注滿3％BSA-PBS，37℃封閉2h。棄封閉液，用PBS迅速沖洗免疫管3次。將噬菌體抗體庫(10¹²～10¹³p.f.u)加入到免疫管中，再 加入3％BSA至4mL，。室溫反復倒轉30min后，于室溫靜置90min以上，

c.在進行第一輪篩選時，以含有0.1％Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污劑。第二輪以后的篩選，洗管次數增加(第二至第四輪淘選為20次，第五輪為30次)。將PBS吸干以后，加入1mL 100mmol/L三乙胺[700μL三乙胺(7.18mol/L)加入到50mL水中]，室溫反復倒轉孵育10min，進行特異性洗脫。

d.用0.5mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.4)迅速中和(7)特異洗脫下來的噬菌體。中和后的噬菌體可以直接4℃保存或用于(10)感染TG1菌。向免疫管中加入200μL 1mol/L Tris(pH7.4)中和殘余的噬菌體。取9.25mL處于對數期的TG1細菌培養物與0.75mL洗脫下來的噬菌體混合，另外向免疫管中加入4mL處于對數期TG1細菌培養物。兩者同時37℃水浴靜置30min。

e.從兩種已感染噬菌體的TG1細菌培養物中分別取100μL，并分別做4～5次100倍系列稀釋，然后將梯度稀釋物的噬菌體涂布TYE平板(含有100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖)，37℃培養過夜。剩余的兩種已感染噬菌體的TG1細菌培養物3300g，4℃離心10min，菌體沉淀重懸于1mL 2×TY培養基中，使用Nunc Bio-Assay Dish鋪大型TYE平板(含有100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖)。30℃培養過夜或直至出現肉眼可見克隆。

f.向長滿細菌克隆的Nunc Bio-Assay Dish平板中加入5mL含有15％甘油2×TY培養基并用玻璃涂布棒刮取細菌并收集菌體懸液。取100μL菌體懸液加入到100mL 2×TY培養基中(含有100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖)，37℃搖床培養至OD₆₀₀≈0.5(約2h)。

g.加入輔助噬菌體VCS-M13感染，感染比例數為細菌數/輔助噬菌體數＝1/20。37℃水浴靜置30min。將菌液3300g，4℃離心10min，菌體沉淀重懸于50mL 2×TY培養基中(含有100μg/mL氨芐青霉素和25μg/mL卡那霉素)。30℃搖床培養過夜。

h.取40mL過夜培養物，10800g，4℃離心10min或3300g，4℃離心30min。收集上清，加入1/5體積PEG/NaCl(20％PEG，2.5mol/L NaCl)，徹底混合后4℃放置1h以上。再次10800g，4℃離心10min，沉淀重懸于40mL水和8mL PEG/NaCl。10800g，4℃離心10min或3300g，4℃離心30min，吸棄上清。沉淀重懸于2mL PBS中，11600g，4℃離心10min，盡量去除細菌碎片。取1mL噬菌體4℃保存，另1mL噬菌體用于下一輪親和篩選。

6.表一 五輪篩選回收率

7.單克隆噬菌體ELASA

a.從第5輪的平板上隨機挑區95株單克隆菌株和空白對照(只加培養基)到96孔U型細菌培養板中，37℃培養過夜。每孔取出菌液2μL，加入到另一塊新的96孔細菌培養板中；37℃培養1h后，每孔加入2×TY-AG培養基25μL和1×10⁹pfu輔助噬菌體VCS-M13；在37℃靜止30min后，搖床培養1h。1800×g離心10min，棄上清液。將菌體沉淀重懸于200μL的2×TY-AG培養基中，30℃搖床培養過夜。1800×g離心10min，取上清液100μL用于ELISA實驗。

b.包被10μg·mL^-1抗原，以3％BSA-PBS進行封閉(37℃封閉2h)，用PBS洗3次后，每孔分別對應加入a中的上清液(以BSA為陰性對照)100μL，室溫放置90min；PBST(含有0.5％Tween-20的PBS)和PBS分別洗3次，每孔加入1∶5000稀釋的羊抗M13多克隆抗體100μL，37℃放置90min；PBST和PBS分別洗3次，沒孔加入1∶5000稀釋的HRP-兔抗羊IgG多克隆抗體100μL，37℃放置90min；PBST和PBS分別洗3次，加入TMB顯色30min后，每孔加入1M H₂SO₄50μL終止反應。采用雙波長法于酶標儀上讀取數據。

實施例2anti-RegIV scFv的測序及分析

測序結果顯示，成功獲得兩種anti-RegIV scFv基因序列，利用IMGT/V-QUEST(http：//www.imgt.org/)分析anti-RegIV scFv基因序列，分析結果表明：命名為D6的anti-RegIV scFv重、輕鏈可變區及其CDR1～3區基因序列如SEQ ID NO.1～8所示；命名為C9的anti-RegIV scFv重、輕鏈可變區及其CDR1～3區基因序列如SEQ ID NO.9～15所示。

實施例3anti-RegIV scFv的制備及純化

1.PCR擴增anti-RegIV scFv基因

利用從噬菌體庫篩選出的且測序分析正確的單克隆作為模板，對anti-RegIV scFv基因進行PCR擴增。分別選用EcoR I和Xho I作為上下游酶切位點，利用Primer5.0進行引物設計，其中D6F、C9F(上游引物)以及D6B、C9B(下游引物)序列為：

D6F：CCGGAATTCCCCAGGTGCAGCTACAGCAGT

D6B：CCGCTCGAGACCTAGGACGGTGAGCTTGGT

C9F：CCGGAATTCGCCCAGGTGCAGCTGCAG

C9B：CCGCTCGAGACGTTTGATATCCACTTTGGT

反應體系為50μL，反應條件為94℃4min，94℃30s，57℃45s，72℃1min，29個循環，72℃10min，4℃保存。取5μL終產物在1％瓊脂糖凝膠電泳上進行鑒定。PCR擴增獲得750bp左右的anti-RegIV scFv基因。用膠回收試劑盒(生工生物)對PCR產物進行純化回收。

2.PCR產物及載體雙酶切

用質粒小提試劑盒(生工生物)提取pET-22b質粒。再將PCR產物與pET-22b質粒分別進行雙酶切，所選用酶切位點為EcoR I和Xho I。反應體系為50μL。pET-22b質粒雙酶切反應條件：37℃4h；PCR產物雙酶切反應條件：37℃過夜。酶切產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒(生工生物)進行純化回收。

3.酶切產物的連接

將回收的酶切產物anti-RegIV scFv基因片段與pET-22b質粒按摩爾比7∶1建立25μL連接體系，用T4連接酶16℃連接過夜。

4.連接產物的轉化及鑒定

采用CaCl₂轉化法將連接產物轉化至感受態E.coli BL21中。具體操作如下：

a.在LB平板上挑取活化的E.coli BL21單菌落，接種于3mL LB液體培養基中，37℃、220rpm恒溫振蕩培養12小時左右，為對數生長后期。將該菌懸液以1∶100-1∶50的比例接種于100mL LB液體培養基中，37℃、220rpm恒溫振蕩培養1.5-2h，至測定OD₆₀₀約為0.5。

b.將培養液轉入預冷無菌的2mL離心管中，放置于冰中放置10min，4℃、2400×g離心5min。

c.棄去上清，用2mL預冷的0.1M CaCl₂輕輕重懸細胞沉淀，再次4℃、2400×g離心5min。

d.棄去上清，加入80μL 0.1M CaCl₂溶液，輕輕懸浮細胞。

e.吸取80μL制備的感受態細胞于無菌的EP管中，用預冷無菌的槍頭吸取10μl連接產物加入EP管中，輕輕晃動以混勻內含物，于冰上放置30min。

f.將EP管快速放入42℃水浴中2min，切勿搖動EP管。

g.迅速將EP管轉至冰浴中冷卻1～2min，在EP管中加入SOC培養基800μL，放入37℃恒溫搖床中，低速搖動溫育45min。

h.取適量含有感受態細胞的溶液轉移至含有100μg/mL Amp的LB固體培養基平板上，37℃恒溫培養至液體全部被吸收。倒置平板，37℃培養過夜。

從LB固體培養基上隨機挑區單菌落與液體LB培養基中培養過夜，吸取少量菌液進行菌落PCR，經1％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，再將陽性克隆進行基因測序分析。

5.anti-RegIV scFv的表達、純化、鑒定

將構建好的重組表達菌株接種于LB(100μg/mL Amp)液體培養基，37℃過夜活化。次日一1％接種量接與新鮮的LB(100μg/mLAmp)液體培養基。當OD₆₀₀達到0.8時加入終濃度0.2mM IPTG，于20℃誘導表達20h。

4℃，8000rpm離心15min收集誘導表達的發酵液菌體，用5％初始發酵液體積的高滲溶液(50mM Tris-HCl，20％sucrose，1mMEDTA，pH8.0)重懸菌體，冰上溫和攪拌10min。12000rpm離心30min，收集上清；再用同體積的低滲溶液(5mM MgSO₄)重懸菌體，冰上溫和攪拌10min。12000rpm離心30min，將兩次的離心上清混合，0.22μm濾膜過濾。

過濾后的樣品用鎳親和柱層析純化，隨后用含不同濃度的咪唑(20mM、50mM、100mM、250mM、500mM)進行梯度洗脫，同時收集洗脫液。用12％SDS-PAGE分析收集的樣品，挑選出高純度蛋白進行Western Blot鑒定，如下：

將蛋白轉印到PVDF膜上，200mA恒流轉印60min；而后將膜放入5％脫脂牛奶37℃封閉2h，用5％脫脂牛奶按1∶5000比例稀釋鼠抗His抗體，將膜放入到稀釋好的溶液中，4℃孵育過夜；用TBST洗膜3遍，再用5％脫脂牛奶按1∶10000稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體，將膜放入到稀釋好的溶液中，37℃孵育2h；再用TBST洗5遍，滴加ECL發光顯色液，凝膠成像儀曝光拍照。

將最終純化后的蛋白樣品經透析超濾濃縮后-70℃保存。

實施例4 BLI技術測定抗體親和力

將標記了生物素的RegIV蛋白連接到Streptavidin(SA)傳感器上，分別對不同濃度的抗體進行梯度檢測。設置的濃度為0nM、187nM、375nM、750nM、1500nM。用ForteBio的計算軟件進行計算處理，獲得的解離平衡常數KD分別為8.82×10^-9、6.24×10^-9。

實施例5 MTT檢測抗體的抗腫瘤活性

用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化PANC-1細胞至單細胞懸液。用2％FBS的細胞培養基稀釋PANC-1細胞，鋪96孔板，最終調整細胞濃度為3000個/孔，每孔100μL，培養24h。對96孔板里的每孔細胞進行加藥處理，藥物終濃度分別是500nM、250nM、125nM、75nM、30nM、15nM、0nM。加藥作用72h后，每孔加入11μL的MTT(5mg/mL)，繼續培養4h。3000rpm離心5min后，吸出上清，加入DMSO溶解10min，酶標儀檢測570nm和630nm處的吸光值。