本發明屬于生物檢測鑒定技術領域，具體涉及一種基于PCR技術進行鵪鶉性別鑒定的方法，該方法可應用于對雛鵪鶉進行早期性別鑒定。
背景技術：
鵪鶉是特種經濟禽類，也是最小的家禽品種，具有極高的食用價值和食療功效。鵪鶉蛋營養豐富，蛋白質含量高，膽固醇含量低，由此可見，蛋用鵪鶉的養殖具有較好的市場前景。由于蛋用鵪鶉出雛時體重僅有7克左右，通常商品代蛋用鵪鶉通過羽色進行公母區分；而父母代的鵪鶉由于毛色相同，出雛時不能區分公母，一般要等鵪鶉長到30日齡左右才能通過體型外貌區分公母，這在很大程度上增加了鵪鶉育種企業的養殖成本。隨著我國鵪鶉養殖業的發展，快速、及時、準確的鑒別出雛鵪鶉的性別，成為一個亟待解決的問題。
近年來，分子生物技術的發展，為這一難題的解決提供了另一種思路。鳥類的性別是由染色體決定的，其性別決定方式為ZW型，雄鳥有一對Z染色體，而雌鳥則是一個Z染色體和一個W染色體。CHD基因在Z染色體和W染色體上的序列具有一定差異，可以利用該基因在Z染色體和W染色體上的差異鑒別絕大多數的禽類，具有很大的通用性。自1995年開始，CHD基因被廣泛應用于鳥類性別的分子鑒定，CHD基因已經成為鳥類性別鑒定最重要的分子標記。由于不論雌鳥還是雄鳥都會有CHD-Z基因，因此是否檢測到CHD-Z擴增產物可以作為擴增反應是否正常進行的參照，避免了將實驗失敗的結果誤判為雄性；而CHD-W基因是雌性專有的，只有雌性才可能檢測到CHD-W擴增。這種方法的優點是成本較低，在現有鑒定條件下被廣泛地采用，缺點是操作繁瑣、時間長，易造成污染。近年來，有學者重新設計引物，利用CHD-W和CHD-Z擴增產物的熔解溫度不同來區分ZW條帶，但CHD-Z和CHD-W擴增反應是分別在兩個PCR反應管中進行的，這樣既增加了經濟成本，實用性較低，另一方面又可能發生誤判；另有報道顯示在同一管內用相同的引物擴增CHD-W和CHD-Z，利用擴增片段中Z和W具有3個SNP、其擴增產物的熔解溫度不同進行區分，該方法由于只采用了一對引物，且所產生的片段序列和大小非常接近,無法用凝膠電泳區分；其缺點是沒有熔解曲線分析儀的用戶無法采用，缺乏簡單有效的方法驗證結果。
因此，需要開發出一種簡單方便，能夠在鵪鶉出雛后快速、準確進行鵪鶉性別鑒定的方法。
技術實現要素：
本發明的目的在于根據禽類公母性染色體的特征，提供一種基于PCR技術進行鵪鶉性別鑒定的方法，從而實現出雛時鑒別鵪鶉性別的目的。
本發明通過以下技術方案實現：
為了解決上述技術問題，本發明提供了一種用于鑒定雛鵪鶉性別的微衛星引物對，該微衛星引物對的特點是只有母鵪鶉可以擴增出條帶，而在公鵪鶉上不能擴增出條帶，其核苷酸序列具體如下所示（114bp）：
上游引物：5'-cttctgcgagctgctcatctg-3'；
下游引物：5'-cagcggctgttgtcagtgtg-3'；
為了避免由于模板問題出現的未擴增出條帶的個體會造成結果的誤判，本發明在進行PCR擴增時設計了一對內參引物作為對照，其核苷酸序列如下（259bp）：
β-actin-F1:5’-CCCTGTATGCCTCTGGTC-3’；
β-actin-R1:5’-ATCTCCTGCTCGAAATCC-3。
一種基于PCR技術進行鵪鶉性別鑒定的制備方法,包括如下步驟：
根據鵪鶉Z和W染色體序列的特征，篩選出僅在W染色體上具有的微衛星位點設計相應的引物，進行鵪鶉W染色體上特有微衛星位點的擴增；同時，為了避免由于檢測個體DNA模板問題造成的誤判，本發明以β-actin基因作為內參基因，設計一對引物與該微衛星引物同時進行PCR擴增；隨后利用2%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行檢測，當擴增產物只出現259 bp的特異性擴增條帶時判定為公鵪鶉，當擴增產物出現259 bp的特異性擴增條帶和114 bp的特異性擴增條帶時判定為母鵪鶉。
上述的方法，所述的PCR擴增的反應體系由以下成分組成：模板DNA30-50ng，2×PCR擴增緩沖液7.5 μL，10 pmol/μL上游引物0.3 μL，10 pmol/μL下游引物0.3 μL，10 pmol/μL β-actin-F1引物0.3 μL、10 pmol/μLβ-actin-R1引物0.3 μL，加水至15 μL。
上述方法，所述的PCR擴增的反應程序為：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，53 ℃復性30s，72 ℃延伸30 s，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。
所述的基于PCR技術進行鵪鶉性別鑒定的方法可以應用于雛鵪鶉早期的性別鑒定中。
本發明具有如下優點和顯著的進步：（1）本發明篩選出僅在W染色體上具有的微衛星位點設計相應的引物，進行鵪鶉W染色體上特有微衛星位點的擴增；同時，為了避免檢測個體DNA模板問題造成的誤判，本發明以β-actin基因作為內參基因，設計一對引物與該微衛星引物同時進行PCR擴增，使用該發明可在鵪鶉剛出殼時進行其性別鑒定，減少了公鵪鶉的養殖量，降低育種企業的養殖成本，實現了在早期進行鵪鶉性別鑒定育種，豐富了現有技術。
附圖說明
圖1：本發明微衛星引物與內參基因同時進行PCR擴增以后的電泳檢測結果圖。其中：M為DNA分子量標準（DSTM2000），1、2、6、11為公，3、4、5、7、8、9、10、12為母。此檢測結果與實際性別完全相符。
具體實施方式
以下通過實施例形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
實施例1
利用僅存在于鵪鶉性染色體W染色體上的微衛星片段設計一對微衛星引物對，所述引物的序列為：
上游引物：5'-CTTCTGCGAGCTGCTCATCTG-3'
下游引物：5'-CAGCGGCTGTTGTCAGTGTG-3'
為了避免由于模板問題出現的未擴增出條帶的個體會造成結果的誤判，本發明在進行PCR擴增時設計了一對內參引物作為對照，其核苷酸序列如下（259bp）：
β-actin-F1:5’-CCCTGTATGCCTCTGGTC-3’
β-actin-R1:5’-ATCTCCTGCTCGAAATCC-3
實施例2
（1）試劑盒法提取鵪鶉血液基因組DNA
取10 μL鵪鶉抗凝血液加入蛋白酶K 20 μL、500 μLBB3，渦旋15 s充分混勻樣品，室溫孵育10 min；短暫離心，將全部溶液轉移入離心柱中，12000×g離心1 min，棄濾液；加入500 μL溶液CB3，12000×g離心30 s，棄濾液；加入500 μL溶液WB3，12000×g離心30 s，棄濾液，重復該步驟一次；12000×g離心2 min，徹底去除殘留的WB3；將離心柱轉移入一干凈的離心管中，在柱中央加入50-200 μL的預熱去離子水（PH>7），室溫靜置1 min，12000×g離心1 min，收集洗脫的DNA，4 ℃保存備用。
（2）PCR擴增條件
PCR反應總體積15 μL，其中2×PCR mix 7.5 μL，10 μmol/L微衛星上、下游引物各0.3 μL，10 μmol/L β-actin上、下游引物各0.3 μL，鵪鶉基因組DNA模板1.0 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR擴增程序是: 94 ℃ 5 min，然后再循環30次94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃ 延伸10 min。PCR反應產物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。
（3）瓊脂糖檢測PCR擴增產物
取6 μL PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠120 V電壓電泳20 min，用凝膠成像系統拍照、對PCR產物進行鑒定。根據帶型即可判斷鵪鶉的性別：僅一條帶（259bp）為公鵪鶉，兩條帶（259bp和114bp）為母鵪鶉。圖1為未知性別鵪鶉的PCR擴增產物的部分電泳圖，共檢測100個個體，根據本發明專利方法檢測的結果與30日齡時（已經可以通過體型外貌區分公母）的性別結果一致。
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