mir?3620的新用途的制作方法

本發明涉及腫瘤分子診斷領域，具體的涉及mir-3620及其成熟miRNA的新用途，更具體的涉及mir-3620及其成熟miRNA在診治結腸腺癌中的新應用。

背景技術：

miRNA是一種內源性非編碼小分子，通過特異性結合靶基因來調控基因的表達。單條miRNA可以靶向上百條靶基因，而大量的miRNA和靶基因間的相互作用對癌癥相關的信號通路起到了至關重要的調控作用。miRNA在正常細胞生理中起調節反饋和緩沖的作用，作為精調靶基因蛋白水平，防止其超出正常生理范疇的關鍵因子。此外，miRNA也是調節不同分子信號通路間的開關。miRNA表達量和活性的異常極有可能影響細胞的正常生理功能從而導致疾病的發生。通過大量的腫瘤組織和細胞株miRNA芯片檢測實驗，越來越多的miRNA被發現在癌癥中發揮著超出人們預期的重要作用。在轉基因小鼠的體內實驗中研究人員發現miRNA的異常表達通常會引起癌癥的發生。而一些miRNA甚至在不同腫瘤細胞中發揮著不同甚至截然相反的作用。所以，miRNA與癌癥的關系是我們在戰勝這種疾病的過程中必須搞清的問題。

本發明基于高通量測序方法，對6例結腸腺癌患者的癌組織及癌旁組織進行二代測序，獲得其miRNA的表達數據，同時，結合TCGA數據庫中337例結腸腺癌患者miRNA數據，進行整合生物信息學分析，從候選的miRNA中挑選出幾個進行分子生物學驗證，結果顯示，本發明提供的mir-3620與結腸腺癌密切相關，可用于結腸腺癌的臨床診斷及預防檢測，為臨床上相關診斷試劑或芯片等的開發奠定基礎。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供檢測mir-3620及其成熟miRNA的制劑在制備診斷結腸癌試劑中的應用。mir-3620的序列見序列表SEQ ID NO 1，miR-3620-5p序列見序列表SEQ ID NO 2；miR-3620-3p序列見序列表SEQ ID NO 3。

優選的結腸癌為結腸腺癌。

進一步，診斷結腸腺癌試劑包括基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA的轉錄或基于免疫檢測方法檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA調控的靶基因的表達情況，優選采用northern雜交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細胞術檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA的轉錄；采用ELISA和/或膠體金試紙條檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA調控的靶基因的表達情況。

優選的，基于定量PCR方法包括特異性擴增mir-3620及其成熟miRNA的引物，進一步優選，特異性擴增miR-3620的引物序列為SEQ ID NO 4；基于探針雜交方法包括與mir-3620及其成熟miRNA的核酸序列雜交的探針。

本發明的目的在于提供上調mir-3620及其成熟miRNA的轉錄和/或促進mir-3620及其成熟miRNA的活性的試劑在制備防治結腸癌制劑中的應用。

進一步，結腸癌為結腸腺癌。

進一步，防治結腸癌制劑防治結腸癌細胞增殖。

優選的，采用基于RNA的microRNA功能獲得性技術和/或基因特異性miR Mimics技術上調mir-3620及其成熟miRNA的轉錄和/或促進mir-3620及其成熟miRNA的活性。優選人工合成短發夾RNA或通過調控啟動子上調mir-3620及其成熟miRNA。

本發明的目的在于提供mir-3620及其成熟miRNA的靶基因在制備診斷和/或防治結腸腺癌制劑中的應用。

本發明的目的在于提供上述結腸腺癌診斷制劑在制備結腸腺癌診斷工具中的應用。

本發明的目的在于提供一種防治結腸癌試劑，所述試劑包含：

(a)上調mir-3620及其成熟miRNA的轉錄和/或促進mir-3620及其成熟miRNA的活性的試劑；

(b)藥劑學上能接受的載體。

優選的，采用基于RNA的microRNA功能獲得性技術和/或基因特異性miR Mimics技術上調mir-3620及其成熟miRNA的轉錄和/或促進mir-3620及其成熟miRNA的活性。優選人工合成短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)或通過調控啟動子上調mir-3620及其成熟miRNA的表達。

進一步的，所述結腸癌為結腸腺癌。

本發明的目的在于提供一種結腸腺癌診斷試劑，結腸腺癌診斷試劑能夠檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA的轉錄或免疫檢測方法檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA調控的靶基因的表達情況。

進一步，結腸腺癌診斷試劑基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA的轉錄或基于免疫方法檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA調控的靶基因的表達情況，優選采用northern雜交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細胞術檢測結腸腺癌樣本中mir-3620及其成熟miRNA的轉錄。

本發明的目的在于提供上述防治結腸腺癌的制劑在制備結腸腺癌治療藥物或試劑中的應用。

定義：

現階段檢測miRNA的表達水平的方法主要包括基于高通量測序技術、基于核苷酸雜交和基于PCR的miRNA檢測方法。基于探針雜交技術的miRNA檢測方法是一種直接檢測法，不需要對樣本RNA進行預擴增，包括northern雜交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細胞術等技術。

(1)Northern雜交

又稱RNA印跡技術為最經典的檢測真核生物RNA大小，估計其豐度的實驗方法。基本原理如下：首先在載體(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA樣本，再與經過標記的探針雜交，洗滌多余的雜交探針后進行信號檢測；也可以在載體上先固定與靶miRNA序列互補的DNA探針，然后與經過標記的樣本miRNA雜交，再進行信號檢測。信號標記的方法包括同位素標記、熒光標記和納米金標記等。

(2)miRNA表達譜芯片

原理同樣是使用標記探針檢測固相支持物上的目標分子。通過設計芯片上miRNA基因及內參序列，可精確分析出樣品中相應miRNA的表達水平。基因芯片具有高通量的優點，可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又稱多功能懸浮點陣(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技術。液相芯片體系由許多小球體為主要基質構成，每種小球體上固定有不同的探針分子，為了區分不同的探針，每一種用于標記探針的球形基質都帶有一個獨特的色彩編號，將這些小球體懸浮于一個液相體系中，就構成了液相芯片系統。該系統可以對同一個微量樣本中的多個不同分子同時進行快速的定性、定量分析，這種檢測技術被稱為FMAP(Flexible multianalyte profiling)技術。分子雜交在懸浮溶液中進行，檢測速度極快。

(3)核酶保護分析技術(RPA)

miRNA的檢測還可以采用核酶保護分析技術，將標記好的探針和待測RNA樣本混合，熱變性后雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受保護的RNA分子，最后通過變性PAGE電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡單快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。

(4)RAKE法

RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基礎上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA與固定的DNA探針雜交的方法。RAKE可以敏感特異地檢測miRNA，適用于大量快速的篩選所有己知的miRNA。能夠在特定的細胞和腫瘤中檢測miRNA表達譜情況。不僅如此，RAKE法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分離出miRNA并對其進行分析，為從存檔標本中分析miRNA開啟了希望之門。

(5)原位雜交(in situ hybridization)

原位雜交技術可直觀了解miRNA表達方式，是觀測miRNA時空表達的一種較簡便的方法，常標記方式包括地高辛、生物素、熒光標記等。鎖定核酸基礎上的原位雜交(Locked Nucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是當前應用較多的探針方式。

(6)基于微球的流式細胞術(bead-based flow cytometry)

是一種液相芯片技術，該方法將流式細胞檢測與芯片技術有機地結合起來，兼有通量大、檢測速度快、靈敏度高和特異性好等特點。

(7)實時熒光定量PCR技術(Real-time PCR，RT-PCR)

熒光檢測PCR儀可對整個PCR過程中擴增序列的累積速率繪制動態變化曲線。在反應混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴增產物某特定產量的PCR循環數(一般用特定閾值循環數Ct來表達)越少。由于miRNA長度僅為22nt，傳統的qRT-PCR不適合擴增如此短的片段。現今有幾種用于miRNA的實時定量PCR方法，如加尾法、頸環法等。頸環法是一種理想的miRNA檢測qRT-PCR方法：首先設計特殊的莖環結構引物，以待測miRNA為模板逆轉錄合成cDNA第一鏈，該cDNA一端為莖環狀引物，莖環狀結構被打開便增加了cDNA的長度，隨后以合成的cDNA為模板設計引物進行實時定量PCR擴增。qRT-PCR具有特異性高、靈敏度好、快速簡單等多種優點。

(8)測序法

大部分已知的miRNA都是通過cDNA克隆測序發現和鑒定的。該法需要先構建miRNA的cDNA文庫，再進行PCR擴增，擴增產物隨后克隆到表達載體上測序。Takada開發了一種改進的擴增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3’端連上接頭，然后用與接頭互補的反轉錄引物反轉錄。因為特定的反轉錄酶具有末端脫氧核苷酸轉移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會連接到反轉錄出的cDNA鏈的3’末端。當5’端接頭與cDNA鏈的poly(C)粘性末端退火后，加入一對共用引物即可實現對cDNA的PCR擴增。由于mRAP高度靈敏，可以直接用克隆和測序技術檢測少量組織中miRNA的表達量。標簽序列克隆法是一種在在基因表達系列分析(SAGE)技術的基礎上發展了檢測效率更高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，該法通過生成大的串聯子，通過單個測序反應可檢測多個miRNA，明顯提高了檢測效率。

高通量測序(High-throughput sequencing)又稱下一代測序技術(next generation sequencing)是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，極大提高了測序效率。這類大規模測序技術極大的提高了多個物種遺傳信息的解讀速度，為獲取所有miRNA的序列信息，解密miRNA圖譜提供了保證。同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。高通量測序平臺的代表是羅氏公司(Roche)的454測序儀(Roch GSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD測序儀(ABI SOLiD sequencer)。

基于RNA的microRNA功能獲得性技術即通過外源性補充miRNAs合成的前體物質來升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成與內源性miRNA序列一致的短發夾樣RNA(short hairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做啟動子，以病毒為載體轉染細胞，被Dicer酶修飾后載入RISC發揮作用，相當于升高pre-miRNA的水平，作用效果穩定而持久。

基因特異性miR Mimics技術該技術避免了miRNA與基因的非特異性作用。這種人工合成的與靶基因3’UTR互補結合的特異性寡核苷酸鏈，能夠起到與miRNA相同的轉錄后調節作用。

miRNA調控的主要方式有兩種：一種是與靶基因mRNA的3’UTR不完全互補配對，阻斷靶基因的翻譯，從而調節基因表達；另一種是與siRNA類似，當miRNA與mRNA完全互補配對時，Ago2蛋白通過切割mRNA直接導致其降解，實現基因沉默。總之，當前認為miRNA以何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對程度有關。miRNA與目的基因配對不完全時，miRNA就以抑制目的基因的表達發揮作用；miRNA與目的基因某段序列配對完全時，就可能引起目的基因在互補區斷裂而導致基因沉默。

包含在本發明的藥劑學組合物的藥劑學上許可的載體為在制劑時通常利用的載體，該載體包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、水、糖漿、甲基纖維素(methyl cellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂(stearic acid magnesium)及礦物油(mineral oil)等，但并非局限于此。

本發明的藥劑學組合物除了上述成分以外還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學上許可的適合的載體和制劑詳細記載于雷明登氏藥學全書。

本發明的藥劑學組合物能通過口服或非口服進行給藥，作為非口服給藥時，能通過靜脈內注射，鼻腔內注射，局部注射，腦室內注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經皮給藥等方式進行給藥。

本發明的藥劑學組合物的適合的給藥劑量根據制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態、食物、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應靈敏性之類的因素而可以進行多種處方，通常，熟練的醫生能夠容易地決定及處方對所希望的治療或預防有效的給藥劑量。

本發明的藥劑學組合物根據本發明所屬技術領域的普通技術人員可以容易實施的方法，利用藥劑學上能接受的載體和/或賦形劑來進行制劑化，從而能夠以單位用量形態制備或者內裝在多容量容器內來制備。此時，劑型是油性或者水性介質中的溶液、懸浮液或乳化液形態，或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態，還可以包括分散劑或者穩定劑。

附圖說明

圖1是轉染miR-3620-3p mimics后細胞生長曲線圖

圖2是轉染miR-3620-3p inhibitor后細胞生長曲線圖

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。

實施例1樣品的收集及總RNA提取

收集醫院2014年1月到2015年8月結腸腺癌患者癌組織及對應癌旁組織各6例。患者術前未經放療和化療，術中取材，立即放入液氮中保存，隨后轉入-80℃長期保存，以用于RNA提取。標本經病理診斷確診為結腸癌。

RNA提取標準：RNA純度：OD260/280≧1.8，28S/18S≧1；RNA完整性：RIN值≧7.0。RNA完整性檢測方法：Agilent 2100(RNA 6000Nano kit)、瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖凝膠濃度：1％瓊脂糖膠；電壓：5V/cm；時間：20min)。

實施例2測序及數據整合分析

測序：運用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量測序技術對miRNA進行測序，通過去接頭、去低質量、去污染等過程完成數據的處理，得到最終數據。

整合分析：TCGA數據庫的nationwidechildrens.org_clinical_patient_coad文件中共記錄459例結腸腺癌患者的臨床信息。本項目排除history_other_malignancy或history_neoadjuvant_treatment為Yes的患者62例，將histologic_diagnosis為Colon Adenocarcinoma的337例患者納入研究(histologic_diagnosis為Colon Mucinous Adenocarcinoma、[Not Available]、[Discrepancy]的60例患者未納入研究)。采用337例結腸腺癌(COAD)患者TCGA數據庫中miRNA數據，進行分析。這些數據均來自結腸腺癌病例組Primary solid Tumor和對照組的Solid Tissue Normal。

通過轉錄組數據分析軟件對miRNA測序原始數據及整合分析數據進行背景校正后進行t-test得到P值，然后利用Fisher檢驗合并P值，篩選差異表達miRNA。從候選的差異表達miRNA中挑選到mir-3620進行后期驗證。

實施例3 Real-time PCR檢測結腸腺癌組織中miR-3620-3p的表達

1樣品采集：

36例結腸腺癌腫瘤患者癌組織及癌旁組織(采集時間2014年1月-2015年8月)。

2總RNA提取：

相關實驗物品的去Rnase的處理：

①將所有玻璃器皿應用前均用DEPC沖洗侵泡，120℃高壓20min，180℃高溫烤干2小時以上。

②將塑料器皿(如：EP管/槍頭)使用前需用0.1％DEPC水侵泡過夜，后控干液體，120℃高壓20min，烤箱烤干備用。

白細胞分離

(1)取2m1抗凝外周血(采血時間不超過3h)；

(2)加入等體積無菌PB S于外周血中充分混合，形成細胞懸液；

(3)加入4m1淋巴細胞分離液于另一離心管；

(4)吸取4m1細胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細胞分離液表面(注意勿與淋巴細胞分離液混合)。離心1500rpm 20min；

(5)用吸管輕輕吸出界面層(白膜)入另一離心管中。無菌冷PBS洗2次，最后1次洗滌可以將細胞懸液移入EP管中，離心去上清，用于提取RNA。

RNA提取

(1)從-80℃冰箱里取出樣本，切碎，按1ml/50-100mg的比例加入Trizol于EP管中，進行勻漿處理，室溫靜置5-l0min；

(2)每毫升Trizol加入0.2m1氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置2-3min，在4℃下1 2000轉離心15min；

(3)小心吸出上清水相約600ul移入另一離心管(注意不要抽到蛋白層)，加入等量異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min；

(4)4℃1 2000g離心l 0min，棄上清液，底部可見白色物質；

(5)加入lml 75％冷乙醇旋轉洗滌，清洗異丙醇；

(6)4℃12000g離心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1DEPC水溶解RNA。取3u1RNA樣本，于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳；lu1RNA樣品于紫外分光光度計檢測濃度，以A260/280在1.8-2.0視為RNA樣本合格。

3逆轉錄

RT體系的配制：1μg總RNA作為模板RNA；5×miScript HiSpec Buffer 4μl；10×Nucleics Mix 2μl；miScript Reverse Transcriptase Mix 2μl；滅菌水補平至20μl。ABI 9700型PCR儀上37℃保溫60min使逆轉錄反應完全后，95℃5min終止反應。加入80μl Nuclease-free H₂O稀釋至100μl儲存在-20℃冰箱備用。

4熒光定量PCR

miRNA的RT-PCR體系的配制：

miRNAs的表達檢測每次設置3個平行管反應，以snRNA U6作為內參。

擴增程序：95℃10min；40個循環(95℃10s，60℃30s)。

5統計學分析

實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效率相近，極限平而無上揚現在，曲線指數期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產物溶解曲線都是單峰，說明擴增產物只有一條，為特異性擴增；根據qRT-PCR的相對定量公式：ΔΔCt＝Ct(miR-3620-3p)-Ct(U6)，fold＝2^-ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍數關系，比較miR-3620-3p在結腸腺癌組織和癌旁組織中的表達水平。結果顯示：qRT-PCR擴增結果穩定，目的基因在癌旁組織的表達量為癌組織的約4倍，以上結果驗證了高通量測序數據和整合分析數據分析的結果。

實施例4人結腸癌細胞株的培養及瞬時轉染

一、材料準備：

人結腸癌細胞系HCT116購自ATCC細胞庫。

Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent(Invitrogen)。

RPMI 1640和DMEM培養基購自GIBCO公司，新生牛血清和胎牛而清購自PAA公司。

miR-3620-3p序列發給合成公司，請其化學合成miR-3620-3p mimics、miR3620-3p inhibitor及其非特異性對照。

二、實驗方法

1、細胞培養

結腸癌細胞株HCT116采用含10％新生牛血清的RPMI 1640培養基，在37℃、5％CO₂、飽和濕度的條件下傳代培養，細胞生長狀態良好時用于實驗。

2、miRNA瞬時轉染

操作按Lipofectamine^TM2000試劑說明書進行。轉染前24h將生長狀態良好的HCT116細胞接種到6孔板中，細胞計數約為4×10⁵/L，常規培養至轉染當天，細胞融合度為70-80％時進行實驗。將100nM miR-3620-3p mimics/miR3620-3p inhibitor加入到250μl opti-MEM培養基中，輕柔混勻；另用250μl opti-MEM培養基稀釋5μl Lipofectamine^TM 2000脂質體，輕柔混勻，室溫孵育5min；混合Opti-MEM-脂質體與Opti-MEM-miRNAs，室溫孵育20min，以形成轉染復合物：然后將上述混合物加到細胞培養基中，輕輕混勻，培養6h后更換完全培養基。其中，非特異性的mimics Negative Control(mimics NC)和inhibitor Negative Control(inhibitor NC)序列作為對照。培養24-48h后抽提細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，實時定量PCR檢測瞬時轉染后miR-3620-3p表達的改變。

3.實驗結果：

采用陽離子脂質體法進行瞬時轉染，分別將miR-3620-3p mimics或miR-3620-3pinhibitor及相應對照序列Negative Control(NC)轉染結腸癌細胞株HCT116。轉染48h后，抽提細胞總RNA。以U6為內對照，實時定量PCR檢測miR-3620-3p的表達。結果顯示：與對照組相比，HCT116轉染miR-3620-3p mimics后，miR-3620-3p的表達增高了約4.5倍(P＝0.001)；轉染miR-3620-3p inhibitor后，表達下降了近76％(P＝0.001)。以上結果表明，通過瞬時轉染miR-3620-3p mimics和miR-3620-3p inhibitor可有效上調或下調miR-3620-3p的表達，結果可靠可進行后續實驗。

實施例5轉染miR-3620-3p對人結腸癌細胞增殖的影響

1×10³個細胞接種于96孔板，分別培養1,2,3,4,5d，每孔加入無血清的RPMI-1640培養液200μl及5mg/ml的四氮唑藍鹽(MTT)20μl，繼續培養4h，吸棄液體，每孔加入DMSO150μl，室溫孵育10min，置搖床上輕輕搖動15min，用Bio-Rad酶聯免疫檢測儀在490nm測定每孔的吸光度值(OD值)，以空白對照孔調零，以相對應的OD值表示細胞增殖能力的大小。每組設3個重復孔，取平均值，繪制體外生長曲線。

將瞬時轉染后的HCT116細胞接種到96孔板中，采用MTT法檢測miR-3620-3p過表達對結腸癌細胞增殖能力的影響。結果如圖1所示，轉染miR-3620-3p mimics 5天后，與對照組(轉染mimics NC)相比，HCT116細胞的生長速度減慢約35.7％，差異有統計學意義，提示miR-3620-3p過表達可抑制結腸癌細胞的體外增殖能力。

將瞬時轉染后的HCT116細胞接種到96孔板中，采用MTT法檢測沉默miR-3620-3p對結腸癌細胞增殖能力的影響。結果如圖2所示，結腸癌細胞瞬時轉染miR-3620-3p inhibitor 5天后，細胞的生長速度提高了34.5％，差異有統計學意義，提示沉默rniR-3620-3p表達能增強結腸癌細胞的體外增殖能力。

雖然已參考各種優選實施方案描述了本發明，但本領域技術人員理解，可進行各種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發明的基本范圍。此外，可進行許多改動來使特定情況或材料適合于本發明的教導而不背離其基本范圍。