本發明涉及從制備精品肝素鈉過程中產出的下腳料中制備高純度硫酸皮膚素的方法，屬于黏多糖生物制藥技術領域。
背景技術：
硫酸皮膚素（dermatan sulfate，簡稱DS），是一種天然的糖胺聚糖，由重復的二糖單位組成，其二糖為乙酰氨基硫酸半乳糖和艾杜糖醛酸，主要為N-乙酰半乳糖胺4-硫酸和L-艾杜糖醛酸構成的雙糖鏈結構。硫酸皮膚素廣泛分布于動物組織中，具有抗血栓、抗水腫、促進皮膚更新、阻止皮膚的過度角質化和棘皮癥、滋潤皮膚、保持水分的作用，近年來受到國內外專家的日益重視。硫酸皮膚素的治療效果與其純度有直接關系，一般情況下硫酸皮膚素的純度越高，其抗凝效價越低，激活肝素輔因子Ⅱ活性越高，出血副作用發生的可能性越小，在用于長期治療血栓的過程中更加安全可靠。
硫酸皮膚素除本身具有的治療作用外，還能用于制備抗血栓藥物舒洛地特。舒洛地特是由硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素兩種組分組成，兩種組分可以協同發揮作用，可以發揮較強的抗栓作用，且其引起出血的可能性小，尤其適合抗血栓的長期治療。由于該藥物良好的治療效果，因而具有很大的市場需求，CN100384884C中采用了從肝素鈉副產物中通過乙醇分級沉淀分離提純硫酸皮膚素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，雖然該方法對于分級沉淀時藥液濃度、鹽含量及乙醇濃度均做了研究，但未公開影響藥液沉淀分離效果的重要因素pH值和沉淀溫度。其制備的硫酸皮膚素檢測結果為比旋度-55°～-63°，抗凝效價≤10USPu/mg，由于硫酸皮膚素的純度越高其比旋度越低，抗凝效價越低，說明其制備的硫酸皮膚素純度較低，因而無法發揮更好的治療效果。
技術實現要素：
本發明在于改進現有技術缺陷而提供一種利用肝素鈉下腳料制備高純度硫酸皮膚素的方法。
本發明建立的方法主要是從肝素鈉下腳料中通過乙醇分級沉淀，得到硫酸皮膚素粗品；采用亞硝酸鹽降解硫酸皮膚素粗品，使得粗品中含有的肝素降解成小分子肝素或單、雙糖，并通過乙醇分級沉淀去除小分子肝素和單、雙糖肝素以及少量的硫酸軟骨素，從而得到高純度硫酸皮膚素。
其具體工藝包括以下步驟：
a. 粗分
將肝素鈉下腳料按濕重5～30%w/v濃度加入純化水溶解后加入2～10%w/v氯化鈉，氯化鈉溶解后，調整藥液pH4.0～6.5后加入乙醇，當藥液中乙醇的濃度為30～38%v/v時，在10～25℃靜置沉淀，沉淀2～10小時后將沉淀物與上清液分離，在分離的上清液中補加乙醇，當藥液中乙醇的濃度為40～50%v/v時，在10～25℃靜置沉淀，沉淀6～12小時后收集沉淀得到硫酸皮膚素粗品；
b. 精制
將上述硫酸皮膚素粗品按濕重10～50%w/v的濃度加入純化水溶解后，調節藥液pH2.0～2.5，再向藥液中加入0.6～3.0%（w/w）亞硝酸鈉后（以硫酸皮膚素粗品濕重計），在常溫下攪拌反應2～5小時，然后靜置24小時后加入1～6%（w/v）氯化鈉，調整藥液pH4.0～6.5后，加入乙醇，當藥液中乙醇濃度為37～45%（v/v）時，在10～25℃靜置沉淀，沉淀8～24小時后收集沉淀得到比旋度≤-65°的硫酸皮膚素精品；
c. 氧化脫色
將硫酸皮膚素按濕重10～50%（w/v）加純化水溶解后，在25～35℃下調整藥液pH9.0～12.0后，加入過氧化氫進行反應，其中過氧化氫在藥液中的濃度為0.5～4.0%v/v；
d. 沉淀
上述反應8～36小時后，按質量體積比向藥液中加入1～6%的氯化鈉，氯化鈉溶解后調整藥液pH4.0～6.5，再加入1.5～3.0倍藥液體積的乙醇，然后在10～25℃下靜置沉淀，沉淀8～24小時后收集硫酸皮膚素沉淀；
e. 冷凍干燥
將上述硫酸皮膚素沉淀物按濕重30～45%濃度加入純化水溶解后降溫，降溫至-40～-60℃時抽真空，當真空度≤15Pa后緩慢加熱，加熱至50～55℃后保溫，保溫3～5小時后制得硫酸皮膚素目標產品。
經取樣檢測，硫酸皮膚素分子量為8000～40000道爾頓，比旋度為-65°～-70°，抗凝效價≤2uspu/mg，硫酸基與羧酸基比值為0.8～1.2，純度≥98%。
本發明取得的技術進步：
本發明采用從粗品肝素鈉到精品肝素鈉生產過程中產生的下腳料為原料，從下腳料中進一步深加工出高純度硫酸皮膚素，實現了將下腳料變廢為寶的過程，可以為企業創造出較大的額外收益。本發明主要采用亞硝酸鈉降解和乙醇分級沉淀，制得的硫酸皮膚素產品的比旋度為-65°～-70°，抗凝效價≤2USPu/mg，分子量為8000～40000道爾頓，硫酸基與羧酸基比值為0.8～1.2，且經毛細管電泳分析，用硫酸皮膚素標準品作為對照，測得制備的硫酸皮膚素的純度在98%以上。高純度的硫酸皮膚素臨床可發揮更好的治療效果，更具有市場競爭力，可為企業帶來更大的經濟收益，工藝綠色環保，不產生有毒有害物質，工藝步驟簡易，成本低廉，易于規模化生產。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
實施例1：a. 粗分
取生產肝素鈉精品的下腳料濕品2kg加純化水溶解并定容至40L后，加入3.2kg氯化鈉，氯化鈉溶解后，用3mol/L鹽酸溶液調整溶液pH6.0后加入乙醇，使溶液中乙醇的濃度為37.5%L/L，然后在15±1℃靜置沉淀，沉淀8小時后分離沉淀物和上清液。收集上清液，上清液中補加乙醇，使藥液中乙醇的濃度為49%L/L時，在15±1℃下靜置沉淀，沉淀8小時后收集沉淀得到硫酸皮膚素粗品1.4kg；
b. 硫酸皮膚素的精制
將上述1.4kg硫酸皮膚素粗品加純化水溶解并定容至10L，用3mol/L鹽酸溶液調節藥液pH2.2后向溶液中加入11.2g亞硝酸鈉（以硫酸皮膚素粗品濕重計），采用亞硝酸鈉溶于45ml純化水后加入藥液中，在常溫下攪拌反應2小時，靜置24小時后在藥液中加入500g氯化鈉，攪拌溶解后，用3mol/L氫氧化鈉溶液調整藥液pH6.2，加入乙醇，使藥液中乙醇的濃度為43%L/L，在15±1℃靜置沉淀，沉淀16小時后收集沉淀得到硫酸皮膚素精品1.1kg，取樣檢測比旋度為-66.0°；
取樣檢測如果若硫酸皮膚素不能滿足比旋度≤-65°，須重復上述沉淀過程；當硫酸皮膚素檢測結果符合要求后，則可進行以下氧化脫色；
c. 硫酸皮膚素氧化脫色
將1.1kg硫酸皮膚素濕精品加純化水溶解并加水定容至4L后，在30±1℃下用3mol/L氫氧化鈉溶液調整藥液pH10.6后，加入40ml 30%的過氧化氫進行反應；
d. 氧化后沉淀
上述反應10小時后，向藥液中加入140g氯化鈉，氯化鈉溶解后用3mol/L鹽酸溶液調整藥液pH6.3，再加入8L乙醇，然后在15±1℃靜置沉淀，沉淀10小時后收集硫酸皮膚素沉淀；
e. 硫酸皮膚素冷凍干燥
向硫酸皮膚素沉淀中加入2000ml純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至3000ml，將藥液裝入凍干盤放入凍干機中，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-57℃后，對整個系統抽真空，當干燥箱內真空度為14Pa后，對制品緩慢加熱，當制品溫度升至51℃后保溫，保溫3.5小時后制得硫酸皮膚素367g。
經取樣檢測，硫酸皮膚素比旋度為-66.1°，抗凝效價為<2USPU/mg，分子量為25163，硫酸基與羧酸基比值1.0。經毛細管電泳測定，用硫酸皮膚素標準品做對照，測定制得的硫酸皮膚素樣品的純度為98.2%。
實施例2：本實施例與實施例1不同之處是，
a. 粗分
將生產肝素鈉精品的下腳料濕品4kg加純化水溶解并定容至40L后，加入2.0kg氯化鈉，氯化鈉溶解后，用3mol/L鹽酸溶液調整溶液pH5.8后加入乙醇，使溶液中乙醇的濃度為35.4%L/L，然后在11±1℃靜置沉淀，沉淀6小時后分離沉淀物和上清液。在收集的上清液中補加乙醇，使藥液中乙醇的濃度為45.0%L/L時，在11±1℃下靜置沉淀，沉淀6小時后收集沉淀得到硫酸皮膚素粗品2.3kg；
b. 硫酸皮膚素的精制
將上述2.3kg硫酸皮膚素粗品加純化水溶解并定容至10L，用3mol/L鹽酸溶液調節藥液pH2.0后向溶液中加入46g亞硝酸鈉（以硫酸皮膚素粗品濕重計），采用亞硝酸鈉溶于230ml純化水后加入藥液中，在常溫下攪拌反應3小時，靜置24小時后，在藥液中加入300g氯化鈉，攪拌溶解后，用3mol/L氫氧化鈉溶液調整藥液pH5.5，加入乙醇，使藥液中乙醇的濃度為40%L/L，在11±1℃靜置沉淀，沉淀8小時后收集沉淀得到硫酸皮膚素精品2.0kg，取樣檢測比旋度為-67.2°；
取樣檢測如果若硫酸皮膚素不能滿足比旋度≤-65°，須重復上述沉淀過程；當硫酸皮膚素檢測結果符合要求后，則可進行以下氧化脫色；
c. 硫酸皮膚素氧化脫色
將2.0kg硫酸皮膚素濕精品加純化水溶解并加水定容至8L后，在26±1℃下用3mol/L氫氧化鈉溶液調整藥液pH11.5后，加入240ml 30%的過氧化氫進行反應；
d. 氧化后沉淀
上述反應8小時后，向藥液中加入160g氯化鈉，氯化鈉溶解后用3mol/L鹽酸溶液調整藥液pH5.2，再加入12L乙醇，然后在11±1℃靜置沉淀，沉淀12小時后收集硫酸皮膚素沉淀；
e. 硫酸皮膚素冷凍干燥
向硫酸皮膚素沉淀中加入5000ml純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至5500ml，將藥液裝入凍干盤放入凍干機中，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-51℃后，對整個系統抽真空，當干燥箱內真空度為11Pa后，對制品緩慢加熱，當制品溫度升至54℃后保溫，保溫4小時后制得硫酸皮膚素866g；
經取樣檢測，硫酸皮膚素比旋度為-67.5°，抗凝效價為<2USPU/mg，分子量為28365，硫酸基與羧酸基比值1.0。經毛細管電泳測定，用硫酸皮膚素標準品做對照，測定制得的硫酸皮膚素樣品的純度為98.5%。
實施例3：本實施例與實施例1、實施例2不同之處是，
a. 粗分
將生產肝素鈉精品的下腳料濕品10kg加純化水溶解并定容至40L后，加入0.8kg氯化鈉，氯化鈉溶解后，用3mol/L鹽酸溶液調整溶液pH5.5后加入乙醇，使溶液中乙醇的濃度為32.3%L/L，然后在20±1℃靜置沉淀，沉淀3小時后分離沉淀物和上清液。在收集的上清液中補加乙醇，使藥液中乙醇的濃度為41.1%L/L時，在20±1℃下靜置沉淀，沉淀10小時后收集沉淀得到硫酸皮膚素粗品5.8kg；
b. 硫酸皮膚素的精制
將上述5.8kg硫酸皮膚素粗品加純化水溶解并定容至20L，用3mol/L鹽酸溶液調節藥液pH2.5后向溶液中加入168g亞硝酸鈉（以硫酸皮膚素粗品濕重計），采用亞硝酸鈉溶于560ml純化水后加入藥液中，在常溫下攪拌反應5小時，靜置24小時后，在藥液中加入1.0kg氯化鈉，攪拌溶解后，用3mol/L氫氧化鈉溶液調整藥液pH6.3，加入乙醇，使藥液中乙醇的濃度為41.2%L/L，在20±1℃靜置沉淀，沉淀24小時后收集沉淀得到硫酸皮膚素精品4.6kg，取樣檢測比旋度為-68.6°；
取樣檢測如果若硫酸皮膚素不能滿足比旋度≤-65°，須重復上述沉淀過程；當硫酸皮膚素檢測結果符合要求后，則可進行以下氧化脫色；
c. 硫酸皮膚素氧化脫色
將4.6kg硫酸皮膚素濕精品加純化水溶解并加水定容至12L后，在33±1℃下用3mol/L氫氧化鈉溶液調整藥液pH9.3后，加入120ml 30%的過氧化氫進行反應；
d. 氧化后沉淀
上述反應20小時后，向藥液中加入480g氯化鈉，氯化鈉溶解后用3mol/L鹽酸溶液調整藥液pH6.0，再加入36L乙醇，然后在20±1℃靜置沉淀，沉淀22小時后收集硫酸皮膚素沉淀；
e. 硫酸皮膚素冷凍干燥
向硫酸皮膚素沉淀中加入10L純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至12L，將藥液裝入凍干盤放入凍干機中，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-52℃后，對整個系統抽真空，干燥箱內真空度為15Pa后，對制品緩慢加熱，當制品溫度升至55℃后保溫，保溫5小時后制得硫酸皮膚素1.9kg；
經取樣檢測，硫酸皮膚素比旋度為-69.1°，抗凝效價為<2USPU/mg，分子量為31254，硫酸基與羧酸基比值1.0。經毛細管電泳測定，用硫酸皮膚素標準品做對照，測定制得的硫酸皮膚素樣品的純度為98.8%。