本發(fā)明涉及一種基于流式細(xì)胞術(shù)的高通量篩選金霉素高產(chǎn)菌株的方法，屬于高通量篩選技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金霉素(Chorotetracycline，即CTC)屬于四環(huán)素類的一種廣譜抗生素。金霉素能夠抑菌、促生長、飼料利用率高、在肌體內(nèi)殘留量低。其生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)較為成熟，生產(chǎn)成本也較低，成為目前飼料工業(yè)中用量最大的抑菌促生長劑。目前國內(nèi)工廠金霉素的產(chǎn)率還較低(效價(jià)在18000μg/mL左右)，因此提高金霉素的產(chǎn)率很有必要。金霉素是由金色鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)發(fā)酵得到的次級代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量合成性狀受多基因決定，代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜。影響金霉素發(fā)酵過程的因素也很多，如種子的質(zhì)量、培養(yǎng)基的組成、工藝條件以及發(fā)酵過程的代謝控制等。目前微生物育種技術(shù)已經(jīng)從誘變、推理、重組技術(shù)發(fā)展到代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)和異源生物合成等方法。但傳統(tǒng)誘變育種仍具有諸多優(yōu)勢。如不需要知道生物遺傳背景、代謝模型，只需要獲得有效突變庫和定向篩選。高通量篩選與常規(guī)誘變結(jié)合，適用于以提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量為目標(biāo)的工業(yè)生產(chǎn)菌株選育，盡可能減少漏篩現(xiàn)象。
目前的經(jīng)典誘變結(jié)合高通量篩選方法，由于經(jīng)典誘變會存在大量死細(xì)胞而可能導(dǎo)致后續(xù)可培養(yǎng)無法實(shí)現(xiàn)，同時(shí)經(jīng)典誘變后的菌株要進(jìn)一步分離純化、擴(kuò)大培養(yǎng)之后才能進(jìn)行后續(xù)酶標(biāo)板等高通量篩選而存在篩選周期長等問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明聯(lián)合經(jīng)典誘變、流式細(xì)胞術(shù)、高通量孔板篩選、固液聯(lián)合培養(yǎng)，提供了一種基于流式細(xì)胞術(shù)的高通量篩選金霉素高產(chǎn)菌株的方法。本發(fā)明基于流式細(xì)胞術(shù)對金霉素高通量篩選，可在短時(shí)間內(nèi)對大量有效菌株進(jìn)行分析，從而分選目的活孢子，進(jìn)而進(jìn)行高通量培養(yǎng)檢測。
本發(fā)明的基于流式細(xì)胞術(shù)的高通量篩選金霉素高產(chǎn)菌株的方法，主要包括步驟如下：
(1)獲得金色鏈霉菌的多個(gè)含量死孢子在內(nèi)的待篩選的孢子；
(2)利用PI染料對步驟(1)的待篩選的孢子進(jìn)行染色；
(3)使用流式細(xì)胞儀檢測孢子活性；
(4)利用流式細(xì)胞儀分選有活性孢子，直接將單個(gè)有活性的孢子分選到裝有固體培養(yǎng)基的高通量孔板中；
(5)待高通量孔板的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3天，直接添加液體種子培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)得到種子液；將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的新的高通量孔板中，發(fā)酵培養(yǎng)；
(6)配置一定濃度梯度的金霉素標(biāo)準(zhǔn)品，吸取Tris-HCl緩沖溶液、Sm(NO)3溶液、各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，震蕩混勻至顯色完全，用酶標(biāo)儀檢測，得到金霉素與405nm下的吸光值OD的關(guān)系；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵液上清，在合適的濃度下加入到含有Tris-HCl緩沖溶液和釤溶液的孔板中，震蕩混勻至顏色變?yōu)榈S色，然后用酶標(biāo)儀測定405nm下的吸光值OD，進(jìn)而得知待篩選菌株產(chǎn)金霉素含量的相對高低；
(7)選取上一步得到的金霉素含量相對較高的菌株多株，進(jìn)行復(fù)篩。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的待篩選孢子可以是不同活性的孢子，包括死孢子。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的待篩選孢子是將金色鏈霉菌進(jìn)行誘變后得到的。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的待篩選的孢子中，死孢子含量達(dá)90％以上，優(yōu)選地達(dá)95％以上更優(yōu)選地達(dá)99％以上。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述誘變，可以是物理誘變或者化學(xué)誘變，比如常壓室溫等離子體(ARTP)誘變、紫外誘變、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變、亞硝基胍(NTG)誘變、硫酸二乙酯(DES)誘變等等。。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)的染色，具體是：將待篩選的孢子調(diào)整至濃度105～106個(gè)孢子/mL的懸浮液，將等體積懸浮液與10μg/mL PI染色劑混合，避光放置4℃冰箱孵育20min。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(3)和步驟(4)具體是：以沒有標(biāo)記任何熒光素的樣品為陰性對照、將完全無活性的與PI染色劑結(jié)合的樣品設(shè)置為陽性對照，確定陰性與陽性孢子群體；取染色后的金色鏈霉菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數(shù)，上流式細(xì)胞儀分析，用FL3通道((610±15)nm)檢測，將無熒光區(qū)域最集中部分設(shè)門分選至裝有固體培養(yǎng)基的高通量孔板中，每孔分選設(shè)定為單個(gè)孢子。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(4)中，裝有固體培養(yǎng)基的高通量孔板中固體培養(yǎng)基的體積為50μL/孔。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(5)中，是培養(yǎng)至長出可見孢子后添加液體種子培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(5)中液體種子培養(yǎng)基的添加量為150μL/孔。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(5)中發(fā)酵培養(yǎng)液的添加量為900μL/孔。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(6)，在線性濃度范圍內(nèi)，目標(biāo)物濃度越大，OD值越大。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(6)的一定濃度梯度是0～360μg/mL。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(6)，是繪制金霉素與405nm下的吸光值OD的標(biāo)準(zhǔn)曲線；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵上清液稀釋至合適濃度，加入到提前添加了Tris-HCl緩沖溶液和釤溶液的孔板中，震蕩混勻至顏色變?yōu)榈S色，然后用酶標(biāo)儀測定405nm下的吸光值OD，將吸光值OD代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的金霉素含量。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(6)，是將20μL Tris-HCl緩沖溶液、60μL Sm(NO)3溶液、120μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品金霉素溶液或者稀釋后的發(fā)酵液震蕩混勻。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Tris-HCl緩沖溶液的pH為6.7，Sm(NO)3溶液的濃度為5×10-4mol/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述高通量孔板可以是96深孔板、96淺孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一種具有高通量篩選作用的培養(yǎng)器皿。優(yōu)選地，裝有固體培養(yǎng)基的高通量孔板為96淺孔板，裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的高通量孔板為48深孔板。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明方法結(jié)合了常壓室溫等離子體(ARTP)、PI染色法、流式細(xì)胞術(shù)分析分選法、酶標(biāo)儀檢測、固液結(jié)合的培養(yǎng)方法和高通量篩選技術(shù)，對分選有活性金色鏈霉菌孢子培養(yǎng)提供了一種精確快速的方法。本發(fā)明方法基于流式細(xì)胞儀能夠在短時(shí)間內(nèi)對單孢子檢測，從而建立龐大的分析目標(biāo)群體，流式細(xì)胞術(shù)高通量的分選培養(yǎng)減少了在平板上生長的過程，不漏篩每個(gè)孢子，分選速度和篩選效率得以提高。此外，利用固液結(jié)合的培養(yǎng)方法直接提高了單個(gè)金色鏈霉菌孢子的生長率，解決了單個(gè)孢子在液體培養(yǎng)基中生長困難的問題。
具體實(shí)施方式
培養(yǎng)基：
(1)固體培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖20g，進(jìn)口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，瓊脂18g。
(2)種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30g，進(jìn)口酵母粉5g，MgSO40.5g，(NH4)2SO43g，NaCl4g，KH2PO41g，CaCO30.2g。
(3)孔板發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30g，MgSO40.5g，CaCO30.33g，檸檬酸2.55g，(NH4)2SO43g，1mL混合液(0.3％CuSO4·5H2O、0.5％ZnSO4·7H2O、0.25％MnSO4`4H2O)。
熒光染料配制：稱取0.01g PI，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液定容至10mL。梯度稀釋至10μg/mL。4℃避光保存。
PI染料對金色鏈霉菌孢子染色：
取等體積金色鏈霉菌孢子懸液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色20min。
流式細(xì)胞儀檢測：
取染色后的金色鏈霉菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數(shù)，上流式細(xì)胞儀(MoFlo XDP)分析。根據(jù)染色劑發(fā)射熒光選擇合適通道檢測。所得數(shù)據(jù)用Summit 5.4軟件分析。
實(shí)施例1 ARTP誘變或其他誘變獲得不同活性孢子
出發(fā)菌株金色鏈霉菌斜面菌種在34℃條件下，培養(yǎng)4天，直至孢子成熟，斜面菌落呈鼠灰色。刮取適量成熟斜面孢子于裝有2mL PBS緩沖液的試管中，震蕩器震勻制成菌懸液后，無菌濾紙過濾。吸取10μL合適濃度的菌懸液均勻涂布于無菌的載片表面，將載片置于載臺上，用ARTP誘變儀進(jìn)行誘變。條件：入射功率為100W、氦氣流量為10SLM、分別照射一定時(shí)間獲得不同活性的孢子。分別照射一定時(shí)間獲得不同活性的孢子。其他物理、化學(xué)誘變也可獲得不同活性的孢子。
實(shí)施例2 PI染料對金色鏈霉菌孢子染色：
取樣品處理完畢，用無菌鑷子將載片放至裝有PBS(pH 7.4)緩沖溶液的EP管中，充分振蕩1min，將附著在載片上的菌體被徹底洗脫到液PBS中。濾紙過濾，5000×g離心5min，棄去上清，加入PBS重懸。重復(fù)此操作步驟2～3次，得到純凈的金色鏈霉菌孢子懸液。用PBS將純凈的金色鏈霉菌孢子懸液稀釋至濃度105～106個(gè)孢子/mL。等體積金色鏈霉菌孢子懸液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色孵育20min。
實(shí)施例3流式細(xì)胞儀檢測：
檢測要建立對照試驗(yàn)除去非特異性結(jié)合即背景。沒有標(biāo)記任何熒光素的樣品為陰性對照，代表細(xì)胞背景熒光信號。通過陰性對照調(diào)節(jié)基本電壓，設(shè)定陰性與陽性群體界限。將完全無活性，與PI染色劑結(jié)合的樣品設(shè)置為陽性對照，確定陰性與陽性孢子群體。固定條件后進(jìn)行樣品檢測。取染色后的金色鏈霉菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數(shù)，上流式細(xì)胞儀(MoFlo XDP)分析。根據(jù)PI發(fā)射紅色熒光波長，用FL3通道((610±15)nm)檢測。通過調(diào)節(jié)FSC、SSC、熒光通道坐標(biāo)參數(shù)，電壓以及閾值參數(shù)，首先初步獲得分析對象的群體位置。對群體位置大致設(shè)門，再次調(diào)節(jié)FSC、SSC閾值，電壓參數(shù)，將大部分的背景噪音去除。所得數(shù)據(jù)用Summit 5.4軟件分析。從軟件圖示中，可以看出，金色鏈霉菌無活性孢子被PI染色后，發(fā)出紅色熒光信號。由于PI不能透過活細(xì)胞細(xì)胞膜，有活性金色鏈霉菌孢子未能被染色，無熒光信號顯示。從而可以進(jìn)一步分選出有活性的金色鏈霉菌孢子。
實(shí)施例4金霉素顯色反應(yīng)
根據(jù)金霉素與釤離子的顯色反應(yīng)作為初篩方法。金霉素與釤離子在近中性條件下形成淺黃色配合物，在405nm處有最大光吸收?？紤]發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)基中含帶有顏色的原料對測定結(jié)果產(chǎn)生一定影響。用生產(chǎn)發(fā)酵液配方，同時(shí)在孔板中培養(yǎng)與未培養(yǎng)菌體。結(jié)果表明，未培養(yǎng)菌體發(fā)酵液也有一定的OD值，說明發(fā)酵液本身的顏色對OD值得測定確實(shí)存在影響，但培養(yǎng)菌體的發(fā)酵液OD值大于未培養(yǎng)菌體的發(fā)酵液，因此發(fā)酵液本身顏色干擾并不影響篩選金霉素高產(chǎn)菌株。配置濃度在0.5～20mg/L的金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次吸取20μL Tris-HCl緩沖溶液，60μL Sm(NO)3溶液，120μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液震蕩混勻，10min后顯色完全，酶標(biāo)儀測定各濃度的OD405值。確定OD405與金霉素濃度C(mg/L)的回歸方程：y＝0.0107x-0.006，R2＝0.99305。x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)，y為OD405nm，標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為0～360μg/mL。
實(shí)施例5高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)及篩選
經(jīng)過流式細(xì)胞儀直接將單個(gè)金色鏈霉菌孢子分選至96淺孔板中(培養(yǎng)基裝量180μL)。由于金色鏈霉菌孢子體積過小，直接在液體培養(yǎng)基中生長率只有15％左右。為解決此問題，對培養(yǎng)方案進(jìn)行改進(jìn)。待裝有50μL的96孔板固體培養(yǎng)基上長出可見孢子之后(約2～3d)，吸取種子培養(yǎng)液150μL于此孔板固體培養(yǎng)基上。在750r/min、30～32℃的孔板搖床上培養(yǎng)23～25h。經(jīng)此改進(jìn)后的培養(yǎng)方案，金色鏈霉菌在孔板固體培養(yǎng)基上生長率可達(dá)95％左右。以5％(v/v)的接種量，將96孔板中的種子液平行轉(zhuǎn)接至48孔板(裝有發(fā)酵培養(yǎng)液1000μL)中，750r/min，30～31℃發(fā)酵培養(yǎng)96～110h。剩余96孔板中的種子液用40％甘油保存于4℃冰箱。將48孔板獲得的菌體離心后，吸取上清適當(dāng)稀釋，吸取120μL稀釋液至96孔板(提前加入Tris-HCl緩沖溶液和釤溶液)，搖床震蕩混勻20min，顏色變?yōu)榈S色，利用酶標(biāo)儀測定OD405值，挑選出金霉素相對含量較高的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。
搖瓶復(fù)篩結(jié)果顯示，本發(fā)明方法準(zhǔn)確性很高，能夠從眾多孢子中篩選得到金霉素產(chǎn)量相對較高的菌株。
此外，發(fā)明人還對比了本發(fā)明的基于流式細(xì)胞術(shù)與孔板高通量篩選的方法，和傳統(tǒng)誘變與孔板高通量篩選直接結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法篩選效果極好，不會漏篩具有活性的孢子，分選速度和篩選效率顯著提高。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。