本發明涉及宏基因組檢測領域，具體地說是一種宏基因組DNA的提取方法。
背景技術：
：宏基因組(Meta-genome)，又稱為元基因組，是指特定環境中全部微生物遺傳物質的總和。它通過直接從環境樣品中提取全部微生物的DNA，構建宏基因組文庫，利用基因組學的研究策略研究環境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。動物腸道、體液及其他組織中微生物的種類及豐度極大影響著宿主自身生存狀態。例如人體腸道內寄生著10萬億個細菌，它們能影響體重和消化能力、抵御感染和降低自體免疫疾病的患病風險，還能控制人體對癌癥治療藥物的反應。一旦腸道菌群失調，就會產生一系列疾病。因此，動物體內微生物多樣性的研究對動物健康研究至關重要。隨著高通量測序技術的興起以及測序成本的進一步降低，通過DNA測序的方法對微生物多樣性進行研究也逐漸成為可能。然而，99％的腸道細菌群都不能通過傳統方法培養，也就不能通過傳統的基因組學方法獲取它們的基因信息。宏基因組學技術(Metagenomics)，為我們提供了充分分析動物體內微生物多樣性的手段，該技術不需要對菌群進行傳統培養，而是直接測序腸道樣品中的全部DNA。這種技術測序所得到的不是一種細菌的完整基因，而是動物體內所有菌群的混雜基因，其中大量是以前無法認識的菌種。對于宏基因組學而言，宏基因組DNA的提取效率是影響實驗成功與否的關鍵步驟。目前提取宏基因組DNA時，一般需要利用裂解液、溶菌酶、蛋白酶K等裂解細胞，然后用玻璃珠進行震蕩破壁，再利用酚/氯仿抽提，最后經過乙醇沉淀或者磁珠吸附得到宏基因組DNA。然而相對于宿主DNA，其他微生物菌群DNA的含量一般較少，宿主DNA一方面會大大影響微生物菌群DNA的提取效率，另一方面測序結果中摻入大量宿主DNA的干擾數據，會增加后續信息分析的處理難度，影響分析結果。為了解決該技術問題，公開日為2013年4月24日，公開號為CN103060309A的中國專利《宏基因組提取方法》公開了一種宏基因組提取方法，該方法利用探針雜交磁珠捕獲方式降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA的影響，但是該方法步驟復雜，需要預先進行雜交處理，再通過磁珠捕獲的方式去除宿主DNA，提高了成本與實驗難度。公開日為2016年4月27日，公開號為CN105525033A的中國專利《檢測血液中微生物的方法及裝置》公開了一種檢測血漿中微生物的方法，該方法先對血液中DNA進行測序，然后去除宿主測序數據，雖然可以去除宿主DNA的干擾，但是測序數據量大，后續信息分析難度大，并且沒有從根本上提高宏基因組DNA的提取效率，提取的核酸DNA仍然包括宿主DNA。公開日為2015年5月20日，公開號為CN104630203A的中國專利《制備昆蟲腸道菌群DNA的方法》公開了一種制備昆蟲腸道菌群DNA的方法，該方法通過分離出完整的腸道，單獨對腸道進行處理獲得其內容物來去除宿主DNA。但是這一方法僅能去除腸道外部包裹的昆蟲組織DNA，對于存在于腸道內部的宿主細胞無法去除。后續在DNA提取階段會將這些宿主游離的DNA及小塊組織部分一起抽提，得到的仍然是微生物菌群DNA和昆蟲DNA的混合物。技術實現要素：本發明的主要目的是針對現有技術存在的不足提供一種宏基因組DNA的提取方法，該提取方法可以減小宿主DNA的背景干擾。一方面，本發明是通過如下技術方案實現的：一種宏基因組DNA的提取方法，所述提取方法包括如下步驟：先向待測樣品中加入緩沖液和蛋白酶K得到混合液，對混合液加熱使蛋白酶K裂解待測樣品中的宿主細胞，然后進一步加熱使蛋白酶K失活，再經過擊打使微生物破壁后，進行DNA提取得到所述宏基因組DNA。優選的，在55～65℃下加熱10～30min使蛋白酶K裂解宿主細胞。優選的，在80～95℃下加熱10～20min使蛋白酶K失活。作為公知技術，蛋白酶K在適當的溫度下可以裂解宿主細胞，蛋白酶K在適當的溫度下可以降解宿主細胞膜蛋白等蛋白質，裂解宿主細胞，使宿主DNA充分游離。并且當溫度進一步提高時，高溫可以使蛋白酶K失活。具體的溫度和加熱時間可以根據待測樣品的種類經過實驗確定，一般選擇在55～65℃下加熱10～30min使蛋白酶K裂解宿主細胞，在80～95℃下加熱10～20min使蛋白酶K失活。更優選的，蛋白酶K的工作濃度為50～100μg/mL。添加的蛋白酶K濃度可以根據常規選擇，一般為10～20mg/mL，根據需要向待測樣品中加入蛋白酶K后，使蛋白酶K的工作濃度在50～100μg/mL即可。更優選的，所述緩沖液為DNA裂解液。緩沖液的主要作用是為了給蛋白酶K提供工作環境，因此緩沖液的加入量可以按照本領域常規的提取宏基因組DNA的方法進行。例如利用試劑盒進行DNA提取。按照試劑盒說明書選擇具體的緩沖液以及加入量即可，一般為每0.2～0.5g待測樣品中加入0.8mLDNA裂解液。所述擊打使微生物破壁的過程也可按照試劑盒說明書進行，例如磁珠擊打(beadsbeating)，本發明優選為根據試劑盒說明書在每0.2～0.5g待測樣品中加入500mg玻璃珠(glassbeads)。更進一步的，本發明優選的，所述宏基因組DNA的提取利用Mag-BindSoilDNAKit進行。優選的，所述宿主包括人或動物。優選的，所述待測樣品包括體液或糞便。優選的，所述體液包括血液、血清、血漿或唾液。優選的，所述待測樣品包括離體的組織樣本。本發明利用宿主的細胞沒有細胞壁，而細菌微生物則有細胞壁的原理，先加入緩沖液懸浮宿主細胞，然后加入蛋白酶K使宿主細胞的蛋白質降解，宿主細胞裂解，宿主DNA充分游離。由于沒有溶菌酶及外力作用，細菌微生物能夠保持完整形態。在擊打過程中，比如磁珠擊打(beadsbeating)使微生物破除細胞壁的過程中，一方面細菌微生物被外力作用破壁，另一方面宿主DNA被打斷成小片段甚至降解，因此最后按照常規方法提取宏基因組DNA，就可以減少宿主DNA的背景干擾。并且在后續的磁珠提取宏基因組DNA時，磁珠會優先結合大片段的宏基因組DNA，進一步減少宿主DNA的背景干擾。本發明方法簡單，僅需在常規的宏基因組DNA提取方法的基礎上加上兩步加熱處理步驟即可達到基本去除宿主DNA干擾的效果，時間短、成本低，具有很強的實用性。附圖說明圖1為糞便樣品的宏基因組DNA的2％瓊脂糖凝膠電泳檢測膠圖。具體實施方式以下通過具體實施例來進一步說明本發明：下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。以下實施例用于宏基因組DNA提取的試劑盒為OMEGA公司的Mag-BindSoilDNAKit。以下實施例用于宏基因組DNA建庫的試劑盒為NEXTflexTMRapidDNASequencingKit。實施例1糞便樣品的宏基因組DNA提取取兩個干凈的5ml離心管，稱取1號和2號兩個不同的糞便樣品各1g于離心管中，向兩管中分別加入1.6ml緩沖液BufferSLXMlus后震蕩混合均勻。分別稱取500mgglassbeads置于編號為A、B、C、D的4個2mL離心管中，然后分別向編號為A和B的離心管中加入5μL濃度為10mg/mL的蛋白酶K。再將1號糞便樣品分別取1mL加入編號為A、C的離心管中，2號糞便樣品分別取1mL加入編號為B、D的離心管中。編號為A、B、C、D的離心管(以下簡稱A管、B管、C管和D管)中成分如表1所示：ABCD糞便樣品1212緩沖液1.6mL1.6mL1.6mL1.6mL蛋白酶K5μL5μL00glassbeads500mg500mg500mg500mg表1編號為A、B、C、D的離心管中成分將編號為C、D的離心管按照試劑盒Mag-BindSoilDNAKit的說明書操作提取宏基因組DNA，將含有宏基因組DNA的溶液置于相應的編號為C、D的離心管中。將編號為A、B的離心管在65℃下加熱10min使蛋白酶K裂解宿主細胞之后，再在95℃下加熱10min使蛋白酶K失活。然后再按照試劑盒Mag-BindSoilDNAKit的說明書提取宏基因組DNA，將含有宏基因組DNA的溶液置于相應的編號為A、B的離心管中。分別取上述含有宏基因組DNA的溶液進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測的膠圖如圖1所示，從左到右依次為宿主DNA、A管得到的宏基因組DNA、B管得到的宏基因組DNA、C管得到的宏基因組DNA、D管得到的宏基因組DNA，所述宿主DNA即人的DNA。從圖1可以看出，宏基因組DNA含有較多種類的微生物DNA。經過本發明方法處理后的A、B管得到的宏基因組DNA基本能夠去除宿主DNA，而沒有經過本發明方法處理后的C、D管得到的宏基因組DNA則明顯含有宿主DNA。對上述提取的A-D管的宏基因組DNA用TBS-380熒光計進行定量檢測，結果如表2所示，均達到DNA文庫構建的要求。樣品編號ABCD濃度(ng/μL)16.4616.5819.0427.07總量(ng)8238299521353.5體積(μL)50505050表2宏基因組DNA的濃度對以上提取的A-D管的宏基因組DNA分別進行pair-end300文庫構建，然后使用Hiseq2500平臺對以上4個構建后的文庫進行測序，分析結果如表3所示：編號ABCDtotalreads248258263452260032283587Homoreads231117Homoreads比例0.0008％0.0011％0.0042％0.006％表3實施例1的宏基因組DNA測序結果從表3可以看出，沒有經過本發明方法處理的C、D管得到的宏基因組DNA中含有宿主DNA的量是經過本發明方法處理后的A、B管得到的宏基因組DNA中含有宿主DNA量的5倍以上。實施例2血液樣品的宏基因組DNA提取分別取兩個不同的血液樣品按照實施例1的方法進行宏基因組DNA的提取。其中A、B管中的血液樣品加入5μL濃度為15mg/mL的蛋白酶K，在60℃下加熱20min使蛋白酶K裂解宿主細胞之后，再在80℃下加熱20min使蛋白酶K失活，然后再按照試劑盒說明書操作步驟提取宏基因組DNA。而C、D管中的血液樣品直接按照試劑盒說明書操作步驟提取宏基因組DNA。將以上來自血液樣品的宏基因組DNA進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的膠圖與圖1類似。然后再進行文庫構建以及測序分析，結果如表4所示，沒有經過蛋白酶K加熱處理后的宏基因組DNA中宿主DNA的含量為經過蛋白酶K加熱處理后的6倍左右。編號ABCDtotalreads308258293452290032303587Homoreads332017Homoreads比例0.001％0.001％0.0059％0.0056％表4實施例2的宏基因組DNA測序結果實施例3組織樣品的宏基因組DNA提取分別取兩個不同人的腸道組織樣品，按照實施例1的方法進行宏基因組DNA的提取。其中A、B管中的腸道組織樣品加入5μL濃度為20mg/mL的蛋白酶K，在55℃下加熱30min使蛋白酶K裂解宿主細胞之后，再在90℃下加熱15min使蛋白酶K失活，然后再按照試劑盒說明書操作步驟提取宏基因組DNA。而C、D管中的腸道組織樣品直接按照試劑盒說明書操作步驟提取宏基因組DNA。將以上來自腸道組織樣品的宏基因組DNA進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的膠圖與圖1類似。然后再進行文庫構建以及測序分析，結果如表5所示，沒有經過蛋白酶K加熱處理后的宏基因組DNA中宿主DNA的含量為經過蛋白酶K加熱處理后的5～10倍。編號ABCDtotalreads228258233452210032223587Homoreads311513Homoreads比例0.0013％0.0004％0.0071％0.0058％表5實施例3的宏基因組DNA測序結果通過以上實施例可以看出，經過本發明的蛋白酶K加熱處理后的宏基因組DNA中宿主DNA干擾大大降低。對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明實施例原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明實施例的保護范圍。當前第1頁1 2 3