本發(fā)明涉及一種基于流式細胞術(shù)的高通量篩選高產(chǎn)泰樂菌素菌株的方法，屬于高通量篩選技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
泰樂菌素(Tylosin)又稱泰樂星、泰勒霉素，是一種16元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它是一種禽、畜專用的高效無殘留的抗菌促生劑，廣泛應(yīng)用于飼料、獸藥添加劑。泰勒菌素工業(yè)生產(chǎn)菌為弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)。泰樂菌素主要是由泰樂菌素A、脫碳霉糖泰樂菌素B、大菌素C和雷洛菌素D四種組分組成，其中A組分具有最強的生物活性。泰勒菌素生物合成過程十分復(fù)雜，具體明確的生物合成途徑尚未闡明。通過分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)，改造泰樂菌素的生物合成基因簇仍在不斷探索之中?；诳股剡z傳背景的分子育種手段過程復(fù)雜，費用大，成功率低。對于泰樂菌素的工業(yè)化生產(chǎn)，出發(fā)菌株必須滿足一定的優(yōu)良特性。經(jīng)典誘變使用理化方法誘導(dǎo)DNA突變，方法簡單，適用范圍廣。高通量篩選技術(shù)結(jié)合經(jīng)典誘變簡化篩選過程，提高了篩選效率。
目前的經(jīng)典誘變結(jié)合高通量篩選方法，由于經(jīng)典誘變會存在大量死細胞而可能導(dǎo)致后續(xù)可培養(yǎng)無法實現(xiàn)，同時經(jīng)典誘變后的菌株要進一步分離純化、擴大培養(yǎng)之后才能進行后續(xù)酶標板等高通量篩選而存在篩選周期長、前期工作量大等問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明聯(lián)合經(jīng)典誘變、流式細胞術(shù)、高通量孔板篩選、固液聯(lián)合培養(yǎng)，提供了一種基于流式細胞術(shù)的高通量篩選泰樂菌素高產(chǎn)菌株的方法。本發(fā)明基于流式細胞術(shù)對泰樂菌素高通量篩選，可在短時間內(nèi)對大量有效菌株進行分析，從而分選目的活孢子，進而進行高通量培養(yǎng)檢測。
本發(fā)明的基于流式細胞術(shù)的高通量篩選泰樂菌素高產(chǎn)菌株的方法，主要包括步驟如下：
(1)獲得弗氏鏈霉菌的多個含量死孢子在內(nèi)的待篩選的孢子；
(2)利用PI染料對步驟(1)的待篩選的孢子進行染色；
(3)使用流式細胞儀檢測孢子活性；
(4)利用流式細胞儀分選有活性孢子，直接將單個有活性的孢子分選到裝有固體培養(yǎng)基的高通量孔板中；
(5)待高通量孔板的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5天，直接添加液體種子培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)得到種子液；將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的新的高通量孔板中，發(fā)酵培養(yǎng)；
(6)配置一定濃度梯度的泰樂菌素標準品，用酶標儀檢測，得到泰樂菌素與290nm下的吸光值OD的關(guān)系；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵液上清，在合適的濃度下用酶標儀測定290nm下的吸光值OD，進而得知待篩選菌株產(chǎn)泰樂菌素含量的相對高低；
(7)選取上一步得到的泰樂菌素含量相對較高的菌株多株，進行復(fù)篩。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選孢子可以是不同活性的孢子，包括死孢子。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選孢子是將弗氏鏈霉菌進行誘變后得到的。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(1)的待篩選的孢子中，死孢子含量達90％以上，優(yōu)選地達95％以上更優(yōu)選地達99％以上。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘變，可以是物理誘變或者化學(xué)誘變，比如常壓室溫等離子體(ARTP)誘變、紫外誘變、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變、亞硝基胍(NTG)誘變、硫酸二乙酯(DES)誘變等等。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)的染色，具體是：將待篩選的孢子調(diào)整至濃度105～106個孢子/mL的懸浮液，將等體積懸浮液與10μg/mL PI染色劑混合，避光放置4℃冰箱孵育20min。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(3)和步驟(4)具體是：以沒有標記任何熒光素的樣品為陰性對照、將完全無活性的與PI染色劑結(jié)合的樣品設(shè)置為陽性對照，確定陰性與陽性孢子群體；取染色后的弗氏鏈霉菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數(shù)，上流式細胞儀分析，用FL3通道((610±15)nm)檢測，以FCS-Width為橫坐標，SSC-Log-Height為縱坐標，SSC閾值為0.02，熒光通道電壓為500，將無熒光區(qū)域最集中部分設(shè)門分選至裝有固體培養(yǎng)基的高通量孔板中，每孔分選設(shè)定為單個孢子。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(4)中，裝有固體培養(yǎng)基的高通量孔板中固體培養(yǎng)基的體積為50μL/孔。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(5)中，是培養(yǎng)至長出可見孢子后添加液體種子培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(5)中液體種子培養(yǎng)基的添加量為150μL/孔。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(5)中發(fā)酵培養(yǎng)液的添加量為900μL/孔。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(6)，在線性濃度范圍內(nèi)，目標物濃度越大，OD值越大。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(6)的一定濃度梯度是指0～330μg/mL。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(6)，是繪制泰樂菌素與290nm下的吸光值OD的標準曲線；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵上清液用HCl稀釋至合適濃度，測定290nm下的吸光值OD，將吸光值OD代入標準曲線，得到相應(yīng)的泰樂菌素含量。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述高通量孔板可以是96深孔板、96淺孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一種具有高通量篩選作用的培養(yǎng)器皿。優(yōu)選地，裝有固體培養(yǎng)基的高通量孔板為96淺孔板，裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的高通量孔板為48深孔板。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明方法結(jié)合了常壓室溫等離子體(ARTP)、PI染色法、流式細胞術(shù)分析分選法、酶標儀檢測、固液結(jié)合的培養(yǎng)方法和高通量篩選技術(shù)，對分選有活性弗氏鏈霉菌孢子培養(yǎng)提供了一種精確快速的方法。本發(fā)明方法基于流式細胞儀能夠在短時間內(nèi)對單孢子檢測，從而建立龐大的分析目標群體，流式細胞術(shù)高通量的分選培養(yǎng)減少了在平板上生長的過程，不漏篩每個孢子，分選速度和篩選效率得以提高。此外，利用固液結(jié)合的培養(yǎng)方法直接提高了單個弗氏鏈霉菌孢子的生長率，解決了單個孢子在液體培養(yǎng)基中生長困難的問題。
具體實施方式
培養(yǎng)基：
(1)固體培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖10g，大豆蛋白胨1g，酵母粉1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 1g，瓊脂20g，pH調(diào)節(jié)至7.2。
(2)種子培養(yǎng)基(g/L)：豆餅粉5g，酵母粉5g，玉米漿6g，輕質(zhì)CaCO33g，豆油4mL，pH調(diào)節(jié)至7.18。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：魚粉10.5g，玉米粉17g，玉米淀粉10.5g，甜菜堿0.37g，NaCl 0.1g，KCl 0.9g，(NH4)2HPO 4g，NiSO43g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCO31.9g。
熒光染料配制：稱取0.01g PI，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液定容至10mL。梯度稀釋至10μg/mL。4℃避光保存。
PI染料對弗氏鏈霉菌孢子染色：
取等體積弗氏鏈霉菌孢子懸液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色20min。
流式細胞儀檢測：
取染色后的弗氏鏈霉菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數(shù)，上流式細胞儀(MoFlo XDP)分析。根據(jù)染色劑發(fā)射熒光選擇合適通道檢測。所得數(shù)據(jù)用Summit 5.4軟件分析。
實施例1 ARTP或其他物理、化學(xué)誘變獲得不同活性孢子：
出發(fā)菌株弗氏鏈霉菌斜面菌種在29℃條件下，培養(yǎng)6天，直至孢子成熟，斜面菌落乳白色。刮取適量成熟斜面孢子于裝有2mL PBS緩沖液的試管中，震蕩器震勻制成菌懸液后，無菌濾紙過濾。吸取10μL合適濃度的菌懸液均勻涂布于無菌的載片表面，將載片置于載臺上，用ARTP誘變儀進行誘變。條件：入射功率為100W、氦氣流量為10SLM、分別照射一定時間獲得不同活性的孢子。其他物理、化學(xué)誘變也可獲得不同活性的孢子。
實施例2 PI染料對弗氏鏈霉菌孢子染色：
樣品誘變處理完畢后，用無菌鑷子將載片放至裝有PBS(pH 7.4)緩沖溶液的EP管中，充分振蕩1min，將附著在載片上的菌體被徹底洗脫到液PBS中。濾紙過濾，5000×g離心5min，棄去上清，加入PBS重懸。重復(fù)此操作步驟2～3次，得到純凈的弗氏鏈霉菌孢子懸液。用PBS將純凈的弗氏鏈霉菌孢子懸液稀釋至濃度105～106個孢子/mL。取等體積弗氏鏈霉菌孢子懸液和10μg/mLPI染料混合，放置4℃冰箱避光孵育20min。
實施例3 流式細胞儀檢測與分選：
檢測要建立對照試驗除去非特異性結(jié)合即背景。沒有標記任何熒光素的樣品為陰性對照，代表細胞背景熒光信號。通過陰性對照調(diào)節(jié)基本電壓，設(shè)定陰性與陽性群體界限。將完全無活性，與PI染色劑結(jié)合的樣品設(shè)置為陽性對照，確定陰性與陽性孢子群體。固定條件后進行樣品檢測。取染色后的弗氏鏈霉菌孢子懸浮液，重新過濾，稀釋一定倍數(shù)，上流式細胞儀(MoFlo XDP)分析。所得數(shù)據(jù)用Summit 5.4軟件分析。根據(jù)PI發(fā)射紅色熒光波長，用FL3通道((610±15)nm)檢測。通過調(diào)節(jié)FSC、SSC、熒光通道坐標參數(shù)，電壓以及閾值參數(shù)，首先初步獲得分析對象的群體位置。對群體位置大致設(shè)門，再次調(diào)節(jié)FSC、SSC閾值，電壓參數(shù)，將大部分的背景噪音去除。最終確定以FCS-Width為橫坐標，SSC-Log-Height為縱坐標，SSC閾值為0.02，熒光通道電壓為500為最佳分析參數(shù)。從軟件圖示中，可以看出，由于PI不能透過活細胞細胞膜，有活性弗氏鏈霉菌孢子未能被染色，無熒光信號顯示。弗氏鏈霉菌無活性孢子被PI染色后，發(fā)出紅色熒光信號。從而可以進一步分選出有活性的弗氏鏈霉菌孢子。將無熒光區(qū)域最集中部分設(shè)門分選至96孔板固體培養(yǎng)基中(每孔50μL)。每孔分選設(shè)定為單個孢子。
實施例4 酶標儀檢測
根據(jù)泰勒菌素在290nm處有最大光吸收這一特點，選擇酶標儀檢測泰樂菌素OD值作為初篩方法。配置一定濃度梯度的標準品，用酶標儀檢測，制得標準曲線方程y＝0.0116x+0.0414，R2＝0.9998。x為標準品濃度(μg/mL)，y為OD290nm，標準品濃度范圍為0～330μg/mL。裝有培養(yǎng)液48孔板4000r/min離心15min，取上清用0.1mol/L HCl稀釋一定倍數(shù)，取200μL稀釋液于96酶標板，用酶標儀測定290nm可見光下的吸光值OD。
實施例5 高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)及篩選
經(jīng)過流式細胞儀直接將單個弗氏鏈霉菌孢子分選至96淺孔板中(培養(yǎng)基裝量180μL)。由于弗氏鏈霉菌孢子體積過小，直接在液體培養(yǎng)基中生長率只有15％左右。為解決此問題，對培養(yǎng)方案進行改進。待裝有50μL的96孔板固體培養(yǎng)基上長出可見孢子之后(約4～5d)，吸取種子培養(yǎng)液150μL于此孔板固體培養(yǎng)基上。種子培養(yǎng)液在750r/min，29℃的孔板搖床上培養(yǎng)2d。經(jīng)此改進后的培養(yǎng)方案，弗氏鏈霉菌在孔板固體培養(yǎng)基上生長率可達93％左右。以5％(v/v)的接種量，將96孔板中的種子液平行轉(zhuǎn)接至48孔板(裝有發(fā)酵培養(yǎng)液900μL)中，750r/min，29℃發(fā)酵培養(yǎng)6d。剩余96孔板中的種子液用40％甘油保存于4℃冰箱。利用酶標儀高通量初篩檢測。整個過程中以出發(fā)菌株作為對照，根據(jù)與對照菌株OD值的比較，選擇誘變效果明顯的誘變菌株進行搖瓶復(fù)篩實驗。
搖瓶復(fù)篩結(jié)果顯示，本發(fā)明方法準確性很高，能夠從眾多孢子中篩選得到泰勒菌素產(chǎn)量相對較高的菌株。
此外，發(fā)明人還對比了本發(fā)明的基于流式細胞術(shù)與孔板高通量篩選的方法，和傳統(tǒng)誘變與孔板高通量篩選直接結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法篩選效果極好，不會漏篩具有活性的孢子，分選速度和篩選效率顯著提高。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。