黃色蠕形霉Y28及其在防治果樹腐爛病中的應用的制作方法

本發明涉及微生物學及生物防治技術領域，具體地說，涉及黃色蠕形霉Y28及其在防治果樹腐爛病中的應用。

背景技術：

梨樹為我國的第三大果樹品種，梨產業的健康發展，不僅對我國農業生產和農民增收發揮著重要作用，而且對世界梨果生產也具有舉足輕重的影響。

梨樹腐爛病的病原菌為梨樹腐爛病菌，屬于子囊菌亞門真菌，蘋果黑腐皮殼梨變種(Valsapyri)，病原的形態與蘋果樹腐爛病菌相似。梨樹腐爛病在我國梨各主產區均有發生，以新疆、西北、華北等地發生較重。據調查，新疆庫爾勒香梨病株率達50％-80％，西北地區酥梨病株率達30％-50％；華北地區鴨梨、雪花梨發病株率均達30％以上。腐爛病具有發生區域廣、發病率高、難以控制等特點，發病嚴重的梨園，樹體病疤累累、枝干殘缺不全，甚至造成大量死樹或毀園，嚴重威脅到我國梨產業的健康發展。

以往梨樹腐爛病的防治主要依賴于福美胂等藥劑，而福美胂現已明令禁止在果樹上使用。同時，化學殺菌劑由于易使病菌產生抗藥性以及消費者對于人類健康、環境污染和農產品化學藥劑殘留等問題的日益關注而受到限制，因此急需尋找一種新型、安全、無毒的方法或手段替代化學殺菌劑來防治梨樹腐爛病。生物防治作為一種安全無毒的防腐手段引起科學家的廣泛關注，在過去近三十年里，國內外研究者已經篩選出許多對病菌具有明顯抑菌效果的細菌、酵母菌和小型絲狀真菌，部分已獲批作為生物殺菌劑應用于生產，如蘇云金芽孢桿菌(Bt)、“Nexy”(C.olephila strain O)等。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種具有生防效果的內生真菌--黃色蠕形霉Y28。

本發明的另一目的是提供菌株Y28在防治果樹腐爛病中的應用。

根據ZL201410079119.2公開的梨樹品種資源抗腐爛病快速鑒定方法，利用該方法可快速、簡便、高效的鑒定梨樹不同品種資源對腐爛病的抗性。通過篩選發現‘圓黃’梨、‘秋白’、‘滿園香’、‘綠句句’和‘路易斯’等梨品種對梨腐爛病具有高抗的特點。進一步通過對各梨樹品種中的內生菌進行分離和抗腐爛病篩選，從中獲得一株對梨樹腐爛病具有良好防治效果的內生真菌Y28。

菌株Y28的微生物學特征見表1。

表1 菌株Y28不同結構的形狀及大小

菌株Y28的理化特征如下：

1、溫度對菌株Y28菌絲生長及產孢的影響

菌株Y28在3℃-35℃下均能生長，菌絲在30℃擴展最快，菌落日擴展0.4cm-0.5cm。10℃下菌絲雖能生長，但極難形成孢子；在20℃-30℃下菌落表面都可同時產生兩類孢子，偶而只產生子囊孢子，35℃下菌落表面多為灰綠色分生孢子，零星產生一些黃色小點即閉囊殼。說明溫度不僅影響菌絲生長，同時對有性繁殖和無性繁殖也產生影響。

2、pH值對菌株Y28菌絲生長及產孢的影響

菌株Y28菌絲在pH 2-10的基質上均能生長，最適pH值為4，在此環境下，菌落日擴展0.6cm-0.7cm。菌株Y28喜酸性環境，符合真菌的一般特性。在pH 4-7時均可形成兩類孢子，pH值為2或10時，不形成任何類型的孢子。因此，菌株Y28菌絲生長及孢子產生均受到基質酸堿度的影響。

菌株Y28的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，將其ITS序列在GenBank中進行比對，并構建菌株Y28的系統進化樹(圖3)。

基于以上信息，將菌株Y28鑒定為黃色蠕形霉(Talaromyces flavus)。該菌現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC No.11918，保藏日期2016年2月1日。

本發明還提供黃色蠕形霉Y28在防治果樹腐爛病中的應用，特別是防治由腐爛病菌(Valsapyri HB1)所致梨樹腐爛病中的應用。

本發明所述果樹包括梨樹和蘋果樹等，優選梨樹。

前述的應用，其是將黃色蠕形霉Y28的菌絲體、菌餅、發酵液或孢子懸液接種至果樹的根、莖、枝條、葉片上，進行腐爛病的生物防治。

本發明還提供黃色蠕形霉Y28在制備果樹腐爛病的生防菌劑中的應用。

本發明還提供由黃色蠕形霉Y28制備的果樹腐爛病的(復合)生防菌劑，其活性成分為黃色蠕形霉Y28的發酵液、菌體裂解液或孢子懸液。

本發明進一步提供黃色蠕形霉Y28的培養方法：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：馬鈴薯浸粉6.0g/L；葡萄糖20.0g/L；瓊脂20.0g/L。

培養條件：控制pH值5.6；溫度：25℃；濕度：15％-50％，避光培養。

本發明還提供黃色蠕形霉Y28的發酵方法：

將已在PDA平板上培養4天的Y28菌絲挑取適量接種于PDB培養基中振蕩培養。培養條件為：轉速：180r/min；溫度：25℃；濕度：15％-50％，避光培養。

本發明還提供由所述黃色蠕形霉Y28制備的復合微生物菌劑。

本發明以高抗腐爛病的梨樹品種為材料，從梨樹葉片和枝條分離、純化得到內生真菌，獲得具有良好抗腐爛病效果的生防菌，為制備生物殺菌劑提供寶貴資源。通過具有生防效果的內生真菌的篩選和應用來替代原有的化學殺菌劑，以減少化學殺菌劑對環境和果品的不利影響，為綠色梨果生產奠定基礎。

試驗表明，本發明的菌株Y28在真菌離體對峙抑菌試驗中抑菌率達70.50％，在一年生枝條離體復篩試驗中抑菌率達55.54％，是較好的防治梨樹腐爛病的生防菌株。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中梨樹腐爛病內生拮抗菌的初篩結果。其中，A為對照，B為菌株Y28，1-4分別表示培養1-4天的菌絲生長情況。

圖2為本發明實施例1中梨樹腐爛病內生拮抗菌的復篩結果。其中，A為對照，B為菌株Y28，左圖表示未剝皮的接種情況，右圖表示已剝皮的接種情況。

圖3為根據菌株Y28的ITS測序結果構建的系統進化樹。

圖4為本發明實施例2中利用菌株Y28孢子懸液田間處理梨樹腐爛病刮治后傷口的愈合情況。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。

實施例1 內生真菌Y28的篩選與鑒定

1.內生真菌Y28的分離、純化及篩選

1.1葉片與枝條(各50個樣品)內生真菌的分離

將采集的樣品(樣品來自安徽省合肥市國家林業創新基地合肥高新技術農業園果樹實習基地‘秋白’等梨品種)先用流動的自來水沖洗去除表面雜質，再在超凈工作臺內進行表面消毒:用無菌水沖洗表面，無菌濾紙吸去水分，將組織于15％次氯酸鈉溶液中浸泡5～10s后用無菌水沖洗3次。將消毒后的組織用解剖刀切至植物組織內部，并將內部組織割成約5mm×5mm的小方塊，放置在無菌的PDA上培養并編號。

1.2內生真菌的純化

將接種后的培養基置于25℃恒溫培養箱內培養3～7天，待組織周圍長出菌落后，采用菌絲尖端挑取法，根據菌落形態、顏色、長出時間的先后，及時挑取材料周圍菌絲轉接于新鮮培養基上進行培養，反復純化后轉接于PDA斜面上，4℃保存備用。同時將表面消毒后而不做切割的材料在培養基上做組織印跡，作為對照以檢查消毒效果。

1.3梨樹腐爛病內生拮抗菌初篩—離體對峙實驗

采用離體對峙培養法，篩選生防菌。將直徑6mm活化的腐爛病菌(Valsapyri HB1)菌餅置于距PDA平板邊緣25mm處，于同一水平線距平板邊緣25mm處接相同直徑的生防菌菌餅，每個菌株重復3次。置于25℃培養箱培養，觀察并記錄結果。

1.4梨樹腐爛病內生拮抗菌復篩—一年生枝條離體組織復篩

選取45根長度為30cm生長勢一致的一年生健康枝條，將枝條依次用用清水和純水清洗一遍后浸泡于15％次氯酸鈉溶液5～10s，再用無菌水沖洗3次后用手術刀在枝條上切長寬均約6mm的三個小孔，每孔間距約2cm。打孔處盡量避免節間。45根枝條分15組，每組3根枝條，為3次重復，在上、下2孔中分別接種直徑為6mm的生防菌菌餅，中間接相同直徑的腐爛病菌餅。保濕培養一周，發病后測量并記錄每根枝條的病斑直徑。

初篩的實驗結果見表2和圖1，結果表明在離體對峙抑菌率中，F2的抑菌效果最好，高達77.5％，其次是Y28，其抑菌率達到70.50％。

復篩的實驗結果見表3和圖2，結果表明在初篩中抑菌效果最好的F2菌株在復篩中其抑菌率僅為43.67％，而復篩抑菌效果最好的f7-2菌株(抑菌率高達74.05％)，在初篩中并沒有明顯的抑菌作用，且Y28菌株的復篩抑菌率達到55.54％。綜上，Y28菌株較好的防治梨樹腐爛病的生防菌株。

表2 有效真菌離體對峙抑菌率

表3 一年生枝條離體復篩

2.菌株Y28的鑒定

2.1ITS序列鑒定

菌株Y28的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，將其ITS序列在GenBank中進行比對，并構建菌株Y28的系統進化樹(圖3)。

2.2菌株Y28的微生物學特征

表1 菌株Y28不同結構的形狀及大小

2.3菌株Y28的理化特征如下：

2.3.1溫度對菌株Y28菌絲生長及產孢的影響

菌株Y28在3℃-35℃下均能生長，菌絲在30℃擴展最快，菌落日擴展0.4cm-0.5cm。10℃下菌絲雖能生長，但極難形成孢子；在20℃-30℃下菌落表面都可同時產生兩類孢子，偶而只產生子囊孢子，35℃下菌落表面多為灰綠色分生孢子，零星產生一些黃色小點即閉囊殼。說明溫度不僅影響菌絲生長，同時對有性繁殖和無性繁殖也產生影響。

2.3.2pH值對菌株Y28菌絲生長及產孢的影響

菌株Y28菌絲在pH 2-10的基質上均能生長，最適pH值為4，在此環境下，菌落日擴展0.6cm-0.7cm。菌株Y28喜酸性環境，符合真菌的一般特性。在pH 4-7時均可形成兩類孢子，pH值為2或10時，不形成任何類型的孢子。因此，菌株Y28菌絲生長及孢子產生均受到基質酸堿度的影響。

基于以上信息，將內生真菌Y28菌株鑒定為黃色蠕形霉(Talaromycesflavus)。

韋善君等在《黃色蠕形霉對棉花上幾種病原菌拮抗作用的研究》中表明黃色蠕形霉對棉花大麗輪枝菌、刺盤孢菌的菌絲生長及分生孢子萌發和對棉立枯絲核菌、棉枯萎尖孢鐮刀菌的菌絲生長均有明顯的抑制作用(1999)，Zhao等在《Fungal colonization of Pu-erhtea in Yunnan》中也從茶樣中分離到踝節菌屬(2010)，羅惠波等在《濃香型大曲中可培養真菌的分離鑒定與系統發育學分析》中報道踝節菌屬占濃香型大曲內真菌的2.90％(2013)，何斐等在《核桃林下魔芋根區土壤微生物區系研究》中報道林下土壤優勢微生物放射型根瘤菌之一的黃色蠕形霉數量和比例較林外不同程度增加(2014)，張丹等在《中國南海海綿和珊瑚共附生真菌多樣性及其抑菌活性研究》中同樣分離出了踝節菌屬(2015)。綜上，目前沒有發現關于踝節菌屬黃色蠕形霉危及人類健康或動、植物病原或污染環境的報道。

實施例2 菌株Y28在防治梨樹腐爛病方面的應用

收集菌株Y28的子囊孢子利用無菌水配制濃度為10⁸CFU/mL的孢子懸液，將配制好的孢子懸液涂布于已徹底刮除的腐爛病傷口處，刮除面積超過病斑0.5cm-1.0cm，然后涂抹孢子懸浮液。結果表明，涂布孢子懸液的腐爛病病疤愈合良好，病部組織得以明顯修復(圖4)。

可見，菌株Y28具有安全、高效防控腐爛病的特點，該菌株是潛在防治腐爛病的優良菌株。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。