一種研究北蟲草多糖對機體的體液免疫應答和細胞免疫應答反應的方法與流程

本發明涉及生物免疫領域，更具體地說涉及一種研究北蟲草多糖對機體的體液免疫應答和細胞免疫應答反應的方法。

背景技術：
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家蠶是世界上飼養最多的昆蟲，利用家蠶幼蟲栽培北蟲草有著豐富的可利用資源。再者，近幾年蠶桑業也面臨著嚴重的滑坡，如何提升蠶桑產業的附加值迫在眉睫，利用家蠶幼蟲栽培北蟲草不僅成本較低，而且營養價值也不低于野生的冬蟲夏草，社會與經濟效益顯著，就一張蠶種的產值來算一筆經濟賬，一般春蠶飼養1張蠶種，張種產量100斤左右，繭價2000元/擔，一張種收入2000元，用一張五齡幼蟲蠶種栽培北蟲草，可得到干體蠶蟲草14斤左右，以每斤500元計算，一張種的產值7000元，是絲繭育的3.5倍，可大大的提升蠶桑產業的產出值。

技術實現要素：
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本發明的目的就是針對現有技術的不足，而提供一種研究北蟲草多糖對機體的體液免疫應答和細胞免疫應答反應的方法。本發明具有步驟簡單，使用方便，可以推測北蟲草多糖能有效提高機體的體液免疫應答和細胞免疫應答反應，北蟲草多糖對Th1和Th2類細胞因子均有明顯的提升效果，表明機體的免疫應答機制可能被激活，另外，北蟲草多糖可能對體液免疫和細胞免疫反應的平衡上具有一定的調節作用的優點。

本發明的技術解決措施如下：

一種研究北蟲草多糖對機體的體液免疫應答和細胞免疫應答反應的方法，本發明包括如下步驟：(1)北蟲草多糖粗提物制備；(2)、實驗動物及其免疫；(3)、I gG效價的測定；(4)、IgG亞類測定；(5)、淋巴細胞轉化試驗；(6)、細胞因子mRNA檢測；(7)統計學分析，得出結論。

上述技術方案中，所述北蟲草多糖粗提物制備的步驟包括：將北蟲草3000g,粉碎,用石油醚脫脂3次,每次10.5L,共去掉脂質601.5g；殘渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，減壓濃縮至1.25g/ml。

上述技術方案中，所述實驗動物及其免疫的步驟包括：將ICR小鼠35只隨機分成7組,每組5只。每只小鼠頸部皮下注射含OVA(10μg)和組分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理鹽水溶液,對照組小鼠注射含OVA的生理鹽水溶液，2周后進行二免,二免后3周采血,制備血清。

上述技術方案中，所述I gG效價的測定的步驟包括：在96孔酶標板每孔加入100μL包被液(含5μg OVA/mL的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液),置4℃孵育18h后,洗滌液(pH 7.4磷酸鹽緩沖液PBS)洗滌3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS 封閉液(0.01mol/L,pH 7.4),于37℃孵育1h后,再用洗滌液洗滌3次,每次3min；用稀釋液將待測血清在酶標板上作二倍稀釋,使血清稀釋度為1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入經1:500稀釋的羊抗小鼠IgG抗體(CHEM I CON Internati onal I nc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入TMB(四甲基聯苯二胺)底物溶液顯色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應；用酶標儀在450nm波長測定OD值。

上述技術方案中，所述IgG亞類測定的步驟包括：在已包被抗原OVA的96孔酶標板上加入1:800倍稀釋的待檢血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入經1:600稀釋的生物素標記的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入1:4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入TMB底物溶液顯色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應；用酶標儀在450nm波長測定OD值。

上述技術方案中，所述淋巴細胞轉化試驗的步驟包括：將小鼠脫頸椎處死，75％酒精液浸泡5-10min，無菌操作取小鼠脾臟，加入1mL Hank’s研磨，研磨均勻后將脾細胞吹懸入平皿，過200目銅網后轉移入10mL離心管；1500rpm離心10min；PBS洗滌2次；細胞計數后，調整細胞濃度至2.5×10⁶/mL，按100μl/孔的量加入96 孔細胞培養板中；用細胞培養液配制各種刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS終濃度為5μg/mL，ConA終濃度為7.5μg/mL，設陰性對照和空白對照)；37℃、5％CO₂培養箱中培養48h；在培養結束前4h，每孔加入50μl MTT(2mg/mL)；然后將培養板取出，離心(1 500rpm，10min)沉淀細胞，輕輕傾去培養液上清，紙巾吸干；每孔加入150μl二甲基亞砜，避光充分振蕩，直至藍色顆粒完全溶解，570nm波長酶標儀檢測OD值；計算淋巴細胞刺激指數(Stimulation index，SI)：

SI＝(刺激孔OD－空白孔OD)/(未刺激孔OD－空白孔OD)。

上述技術方案中，所述細胞因子mRNA檢測的步驟包括：

(a)、脾淋巴細胞體外刺激；

(b)、Total RNA提取；

(c)、反轉錄；

(d)、引物及探針設計；

(e)、Real-time PCR反應體系及條件；

(f)、相對定量計算方法。

本發明的有益效果在于：

本發明步驟簡單，使用方便，可以推測北蟲草多糖能有效提高機體的體液免疫應答和細胞免疫應答反應，北蟲草多糖對Th1和Th2類細胞因子均有明顯的提升效果，表明機體的免疫應答機制可能被激活，另外，北蟲草多糖可能對體液免疫和細胞免疫反應的平衡上具有一定的調節作用。

附圖說明：

圖1為本發明研究技術路線示意圖；

圖2為不同劑量蟲草多糖佐劑組與陽性對照組小鼠血清IgG抗體水平對照示意圖；

圖3為不同劑量蟲草多糖佐劑組與陽性對照組小鼠血清IgG1和IgG2a抗體水平對照示意圖；

圖4為淋巴細胞轉化試驗結果示意圖；

圖5為北蟲草多糖粗提物佐劑組有效誘導IFN-γ表達水平示意圖；

圖6為北蟲草多糖粗提物佐劑組有效誘導IL-12表達水平示意圖；

圖7為北蟲草多糖粗提物佐劑組有效誘導IL-10表達水平示意圖；

圖8為北蟲草多糖粗提物佐劑組有效誘導IL-4表達水平示意圖。

具體實施方式：

以下結合具體實施例來對本發明作進一步的描述，但本發明所要求保護的范圍并不局限于實施方式所涉及之范圍。

實施例：一種研究北蟲草多糖對機體的體液免疫應答和細胞免疫應答反應的方法，本發明包括如下步驟：(1)北蟲草多糖粗提物制備；(2)、實驗動物及其免疫；(3)、I gG效價的測定；(4)、IgG亞類測定；(5)、淋巴細胞轉化試驗；(6)、細胞因子mRNA檢測；(7)統計學分析，得出結論。

所述北蟲草多糖粗提物制備的步驟包括：將北蟲草3000g,粉碎,用石油醚脫脂3次,每次10.5L,共去掉脂質601.5g；殘渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，減壓濃縮至1.25g/ml。

所述實驗動物及其免疫的步驟包括：將ICR小鼠35只隨機分成7組,每組5只。每只小鼠頸部皮下注射含OVA(10μg)和組分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理鹽水溶液,對照組小鼠注射含OVA的生理鹽水溶液，2周后進行二免,二免后3周采血,制備血清。

所述I gG效價的測定的步驟包括：在96孔酶標板每孔加入100μL包被液(含5μg OVA/mL的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液),置4℃孵育18h后,洗滌液(pH 7.4磷酸鹽緩沖液PBS)洗滌3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS封閉液(0.01mol/L,pH 7.4),于37℃孵育1h后,再用洗滌液洗滌3次,每次3min；用稀釋液將待測血清在酶標板上作二倍稀釋,使血清稀釋度為1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入經1:500稀釋的羊抗小鼠IgG抗體(CHEM I CON Internati onal I nc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入TMB(四甲基聯苯二胺)底物溶液顯色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應；用酶標儀在450nm波長測定OD值。

所述IgG亞類測定的步驟包括：在已包被抗原OVA的96孔酶標板上加入1:800倍稀釋的待檢血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入經1:600稀釋的生物素標記的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入1:4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗滌液洗滌3次,每次3min；加入TMB底物溶液顯色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應；用酶標儀在450nm波長測定OD值。

所述淋巴細胞轉化試驗的步驟包括：將小鼠脫頸椎處死，75％酒精液浸泡5-10min，無菌操作取小鼠脾臟，加入1mL Hank’s研磨，研磨均勻后將脾細胞吹懸入平皿，過200目銅網后轉移入10mL離心管；1500rpm離心10min；PBS洗滌2次；細胞計數后，調整細胞濃度至2.5×10⁶/mL，按100μl/孔的量加入96孔細胞培養板中；用細胞培養液配制各種刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS終濃度為5μg/mL，ConA終濃度為7.5μg/mL，設陰性對照和空白對照)；37℃、5％CO₂培養箱中培養48h；在培養結束前4h，每孔加入50μl MTT(2mg/mL)；然后將培養板取出，離心(1 500rpm，10min)沉淀細胞，輕輕傾去培養液上清，紙巾吸干；每孔加入150μl二甲基亞砜，避光充分振蕩，直至藍色顆粒完全溶解，570nm波長酶標儀檢測OD值；計算淋巴細胞刺激指數(Stimulation index，SI)：

SI＝(刺激孔OD－空白孔OD)/(未刺激孔OD－空白孔OD)。

所述細胞因子mRNA檢測的步驟包括：(a)、脾淋巴細胞體外刺激：將述分離到的脾淋巴細胞懸液調整細胞濃度至1×10⁷cell/ml，鋪板培養于24孔板，每孔2ml。向培養板內加入刺激物(H1N1流感抗原)，至HA終濃度為2μg/ml，將細胞培養于37℃，5％CO₂的環境中，抗原刺激15h后離心收集細胞，加入RNA提取試劑溶解后保存細胞裂解液于-80℃；(b)、Total RNA提取：提取細胞總RNA，RNA提取效果電泳鑒定：使用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳分析；(c)、反轉錄：采用iScript cDNA Synthesis Kit將總RNA反轉錄成cDNA，獲得的cDNA樣品置于-20℃保存備用；(d)、引物及探針設計：采用實時熒光定量雙重PCR方法檢測目的基因的相對表達量，以小鼠β-acting為內參基因，使用ABI 7300熒光定量PCR儀；目的基因探針5’端以FAM標記，β-actin探針5’端HEX標記，目的基因和內參基因3’端均采用BHQ-1標記。引物和探針序列設計采用軟件Primer Express 3.0；基因產物均經過DNA測序鑒定；(e)、Real-time PCR反應體系及條件：采用總體積為25μl的反應體系,依次加入1×Taq-Man通用反應預混液、目的基因引物和探針、β-actin引物和探針、cDNA模板(2μl)。PCR反應程序采用標準TaqMan條件：95℃(15sec)，60℃(30sec)，45個PCR循環；(f)、相對定量計算方法：設定熒光閾值(處于基因擴增信號的對數增長期(logarithmic phase)內的某個閥值(thresholds)被指定為Ct值)，根據不同管內擴增曲線中對應熒光閾值確定樣品Ct值，采用相關方法進行相對定量分析。

所述統計學分析，得出結論：

由圖2可知北蟲草多糖佐劑組均高于抗原單獨免疫組，而中劑量蟲草多糖佐劑組與陽性對照組小鼠血清IgG抗體水平要顯著高于抗原單獨免疫組；

由圖3可知，北蟲草多糖低劑量組小鼠血清中IgG1和IgG2a水均顯著抗原單獨免疫組小鼠，其它劑量多糖組在兩種抗體亞類水平上均略高于抗原單獨免疫組小鼠，鋁膠僅能誘導Th2型免疫反應，而抗體亞類檢測結果也反應出鋁佐劑組小鼠僅有IgG1水平顯著升高；

圖4可知北蟲草多糖佐劑組小鼠T/B淋巴細胞均被激活，尤其是中劑量組，對淋巴細胞的刺激指數顯著高于抗原單獨免疫組。本結果提示，北蟲草多糖能有效激活機體免疫細胞，對機體細胞免疫反應有促進作用；

圖5、圖6、圖7及圖8可知：北蟲草多糖粗提物佐劑組能有效誘導IFN-γ、IL-12、IL-4，尤其是中劑量多糖佐劑組，所誘導的各種細胞因子mRNA表達水平要顯著高于抗原單獨免疫組。鋁佐劑僅能誘導Th2類細胞因子IL-4和IL-10mRNA的表達。

研究結論：

由實驗結果可知，北蟲草多糖作為蛋白類抗原的佐劑，能有效提高小鼠免疫應答能力，血清抗體水平檢測結果可知，北蟲草多糖能有效提高OVA免疫小鼠血清中特異性血清抗體及抗體亞類水平，一定劑量的多糖對IgG1和IgG2a均有促進分泌的作用。

由淋巴細胞轉化水平檢測結果可知，北蟲草多糖能有效激活機體T/B淋巴細胞，進而為提高機體的免疫應答水平。

細胞因子檢測結果表明，北蟲草多糖能有效促進IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10等細胞因子mRNA的表達，尤其是中劑量多糖佐劑組，對兩類細胞因子表達水平均有顯著激活效應，

本實驗以ICR小鼠為模型，經模式抗原OVA免疫后，提取北蟲草多糖粗多糖、分別從小鼠體液免疫和細胞免疫兩方面進行分析，檢測了ICR小鼠48只，隨機分成6組，分別為生理鹽水組、10μg抗原組、10μg抗原混合不同劑量(低、中、高)北蟲草粗多糖粗提物以及10μg抗原加上200μg鋁佐劑作為陽性對照組，小鼠間隔2周皮下免疫2次，二免后2周采血測定血清特異性IgG、IgG亞類、淋巴細胞轉化水平檢測、細胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10)mRNA表達水平。結果表明，中劑量組能顯著提高血清特異性IgG抗體及亞類水平、特異性T淋巴細胞轉化水平、增強小鼠機體Th1/Th2混合型細胞免疫反應。本實驗首次證實將北蟲草多糖與抗原物質聯合使用，能有效提高機體對疫苗的免疫應答反應。本實驗結果將為進一步開發利用北蟲草多糖提供科學依據；

由本實驗結果可以推測北蟲草多糖能有效提高機體的體液免疫應答和細胞免疫應答反應，北蟲草多糖對Th1和Th2類細胞因子均有明顯的提升左右，表明機體的免疫應答機制可能被激活，另外，北蟲草多糖可能對體液免疫和細胞免疫反應的平衡上具有一定的調節作用。