一種免疫增強劑及其制備方法與流程
本發明涉及海洋生物技術領域，具體講是一種免疫增強劑及其制備方法。
背景技術：
免疫增強劑通常指的是在單用或與抗原同時使用時可增強機體免疫應答的物質，亦被稱為免疫調節劑或免疫刺激劑。免疫增強劑可通過不同的作用途徑發揮作用，如增強巨噬細胞的活性、增強抗原物質的免疫原性和穩定性以及促進抗體的合成與分泌等，從而增強機體的特異性和非特異性免疫應答。隨著免疫學研究的不斷深入，開發高效、穩定、安全的免疫增強劑越來越受到人們的重視。
巨噬細胞是調節機體固有免疫和適應性免疫反應重要的抗原遞呈細胞，在宿主對病原菌感染的防御系統中扮演著重要角色，被刺激后可產生不同的炎性介質、細胞因子等，從而抵抗病原菌。因而本發明以小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7為模型，測量NO表達量，并從mRNA和蛋白表達水平上測定iNOS、TNF-α、COX-2等細胞因子的表達量，為β-殼聚糖硫酸酯作為免疫增強劑的應用提供參考依據。
甲殼素是世界第二大纖維素資源，由于來源不同，其構型可分為α-甲殼素、β-甲殼素、γ-甲殼素，目前研究最多的為α-甲殼素，為反平行結構，其次為β-甲殼素，為平行結構，不同構型的甲殼素可能顯示不同的功效。殼聚糖是由甲殼素脫乙酰得到的產物，其生物相容性好，但由于其難溶于水和大部分有機溶劑而限制了其應用；而本發明所用的衍生物殼聚糖硫酸酯除了具有以上優點外還具有良好的水溶性，因而應用更加方便。本發明制備了不同分子量β-C-2，3，6-殼聚糖硫酸酯，并以小鼠腹腔巨噬細胞為模型，測定其免疫指標及機理，從而為開發新的免疫增強劑提供依據。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種免疫增強劑及其制備方法。
為實現上述目的，本發明采用技術方案為：
一種免疫增強劑，免疫增強劑的有效成分為殼聚糖硫酸酯類化合物；其殼聚糖硫酸酯類化合物為不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖。
所述不同分子量的β-C-2，3，6-殼聚糖硫酸酯有效劑量為50-200μg/mL。
所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖，其結構式為：
其中n為聚合度：4-40；該化合物的活性基團—硫酸酯基(OSO3－)的含量為30-35％。
所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖的制備：
(1)磺化試劑的制備：將N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷卻，然后在攪拌條件下滴加氯磺酸，使其在0-5℃反應；其中N,N－二甲基甲酰胺與氯磺酸的體積比為(5：1)-(10：1)；
(2)不同分子量的β-殼聚糖的制備：將高分子量β-殼聚糖溶于過量的酸性溶液中，而后再加入雙氧水(使溶液中H2O2最終體積分數為3％)，混勻后于60-80℃水浴攪拌10-60分鐘，得到不同分子量的β-殼聚糖；
(3)β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖的制備：稱取上述獲得的不同分子量的β-殼聚糖，加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺，攪拌均勻后，再加入上述磺化試劑，混合均勻后，于微波降解反應器中，在微波輻射40-70℃條件下，40-70℃反應，反應后純化后得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖；其中，β-殼聚糖、甲酸或二氯乙酸、N,N-二甲基甲酰胺按質量體積比為1:1-2.5：20-25(g：ml：ml)；β-殼聚糖與磺化試劑按質量體積比為1：15-25(g：ml)。
所述高分子量β-殼聚糖的分子量為2000kDa-4573kDa。其，來源于魷魚軟骨、墨魚軟骨等材料。
所述步驟(2)酸性溶液為濃度為1-3％甲酸、乙酸或鹽酸。
所述步驟(3)將分子量低于10KDa的殼聚糖原料，在40-45℃的微波輔助條件下反應1-3分鐘，得到1000-4000Da分子量的β-C-2,3,6-殼聚糖硫酸酯；
將分子量在10-100KDa的殼聚糖原料，在45-55℃的微波輔助條件下反應1-5分鐘，得到4.5-10KDa的β-C-2,3,6-殼聚糖硫酸酯；
將分子量在100KDa以上的殼聚糖原料，在45-70℃的微波輔助條件下反應1-5分鐘，得到10-100KDa的β-C-2,3,6-殼聚糖硫酸酯。
所述步驟(3)微波輻射條件反應后反應液中加入反應液2-5倍體積量的無水乙醇，沉淀，室溫沉化30-60min，得到的沉淀物即是不同分子量的β-殼聚糖硫酸酯的粗產品；將上述粗產品抽濾，濾餅用蒸餾水溶解，再用NaOH溶液將其中和，透析(根據制備的分子量的區別，將上述溶液用1500Da或3500Da的透析袋進行透析，除鹽后取透析液；)，透析液濃縮，冷凍干燥得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖。
一種殼聚糖硫酸酯類化合物的應用，其特征在于：殼聚糖硫酸酯類化合物作為免疫增強劑的應用；其中，殼聚糖硫酸酯類化合物為不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖。
經測定可見不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖能夠明顯促進RAW264.7細胞產生NO，且具有劑量依賴性。
不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖可顯著增加RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-1α、PGE2細胞因子的表達，且具有劑量依賴性。
不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖可促進TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上的表達，且隨著時間的延長，呈先上升后下降趨勢。
不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖可促進TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上的表達，且隨著時間的增加，各細胞因子的蛋白表達量也增加。
本發明所具有的優點：
本發明所用殼聚糖硫酸酯類化合物是在殼聚糖經磺化后所得2，3，6位殼聚糖硫酸酯衍生物，并具有強聚陰離子性質，且無明顯細胞毒性。同時本發明采用的殼聚糖硫酸酯類化合物的含硫量高，對殼聚糖原料利用率高；制備過程采用均相反應，制備方法簡單快速，操作成本低，污染少。
本發明以小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7為模型，通過產生的NO及IL-6、IL-lβ、IL-1α、TNF-α、PGE2等細胞因子的多少，可快速、準確地判斷免疫活性強弱并了解其機理，且可檢測是否有細胞毒性，為新型免疫增強劑的開發提供依據。
附圖說明
圖1為β-殼聚糖的紅外表征譜圖。在1645cm-1附近，β-殼聚糖只有一個氨基峰，而另一氨基峰則位于1598cm-1附近，符合β-殼聚糖結構特征。
圖2為分子量為3169Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖的紅外表征圖譜。在1215.33cm-1處出現了S＝O的非對稱伸縮振動，在809.04cm-1處出現了C-O-S的對稱伸縮振動，證明了分子中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。
圖3為分子量為5030Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖的紅外表征圖譜。在1219.52cm-1處出現了S＝O的非對稱伸縮振動，在811.99cm-1處出現了C-O-S的對稱伸縮振動，證明了分子中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。
圖4為分子量為14481Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖的紅外表征圖譜。在1213.41cm-1處出現了S＝O的非對稱伸縮振動，在810.16cm-1處出現了C-O-S的對稱伸縮振動，證明了分子中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。
圖5為β-殼聚糖硫酸酯對RAW264.7細胞因子mRNA水平的影響。
圖6為β-殼聚糖硫酸酯對RAW264.7細胞因子蛋白水平表達量的影響。
具體實施方式
本發明的實施例結合附圖進一步說明如下。
本發明一種免疫增強劑β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖的制備方法實施例如下：
(1)稱取定量的β-殼聚糖；
(2)加1-3％的酸溶液，1-3％酸溶液與β-殼聚糖的體積/重量比為：6-30:1，將β-殼聚糖充分溶解；所述酸溶液主要為甲酸、乙酸、氯乙酸等。
(3)將上述充分溶解的原料，按β-殼聚糖與N,N－二甲基甲酰胺按照重量體積比1:20-25的量加入N,N－二甲基甲酰胺，充分攪拌混勻；
(4)在(3)中滴加30-60ml氯磺酸磺化劑，滴加完成后，充分攪拌均勻；
(5)將(4)充分混勻的原料放入到微波爐中反應2-8分鐘；
(6)將上述反應液加入3倍體積的無水乙醇，出現大量白色絮狀沉淀，放置室溫沉化30min，得到的沉淀物即為較低分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖的粗產品；
(7)將上述沉淀物進行抽濾，取白色或淡黃色濾餅；
(8)將上述濾餅用蒸餾水溶解，用2M NaOH溶液調節PH值至7；
(9)根據制備的分子量的區別，將上述溶液用1500Da或3500Da的透析袋進行透析，除鹽后取透析液；
(10)將上述溶液濃縮，濃縮液冷凍干燥得淡黃色粉末狀固體，即為β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖。
表1不同輻射能量和作用時間對β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖各參數的影響
應用例
1不同濃度的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(5030Da)對RAW264.7細胞NO表達量的影響
(1)試驗材料及試劑：
①將β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(5030Da)首先配制成50mg/mL，加藥前用RPMI 1640完全培養基稀釋為400ug/mL，然后倍比稀釋至400，200，100，50，25，12.5ug/mL；
②Griess A試劑配制：對氨基苯磺酰胺400mg溶于40mL5％的磷酸溶液中；
③Griess B試劑配制：40mgN-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶于40mL超純水中；
④RAW264.7細胞、RPMI1640培養基、胎牛血清。
試驗方法：
①取處于對數生長期的RAW264.7細胞，調整細胞濃度1×106cell/mL，于96孔板每孔接種100ul。
②在5％的CO2培養箱中37℃培養24h后，加入不同濃度的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(5030Da)各100uL，使其終濃度分別為6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每個樣品設置3個復孔。LPS做陽性對照，終濃度為1ug/ml。
③將96孔板繼續培養24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等體積(100ul)的Griess試劑(Griess A和Griess B等體積混合，現配現用)，室溫避光放置10min，以完全培養基加顯色劑作為空白對照，用酶聯免疫檢測儀570nm下測吸光度，平行重復3次，代入標準曲線y＝0.00755x+0.00023求出NO量。
④標準曲線的繪制：將1mol/L的NaNO2貯存液用水稀釋至100μmol/L后，依次倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0umol/L濃度的NaNO2標準溶液。吸取100ul各濃度標準溶液于96孔板中，各濃度重復3孔，然后每孔加入100ulGriess試劑(Griess A和Griess B等體積混合，現配現用)，室溫避光反應10min后，使用酶聯免疫檢測儀測540nm吸光度。以NaNO2標準溶液濃度為橫坐標，以OD540為縱坐標，各濃度OD值扣除培養基空白對照OD值后，繪制NO標準曲線。
試驗結果：不同濃度的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(5030Da)增加NO表達量的結果如下：
表1：不同濃度的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(5030Da)對NO表達量的影響：
從上表可以看出，β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(5030Da)能夠明顯促進細胞產生NO，且具有劑量依賴性。
2.β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)細胞毒性評價
(1)試驗材料及試劑:
①0.5mg/mL的MTT溶液：噻唑藍用超純水配制為5mg/mL母液，避光保存，用前避光稀釋10倍；
②Stopping buffer配制：10％(w/v)的十二烷基硫酸鈉與0.01mol/L的鹽酸配制200ml。
③RAW264.7細胞、RPMI1640培養基、胎牛血清。
(2)試驗方法：
①取處于對數生長期的RAW264.7細胞，調整細胞濃度1×106個/mL，96孔板每孔接種100ul。
②在5％的CO2培養箱中37度培養24h后，加入不同濃度的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖100ul，使其終濃度分別為6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每個濃度設置3個復孔。LPS做陽性對照，終濃度為1ug/ml。
③將96孔板繼續培養24h后，棄去舊的培養基，然后每孔加入100uL濃度為0.5mg/mL的MTT溶液。
④放入培養箱中培養4小時后，每孔加入100uLstopping buffer(終止液)，繼續培養18小時，取出用酶聯免疫檢測儀于550nm測OD值。
(3)試驗結果
用RAW264.7細胞評價細胞毒性結果如下：
表2：β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)的細胞毒性評價
由上表可以看出，低濃度的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)無明顯的細胞毒作用，當濃度超過100ug/mL時有細胞毒性。
3.β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)對RAW264.7細胞細胞因子表達量的影響：
試驗材料與試劑：
IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2細胞因子ELISA試劑盒試驗方法：
①取處于對數生長期的RAW264.7細胞，調整細胞濃度1×106個/mL，96孔板每孔接種100ul。
②在5％的CO2培養箱中培養24h后，加入不同濃度的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)100ul，使其終濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每個濃度設置3個復孔。同時設置LPS陽性對照組，終濃度為1ug/ml，3個復孔。
③將96孔板繼續培養24h后，收集細胞上清液，按照相應ELISA試劑盒說明測定細胞上清液中IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2的含量。
試驗結果不同濃度β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)對各類細胞因子表達量的影響如下：
表3不同濃度β-殼聚糖硫酸酯對各類細胞因子表達量的影響
由上表可以看出，隨著殼聚糖硫酸酯濃度的增加，其細胞因子表達量也增加，最高濃度的殼聚糖硫酸酯各細胞因子表達量可達空白對照的10倍，表明β-殼聚糖硫酸酯可顯著增加各細胞因子的表達，且具有劑量依賴性。
4.β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)對RAW264.7細胞因子mRNA水平的影響
根據細胞增殖試驗和NO試驗結果，選擇100ug/mL進行試驗。
試驗材料及試劑
①DEPC水配制：100mL超純水中加入0.1mL的DEPC，37℃放置12小時后，121高壓滅菌20分鐘。
②Trizol、氯仿、異丙醇、溴化乙錠、瓊脂糖、逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒
(2)試驗方法
①細胞的培養和處理：將RAW264.7細胞接種于六孔板中，接種密度為2.5×106個/mL，5個孔中每孔接種2mL。培養24小時后，棄去舊的培養基，除空白對照外，每孔加入β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)，使其終濃度為100ug/mL，置于細胞培養箱中分別培養0.5、1、3、6小時后，收集細胞于小離心管中。
②細胞RNA提取：每管中加入1mLTrizol試劑，用移液槍吹打數次促進細胞裂解，然后置于冰上靜置10分鐘，使核蛋白充分解離。然后每管中加入100μL氯仿，小心蓋好管，充分劇烈震蕩15秒，于冰上靜置5分鐘。然后4℃12000g離心15分鐘，取上清液400μL，加入400uL異丙醇，輕輕混勻5次，室溫下靜置10分鐘。4℃12000g離心8分鐘后棄去上清，向沉淀中加入1mL的75％乙醇DEPC水，混勻。離心棄去上清，晾干后每管中加入30uLDEPC水溶解，然后測定提取的RNA量。
③逆轉錄反應：1uL的oligo dT與1uL的10×dNTP混合，加一定量的RNA和DEPC水，總體積達12uL，65℃變性5分鐘，迅速轉移到冰上，按試劑盒說明書加入FSB buffer、DTT、DEPC水，混勻，37℃水浴2分鐘，于冰上冷卻。然后每管加入1uL的M-MLVRT，逆轉錄反應條件為37℃，50min；70℃，15min。得到20uLcDNA體系，加入60uL滅菌水，置于-20℃冰箱保存。
④PCR擴增：采用試劑盒進行反應，體系如下：2×Es Taq Master Mix 10uL，正向引物Forward Primer(10uM)1uL，反向引物Reverse Primer(10uM)1uL，cDNA 2uL，不含RNA酶的水RNase-Free water加至20uL。PCR反應條件如下：
Program1：94℃，2min；1個循環數
Program2：94℃，30s；55-65℃，30s；72℃，30s；20-30個循環數Program3：72℃，2min
⑤電泳檢測：0.25g瓊脂糖加25mL0.5×TAE及0.5uL溴化乙錠制膠，每孔加入PCR反應后的溶液10uL，100v，30min跑電泳。放入電泳成像系統，拍照保存(參見圖5)。
(3)試驗結果
β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)對于TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上表達量的影響如圖1，其中GAPDH為內參，由圖5可以看出，β-殼聚糖硫酸酯可以促進上述細胞因子的表達，隨著時間的延長，呈上升趨勢。
5.β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)對RAW264.7細胞因子蛋白水平表達量的影響
(1)試驗材料及試劑：
BCA法蛋白定量測定試劑盒、玻璃珠、蛋白裂解液、PVDF膜、對應的TNF-α、COX2、iNOS、β-actin一抗和二抗。
(2)試驗方法
①細胞的培養和處理：將RAW264.7細胞接種于六孔板中，接種密度為2.5×106個/mL，5個孔中每孔接種2mL。培養24小時后，棄去舊的培養基，除空白對照外，每孔加入用新鮮培養基配制的β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)2mL，濃度為100ug/mL，置于細胞培養箱中分別培養0.5、1、3、6小時后，收集細胞于小離心管中
②蛋白的提取：每管加入200uL蛋白裂解液和一小匙玻璃珠，充分震蕩，4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為蛋白提取液，BCA法測定蛋白濃度。
③煮沸變性后，以每孔40μg的核蛋白點樣，SDS-PAGE分離。通過電轉儀將凝膠上蛋白樣品移至PVDF膜上，分別與一抗和辣根過氧化氫酶標記的二抗孵育，洗膜后加入發光劑和穩定劑，曝光拍照。
(3)試驗結果
β-C-2，3，6-硫酸酯-殼聚糖(分子量5030Da)對TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上表達量的影響如圖6，其中β-actin為內參，可以看出隨著時間的增加，各細胞因子的蛋白表達量也增加。
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