纖維素可及度測量的融合蛋白及其應用的制作方法

本發明涉及生物化工領域，特別涉及用于纖維素可及度測量的融合蛋白及其應用。

背景技術：

由于化石資源短缺日趨嚴峻和環境污染日益嚴重，以來源廣泛且可再生的木質纖維素為原料生產生物能源和工業化學品受到了世界各國的廣泛關注。其中以生物技術為核心的木質纖維素的生物轉化已經成為生物能源開發、生物質資源加工和綠色化工過程的關鍵技術之一，相關研究也已成為當前工業微生物技術的一個熱點和難點。然而，植物在長期進化過程中形成了復雜的木質纖維素結構以防御動物和微生物的攻擊，這種木質纖維素抵抗微生物和酶降解的各種特性統稱為“抗生物降解屏障”。因此在木質纖維素生物轉化過程中，首先必須要對木質纖維素進行預處理以提高纖維素的可及度，這是纖維素生物轉化和利用過程的關鍵步驟之一。

纖維素的可及度是指纖維素對纖維素酶的可接觸程度，是表征木質纖維素生物降解和預處理效果的重要標準。纖維素的可及度與基質的孔結構、比表面積及顆粒尺寸密切相關。而傳統化學和材料科學中用于分析固體材料孔結構特性的方法亦可用于分析木質纖維素基質的孔結構。目前可用于表征木質纖維素基質孔結構特性的方法主要有 BET 氮氣分子吸附法、溶質排斥法、差示掃描量熱法和核磁共振法。但用這些方法測定纖維素可及度時，不同程度的存在某些問題。例如，BET 氮氣分子吸附法、差示掃描量熱法和核磁共振法測量纖維素可及度時，被測量原料需要進行干燥，而干燥會導致底物孔隙特性改變。另外，由于探針分子大小與纖維素酶分子大小相差較大，因而所測定的可及度與實際可及度偏差較大。溶質排斥法雖然可以測定含水狀態下木質纖維素基質的纖維素可及度，但該方法費時費力，且重復性很差，難以測定纖維素表面貢獻的可及表面積。

因此，要準確測定木質纖維素原料及預處理后基質中纖維素的可及度，所用探針分子需要滿足如下要求：（1）探針分子需要與纖維素酶分子具有相當的尺寸大小；（2）探針分子需要可特異性識別纖維素，就像纖維素酶分子的纖維素結合元件（CBM）那樣，可在熱力學上自發地識別纖維素；（3）探針分子可定量分析或者能夠給出可定量測量的信號。因此，本發明提供了一種新的纖維素可及度測量方法，通過構建與真菌纖維素酶具有類似纖維素識別功能且分子大小相當的融合蛋白探針分子，且該融合蛋白可發出定量分析的信號，從而實現準確定量測量纖維素對真菌纖維素酶的可及度。

技術實現要素：

現有技術測量纖維素可及度，存在被測量材料需要干燥、測量偏差較大、測量過程費時費力和可重復性差的問題。針對以上問題，本發明提供一種可特異性識別纖維素且具有與真菌纖維素酶關鍵組分外切葡聚糖酶相當分子量大小的融合蛋白分子，以及將其用作探針分子來準確測量纖維素可及度的新方法。

本發明提供了一種纖維素可及度測量的融合蛋白，其包含纖維素識別多肽、連接肽和熒光蛋白，或者由纖維素識別多肽、連接肽和熒光蛋白組成，其中所述連接肽位于纖維素識別多肽和熒光蛋白之間，并且所述融合蛋白的分子量為30-80 kD。

優選地，所述融合蛋白中的纖維素識別多肽為選自曲霉屬、木霉屬和青霉屬中任一種真菌的纖維素酶的纖維素結合元件（CBM），優選為外切葡聚糖酶的纖維素結合元件；進一步優選地，其中所述纖維素識別多肽包含SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，或由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列組成。

優選地，所述融合蛋白的連接肽為選自曲霉屬、木霉屬和青霉屬中任一種真菌的外切葡聚糖酶的連接肽，優選為外切葡聚糖酶中的CBM與催化域之間的連接肽；進一步優選地，其中所述連接肽包含如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID No：2所示的氨基酸序列組成。

優選地，所述融合蛋白的熒光蛋白選自綠色熒光蛋白或其變體，包括藍色熒光蛋白、藍綠色熒光蛋白、原綠色熒光蛋白、增強型綠色熒光蛋白、增強型黃色熒光蛋白、光活性綠色熒光蛋白等；進一步優選地，其中所述熒光蛋白為分子量為20-60kD的綠色熒光蛋白；更進一步優選地，所述融合蛋白中包含1- 3個綠色熒光蛋白；再進一步優選地，其中所述熒光蛋白包含SEQ ID No：3 所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID No：3 所示的氨基酸序列組成。

本發明提供了一種核酸分子，其編碼所述的融合蛋白。

本發明提供了一種重組質粒，其包含所述的核酸分子；進一步優選地，所述重組質粒的表達載體選自大腸桿菌pET28a載體。

本發明還提供了一種構建所述重組質粒的方法，其包括以下步驟：

（1）設計并合成所述的核酸分子序列，使得其所表達的融合蛋白的分子量為 30-80kD；

（2）PCR擴增所合成的核酸分子序列，優選地，所使用的擴增引物如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；以及

（3）將步驟（2）中所擴增的產物回收并連接到大腸桿菌表達載體上，挑選出陽性克隆。

本發明還提供了一種表達所述融合蛋白的方法，其包括以下步驟：

（1）構建前述重組質粒；以及

（2）將步驟（1）中所構建的重組質粒轉化到大腸桿菌表達菌株中，挑選出陽性克隆，并且誘導培養所述的陽性克隆表達融合蛋白；優選地，所述誘導培養條件如下：誘導劑，終濃度為1 mM IPTG；誘導溫度，30℃；誘導時間，6 h。

本發明還提供了利用所述融合蛋白來測量纖維素可及度的方法；優選地，所述方法包括以下步驟：將1-100 mg/ml 的底物懸浮在pH 4至9的緩沖溶液中，加入1至20 μg/ml所述融合蛋白，于10至40℃下反應10至180分鐘，測定吸附前后液相熒光強度變化，由此計算出底物的纖維素可及度。

優選地，本發明提供的方法可用于測定純的纖維素或者經預處理后的木質纖維素中纖維素的可及度。

經過實驗，用本發明提供的融合蛋白對木質纖維素的可及度進行測量，與傳統方法相比，可以更準確地測定纖維素的可及度。

此外，為避免融合蛋白表達不完全，以及提高融合蛋白的表達量和穩定性，所述融合蛋白可以以CBM-GFP或者GFP-CBM的形式表達。

本發明的優點在于：

1、本發明提供的融合蛋白含有真菌纖維素酶的纖維素識別組件（CBM），可特異性地識別纖維素底物。

2、本發明提供的融合蛋白探含有熒光蛋白，可以獲得可視化分析和定量測量的信號。

3、本發明提供的融合蛋白模擬了真菌纖維素酶的吸附特性。

4、本發明提供的融合蛋白的大小與纖維素酶中的關鍵組分外切葡聚糖酶（CBH）類似，因而可以提高測量的精確度。

5、本發明提供的融合蛋白可以用于含水狀態下底物可及度的測定，避免了干燥帶來的底物孔結構的改變。

附圖說明：

附圖1：熒光顯微鏡下GFP-GFP-CBM和GFP-GFP蛋白以濾紙為底物的吸附結果

附圖2：熒光顯微鏡下GFP-GFP-CBM和GFP-GFP蛋白以微晶纖維素為底物吸附結果

附圖3：融合蛋白分子吸附量與預處理后麥稈纖維素酶解性能的關系

具體實施方式

為了更詳細地說明本發明，給出下述制備實例。但本發明的范圍并不局限于此。

實施例1

大腸桿菌重組質粒pET28a-GFP2-CBM的構建

根據Genebank中GFP基因、CBM基因的序列，設計兩個GFP與CBM融合蛋白的基因序列并合成于pUC57-simple載體上。根據融合蛋白GFP2-CBM的基因序列及大腸桿菌表達載體pET28a上多克隆位點的特征，設計合成以下兩條引物：

GFP_Fe: 5’-GACgaattcATGCGTAAAGGCGAAGAGCTGTTC-3’

CBM_Rh:5’- GACaagcttTTACAAGCACTGAGAGTAGTAAGG-3’

GFP_Fe、CBM_Rh兩端分別設計了EcoRI和HindIII酶切位點，以小寫字體表示。采用GFP_Fe、CBM_Rh引物，以本實驗室構建的重組質粒pUC57-simple-GFP2-CBM為模板, 通過PCR方法擴增出GFP2-CBM基因。PCR條件：預變性95℃ 5分鐘；再進行30個循環的95℃ 變性30秒， 60℃退火1分鐘，72℃延伸 1 分30秒；最后72℃延伸 10分鐘。擴增產物（大小約1.7kb）切膠回收后，將回收后的GFP2-CBM基因和載體pET28a分別進行EcoRI和HindIII雙酶切，用T4連接酶連接，構建重組質粒pET28a-GFP2-CBM。將連接產物進行EcoRI和HindIII雙酶切驗證和測序驗證。并對序列進行測序分析。

結果分析：重組質粒上的GFP2-CBM基因序列與設計的基因序列一致，說明大腸桿菌重組質粒pET28a-GFP2-CBM的基因構建正確。

實施例2

融合蛋白GFP2-CBM的表達

將重組質粒pET28a-GFP2-CBM轉化到大腸桿菌表達菌種BL21，將菌液涂布于含50 μg/ml Kanamycin的LB平板上進行抗性篩選，挑取單克隆PCR檢測，選擇陽性克隆。

挑取重組大腸桿菌表達菌株BL21-pET28a-GFP2-CBM，接種于5 ml LB培養基中，37℃，200rpm搖床培養過夜。再取1 ml菌液轉接100 ml LB培養基中，37℃，200rpm搖床培養至OD₆₀₀為0.6左右，添加IPTG至終濃度為1 mM，30℃，200rpm搖床培養6 h。離心收集菌體，超聲破碎取上清液，經Ni-NTA介質柱純化，透析除鹽，最終蛋白產量為100 mg/L菌液。經SDS-PAGE電泳檢測，得到分子量70 Kda的目的蛋白條帶，與外切葡聚糖酶的分子量相當。

結果分析：本實施例表達的融合蛋白，經SDS-PAGE電泳檢測，得到分子量70 KDa的蛋白條帶，外切葡聚糖酶的分子量為66-70KDa，說明本實施例表達的融合蛋白與外切葡聚糖酶的分子量相當，所以本實施例表達的融合蛋白與真菌纖維素酶關鍵組分外切葡聚糖酶具有類似的分子大小。

實施例3 融合蛋白對純纖維素的識別

按照實施例1和2所述步驟獲得融合蛋白GFP-GFP-CBM。并采用類似的步驟獲得不含CBM的熒光蛋白GFP-GFP。利用GFP-GFP-CBM和GFP-GFP兩種蛋白分別以濾紙及微晶纖維素為底物在37 ℃，200 rpm條件下吸附2 h，并在熒光顯微鏡下觀察吸附后的濾紙纖維素（附圖1）及微晶纖維素（附圖2），可以發現，由于CBM對纖維素的識別作用，使GFP-GFP-CBM融合蛋白可以有效地吸附在纖維素上，而GFP-GFP融合蛋白則不具備此功能，因此在熒光顯微鏡下無明顯的熒光現象。

結果分析：本實施例結果顯示，本發明提供的融合蛋白以獲得可視化分析信號，并且可以特異性地識別纖維素。

實施例4融合蛋白用于分析預處理后底物的可及度

通過用不同濃度的稀硫酸（0.4%, 1%,3%，5% ,8%）處理甘蔗渣樣品，獲得一系列不同半纖維素含量的預處理樣品。在5%固液比，15 FPU/g固體的酶濃度條件下，對獲得的樣品在50℃，150 rpm條件下酶解120 h。同時，在經過1 h的過量牛血清蛋白吸附后，向樣品中分別添加相同濃度的融合蛋白溶液在37 ℃，200 rpm條件下吸附2 h，將吸附的蛋白量與酶解120 h時的轉化率關聯可得隨著稀酸濃度增加，半纖維素脫除增加，纖維素可及度增加，如附圖3。結果表明融合蛋白分子可用于分析木質纖維素底物的可及度。

結果分析：本實施例結果表明，本發明提供的融合蛋白分子對預處理后木質纖維素底物中的纖維素亦具有特異性識別，可用于預處理后底物的纖維素可及度分析。

以上實施例說明本發明大腸桿菌重組質粒pET28a-GFP2-CBM的基因構建正確，表達的融合蛋白與外切葡聚糖酶的分子量相當，可以比較精確地測量出纖維素的可及度。本發明提供的融合蛋白含有熒光蛋白，可以獲得可視化分析信號，具有真菌纖維素酶的吸附特性。通過本發明制備的融合蛋白分子可用于準確測量木質纖維素底物的可及度，與現有技術相比效果突出。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。