一種快速高效的農桿菌介導的小麥莖尖遺傳轉化方法與流程

本發明屬于農業生物技術領域和植物基因工程領域，具體是一種快速高效農桿菌介導的小麥遺傳轉化方法。

背景技術：

小麥作為世界上重要的糧食作物之一，是人類獲取蛋白質與熱量的主要來源之一。根據國際糧食政策研究所預測，世界小麥需求量將以每年1.6％的速度增長，但近十多年來，由于耕地面積的不斷減少和人口數量的持續增長，培育出優質，高產的小麥是一個急需解決的問題。傳統的小麥雜交育種過程緩慢，存在基因連鎖和生殖隔離的缺點，很難產生新品質的小麥。借助于一些理化條件的誘變育種，需要大量材料，并且難以控制誘變的方向，有益突變率較低，難于進行篩選。以細胞融合的方式獲得雜種細胞，培養并發育成植株的細胞工程育種，技術復雜，難度較大，會導致生物品系減少，個體生存能力下降。目前，采用基因工程的技術獲得小麥新品種是最高效的育種方式之一。

1992年，世界上才成功獲得第一例轉基因小麥，作為最后一個轉化成功的重要和谷類糧食作物，其轉化效率較低，重復性較差，轉化規模較小，主要是因為兩方面：一方面小麥屬于六倍體作物，且遺傳背景復雜，其基因組較大(16000Mb)，是玉米基因組的7倍，水稻基因組的35倍。且重復序列較多。另一方面小麥的遺傳轉化過程中DNA導入頻率低，并且轉化后小麥愈傷組織的再生能力不強，有較強的基因型依賴性。所以導致小麥的遺傳轉化研究起步較晚，進展緩慢。轉化效率遠遠低于其他植物如玉米水稻等。目前為止小麥轉化的方法有：花粉管通道法，顯微鏡注射法等，基因槍法，電擊穿孔法，PEG法等，目前小麥轉化普通采用的兩種方法是基因槍法與農桿菌介導法。但是，基因槍法經濟成本較高，容易造成外援基因丟失，導致基因沉默。而農桿菌介導法具有操作簡單，成本低，插入拷貝數較少，并能轉化一些相對較大的DNA片段等優點，近年來，通過農桿菌侵染小麥愈傷組織的方法已經廣泛的用于小麥遺傳轉化。但是該方法受到都須通過組織培養和植株再生途徑，操作過程中要求嚴格，消耗時間長，工作量大，容易出現玻璃化，褐化，細胞突變等問題。且小麥本身具有較強的基因特異性，其基因組相對于其他作物較大，也增加了轉化的難度。因此，能夠創制出不依賴組織培養技術的小麥植株水平的轉化技術具有重大的意義。

Erwin Smith在一個世紀前對植物病原體進行研究時，發現了一種個革藍氏陰性的植物病原菌—根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，研究發現：在植物受到損傷的情況下，農桿菌能夠侵染大多數雙子葉植物和部分單子葉植物，植物受傷部位便會產生一種特異的生物堿—冠癭堿，進入農桿菌細胞內。從而導致攜帶有外源基因的Ti質粒上的T—DNA轉移到受體細胞中，并整合到受體細胞的染色體上。農桿菌介導法的小麥遺傳轉化研究所采用的受體材料有很多，包括：幼穗、幼胚、成熟胚、胚性愈傷組織、根尖、莖尖等。研究表明：上述材料來源植物的不同生長發育階段，具有時空差異性，針對不同的材料需采取了不同轉化以及培養方法，操作過程較為繁瑣，為了提高轉化效率，獲得新的小麥品種。應該采用較為理想的遺傳轉化材料，其應具有以下優點：第一，材料處理方式相對均一，具有高重復性與普遍性。第二，材料分化程度低，細胞全能性強，具有發育成完整植株的可能性。第三，材料容易獲取，減少取材對實驗的影響，便于進行實驗。第四，材料相對較大，有利于遺傳轉化成功。由于小麥成熟個體較大，材料均一，重復性高，且易獲得，易保存，細胞全能性強，是進行小麥遺傳轉化研究的理想材料。研究表明，傳統小麥農桿菌遺傳轉化往往需要借助植物組織培養技術，而其中小麥受體基因型是影響農桿菌轉化效率的重要因素之一，不同小麥受體基因型對農桿菌的敏感性不同，轉化效率也顯著不同，研究表明，只有部分小麥基因型的受體材料再生頻率高，絕大多數具有重要經濟價值的小麥，其基因型差異較大，再生性能差，仍然難以進行轉化，因此，建立一個轉化受體基因型依賴程度較低的小麥遺傳轉化方法具有重大意義。

技術實現要素：

針對上述領域中的需求，本發明提供了一種小麥遺傳轉化方法，避免了傳統小麥遺傳轉化方法中的缺點，包括植物組織培養中嚴格無菌條件，培養過程中生長周期長，所需經濟成本高，對材料的狀態和基因型要求較高等，建立了一種簡單方便高效快速的農桿菌介導小麥莖尖的遺傳轉化方法。

一種快速高效的農桿菌介導小麥莖尖遺傳轉化方法，采用以下步驟：

1)取小麥成熟種子萌發，得到其發芽期個體，低溫處理；

2)以發芽期的小麥個體作為實驗材料，橫切其部分胚芽，將裸露的莖尖分生組織作為遺傳轉化受體；

3)通過真空滲透處理的方式，將農桿菌導入小麥莖尖分生組織細胞，使農桿菌攜帶的目的基因的T-DNA插入植物基因組；

4)將小麥移入適宜生長的土壤，對其進行常規管理，并對其進行鑒定，挑選出轉基因小麥植株。

所述小麥種子萌發的方法為無需消毒處理，直接以20-25℃自來水浸泡破肚露白后置于培養皿中20-25℃催芽生根。

所述低溫處理為4℃低溫保存試驗材料36-48小時。

所述低溫處理時胚芽長度為1.5-2.0cm。

所述遺傳轉化受體是帶有完整胚根、胚乳的切除胚芽后的莖尖分生組織。

所述步驟(3)真空滲透處理方法為將暴露出莖尖分生組織的小麥材料用YEP液體培養基培養的農桿菌菌液浸泡，抽真空處理。

所述YEP農桿菌菌液其OD₆₀₀為0.5，農桿菌菌液中加入乙酰丁香酮(AS)和表面活性劑(Silwet L-77)，以增加轉化效率。

所述抽真空處理的條件為：1.5Kpa壓強下浸泡5min。

所述農桿菌為根瘤農桿菌菌株LBA4404，攜帶杜仲幾丁質酶基因EuCHIT1及卡那霉素(Kanamycin Monosulfate)抗性基因的pSH-35S-CHIT1載體。

所述小麥品種為紫粒麥。

本發明以小麥成熟種子為材料，經過催芽處理和低溫處理后，橫切其莖尖分生組織，以此為受體；不需要無菌環境，在真空條件下，利用農桿菌介導，采用真空處理將外源基因導入小麥基因組，從而獲得轉基因小麥。

本發明無需經過組織培養，受小麥基因型影響程度低，種子萌發后可直接進行操作，具有以下優點：

第一、操作簡單。除了農桿菌的培養外，其他步驟無需在無菌環境下操作，避免了植物組織培養過程必須的培養基配制、外植體消毒、愈傷組織誘導、繼代、共培、篩選、再生芽誘導、生根等一系列繁瑣過程。

第二、生長周期短。從浸種到獲得轉基因植株，只需小麥一個生長周期，相對于傳統的組織培養的方法所需時間較短。

第三、重復性與普遍性高。受轉化材料基因型的影響較小，且對材料的處理方式統一，簡便，易重復，轉化效率高，T1代種子轉化率為11％。

第四、經濟效益高。直接采用農桿菌菌液浸染小麥遺傳轉化受體，利用土壤培養小麥，減少了傳統轉化過程中植物組織培養所需的一系列人力物力投入，可大幅度減少遺傳轉化成本。

本發明的用語及培養基：

本發明中農桿菌培養一般采用YEP培養基(酵母提取物10g/L+蛋白胨10g/L+NaCl 5g/L，pH 7.2，固體培養基中加入15g/L瓊脂)培養。

附圖說明

圖1 pSH-35S-EuCHIT植物表達載體，

圖2紫粒麥種子，

圖3 GUS染色呈陽性的轉基因紫粒麥葉片，

圖4 GUS染色呈陽性的轉基因紫粒麥幼穗，

圖5野生型植株與轉基因紫粒麥幼穗GUS染色對比，

圖6 EuCHIT1基因PCR檢測結果。

具體實施方式

下面結合實施例，對本發明做進一步的詳細說明。

實施例：采用本方法獲得紫粒麥轉基因植株.

1.小麥遺傳轉化受體準備

取紫粒麥成熟種子(見圖2所示)，清水浸泡于25℃下，12h后取出破肚露白的種子，吸出多余水分置于培養皿中催芽生根2d，待胚芽長度長到1.5-2.0cm，置于4℃下低溫處理2d，用手術刀從莖尖莖環處將胚芽及胚芽鞘切除，從而暴露其莖尖分生組織。

2.農桿菌培養及活化

根瘤農桿菌菌株LBA4404，攜帶杜仲幾丁質酶基因EuCHIT1(申請號2015108620543、2016102991953)的pSH-35S-EuCHIT載體，見圖1所示，劃線接種到YEP固體培養基中(含20mg/L利福平(Rif)+50mg/L卡那霉素(Kan)上。置于培養箱，28℃黑暗條件下培養2d后，取出培養基并挑取單菌落至5ml YEP液體培養基中(含20mg/L利福平Rif+50mg/L卡那霉素Kan)，搖床(180rpm，28℃)振蕩培養24h后，取50μl菌液加入到50ml YEP培養基中(含20mg/L Rif，50mg/L Kan)，搖床(180rpm，28℃)振蕩培養12h后，觀察其菌液濃度，并測其OD₆₀₀值，直到菌液OD600＝0.5。

3.小麥的遺傳轉化

將準備好的小麥材料放入YEP農桿菌菌液，按200μl/L的濃度加入表面活性劑(SILWET1-77)以及1ml/L的濃度加入乙酰丁香酮(AS)，于15Kpa壓強下真空處理5min，倒掉菌液，置于干凈培養皿中，加入少許水，為了農桿菌攜帶的質粒能整合到植物基因組中，放置于25℃黑暗條件下培養3d，(因為光照會使得農桿菌的質粒脫落，轉化率就會降低，另外植物切割以后較為脆弱，暗培養能幫助其恢復到正常的生長狀態。)

4.轉基因小麥植株鑒定。

將培養后的小麥移栽到土壤中，常規肥水管理。等待其生長，并對其小麥幼嫩葉片以及幼穗進行GUS組織化學染色檢測，具體方法如下：剪取小麥幼嫩葉片或幼穗少許，放入1.5mlPCR管中，加入20ul的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷)染色液，37℃放置12h,吸出X-Gluc，加入200ul的乙醇(75％)溶液，將其葉綠素脫盡，與對照組對照，篩選出藍色的陽性植株。見圖3、圖4、圖5所示。即葉片，幼穗顯示為藍色的陽性小麥為轉基因植株。結果表明，共GUS組織化學染色處理小麥幼穗162株，其中18株幼穗染液呈藍色，陽性植株占11.1％。

轉基因植株PCR檢測

取GUS染色檢測呈陽性的植株，采用DNAsecure Plant Kit(TIANGEN公司)試劑盒提取小麥葉片的DNA。具體方法如下：

(1)取GUS檢測陽性的小麥新鮮葉片100mg，剪碎至研缽中，加入液氮，充分研磨。

(2)將研磨后的葉片，加入裝有400μl緩沖液LP1和6μl RNase A(10mg/ml)的2ml離心管，旋渦振蕩1min，室溫放置10min。

(3)加入130μl緩沖液LP2，移液槍吹打混勻，旋渦振蕩1min。

(4)12,000rpm離心5min，將上清移至新的2ml離心管中。

(5)加入1.5倍體積的緩沖液LP3，立即充分振蕩混勻15sec，直至出現絮狀沉淀。

(6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重復上一步操作。

(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(10)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12,000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。

農桿菌質粒提取，采用TIANGEN公司質粒小提試劑盒提取，具體方法如下：

(1)柱平衡步驟：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱放回收集管中。

(2)取過夜培養的菌液1-5ml，加入離心管中，12,000rpm離心1min，吸取上清。

(3)向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液P1，使用移液器或漩渦振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。

(4)向離心管中加入250μL溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。

(5)向離心管中加入350μL溶液P3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時將出現白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10min，此時在離心管底部形成沉淀。

(6)將上一步收集的上清液用移液器轉移到吸附柱CP 3中(吸附柱放入收集管中)，注意盡量不要吸出沉淀。12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP 3放入收集管中。

(7)向吸附柱CP 3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP 3放入收集管中。

(8)重復步驟(7)。

(9)將吸附柱CP 3放入收集管中，12,000rpm離心2min，去除吸附柱中殘余的漂洗液。

(10)將吸附柱CP 3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12,000rpm離心1min，將質粒溶液收集到離心管中。

對EUCHIT1基因進行PCR檢測，分別將轉基因小麥DNA，農桿菌質粒產物，野生型小麥DNA作為模板進行PCR擴增；其基因引物由上海英俊生物有限公司合成。引物序列為:Forward:5，-CGGGATCCCGATGGCGAAGACTAGTAGAAACGCAC-3，：Reverse primer:5，-CGGAATTCCGTATGGAACCCATAAATCTCAGGAAG-3，pcr反應程序為：預熱98℃10S；(98℃10S；55℃30S；72℃1min)30個循環反應；72℃延伸5min；4℃保存。

PCR反應完畢后，取5μl擴增產物，1％的瓊脂糖凝膠電泳中電泳，Bio-Rad凝膠成像系統儀下觀察并照相。見圖6。利用特異性引物對篩選獲得的小麥植株進行PCR擴增，得到大小約為1000bp左右的目標條帶，表明農桿菌攜帶的幾丁質酶基因已經成功導入到小麥植株中。