本發明涉及水污染監測
技術領域：
。更具體地說，本發明涉及一種用MSH6基因監測水中鎘污染的方法。
背景技術：
：隨著城鎮化和工農業的迅猛發展，水體重金屬污染日益加劇，其中鎘是重金屬污染的典型代表。鎘是一種銀白色有光澤的金屬，質軟耐磨，抗腐蝕。自然界中的鎘的形態有+1價，主要為+2價。鎘的化合物基本都溶于水，只有硫化鎘、氫氧化鎘及硒化鎘極難溶于水。在水溶液中易與氯離子、氨根離子及碳酸根離子等能發生絡合反應。而且鎘還可以與含有Se、S、N等的有機物形成中等穩定的絡合物，尤其是能與含-SH基團的氨基酸類物質強烈螯合。因而鎘具有較大的水溶性，更容易為生物所得和積累。鎘毒性很強，鎘在水體中不能被生物降解，只能在各種形態之間相互轉化、分散和富集過程遷移。鎘是水生動物非必需但高致毒元素，具有親脂強、易富集和難降解的特性，不僅能引起動物腎、肝、睪丸損傷，肺水腫和骨軟化，而且與腎、肺、前列腺的癌變等相關，對環境、人和其他動物健康造成嚴重威脅。用化學方法可以定性、定量檢測鎘等重金屬污染，但是無法檢測其危害性和危害程度。敏感生物標記物則可敏感地監測鎘等重金屬污染的危害性和危害程度，為水體生態環境監測、毒理診斷、調控和防治提供準確、快速的科學方法。技術實現要素：本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供一種用MSH6基因監測水中鎘污染的方法，通過魚的MSH6基因作為敏感生物標記物，測試并計算MSH6基因的相對表達量，能敏感的表達出水體中鎘污染的程度，方法簡單易操作能快速靈敏地檢測出水體污染程度，更好的監測水體污染，使得污染能夠及時治理。為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種用MSH6基因監測水中鎘污染的方法；本發明提供的技術方案為：一種用MSH6基因監測水中鎘污染的方法，用魚作為監測水污染的生物樣本，所述魚的MSH6基因作為監測水中鎘污染的敏感生物標記物。優選的是，建立魚的MSH6基因的相對表達量2-△△Ct與污染濃度關系的標準曲線，獲取與建立標準曲線同類同大小的待測水域的魚，然后將計算得所述待測水域的魚的MSH6基因的相對表達量2-△△Ct與標準曲線比對，獲得污染濃度。優選的是，計算MSH6基因的相對表達量具體包括以下步驟：1)用魚作為監測水污染的生物樣本；2)利用RNA提取試劑，提取魚樣品總RNA，利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈cDNA；3)用實時熒光定量PCR檢測，以首鏈cDNA為模板，分別根據所述MSH6基因的特異性引物，所述內參基因18s-rRNA基因引物，在羅氏PCR儀上進行實時熒光定量PCR擴增反應，熒光定量PCR反應體系為：SYBR試劑12.5μL、上游引物1μL、下游引物R1μL、cDNA2μL、滅菌蒸餾水8.5μL，反應體系總體積為25μL；反應程序采用三步法程序：95℃預變性30s；95℃15s→60℃30s→72℃30s，40個循環；采集熒光信號數值Ct；4)獲得MSH6基因熒光信號數值CtMSH6和內參基因熒光信號數值Ct18s-rRNA后，采取2-△△Ct法進行數據分析，△Ct＝CtMSH6-Ct18s-rRNA，△△Ct＝(CtMSH6-Ct18s-rRNA)測試組-(CtMSH6-Ct18s-rRNA)空白組，MSH6基因的相對表達量＝2-△△Ct，計算2-△△Ct得出MSH6基因的相對表達量。優選的是，通過MSH6基因的相對表達量來監測水污染的程度，2-△△Ct值越大，污染程度越大，反之，2-△△Ct值越小，污染程度越小。優選的是，所述魚為仔魚，將仔魚分成若干組，其中一組作為無污染對照組，其他組為待測水域組；分別將仔魚放入無污染對照水體和待測水域水體中飼養；7天后隨機抽取魚樣品，檢測并計算MSH6相對表達量2-△△Ct，如果待測水域組的2-△△Ct值大于無污染對照組的2-△△Ct值，那么待測水域受到鎘污染，其污染源鎘的濃度與待測水域組的2-△△Ct值成正相關。優選的是，所述MSH6基因的特異性引物為：上游引物如SEQIDNO.1所示：MSH6-F：5’-AGGAGTCGGAAGTAGAAAGC-3’，下游引物如SEQIDNO.2所示：MSH6-R：5’-TCAGGCGAGACTTTGTGTTC-3’；所述魚的內參基因為18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物為：上游引物如SEQIDNO.3所示：18s-rRNA-F：5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’，下游引物如SEQIDNO.4所示：18s-rRNA-R：5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’。優選的是，所述魚的MSH6基因的相對表達量與所述水中鎘污染的濃度呈正相關。優選的是，所述魚為海水青鳉或淡水青鳉。優選的是，所述仔魚均為10天齡幼魚。本發明至少包括以下有益效果：1)MSH6基因作為監測水污染的敏感生物標記物，測試MSH6基因的相對表達量，來監測水體污染的程度，該方法能靈敏反應出水體是否污染及污染程度，甚至能敏感的表達出微量污染源的水體污染；同時也能從生物的角度敏感地監測重金屬鎘污染的危害性和危害程度，為水體生態環境監測、毒理診斷、調控和防治提供準確、快速的科學方法。2)魚的MSH6為修復蛋白6基因能敏感反應水中微量的鎘污染，MSH6基因作為監測水污染的敏感生物標記物，同時MSH6相對表達量能敏感的表達出水中重金屬鎘的濃度呈正相關，該基因對其他污染源具有相對的穩定性，能單一準確表達出水中鎘的污染，這樣為監測、控制和治理水污染提供很便利的條件。本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。具體實施方式結合下面實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。實施例11、水污染魚生物樣本飼養準備采用海水青鳉仔魚作為監測水污染的生物樣本，將仔魚分成10組，每組3個平行進行養魚實驗，各組分別在表1所述的鎘濃度水體中飼養，其中0濃度的作為無污染對照組，飼養7天后隨機采集各組魚樣品測定。飼養7天后，每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3＝9個數據，將每組9個數據數理統計后得到各組魚的MSH6基因的相對表達量結果。表110組仔魚飼養的水體鎘濃度實驗序號對照組123456789鎘濃度(μg/L)0801602403204004805606407202、利用RNA提取試劑，提取魚樣品總RNA，利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈cDNA；(1)快速稱取冷凍的幼魚100mg左右，記錄實際重量為M，然后放入提前預冷的研缽中倒入液氮，用研杵研磨稱量好的幼魚樣品，直至研磨成粉末狀，然后用不銹鋼小藥匙迅速將樣品粉末移入冰浴中的玻璃勻漿管底部。(2)用移液槍往玻璃勻漿管中加入0.6mLRNAiso試劑，充分勻漿至勻漿液呈無顆粒透明狀后，將勻漿液轉入1.5ml離心管中。然后再向勻漿管中加入0.2mLRNAiso試劑，洗滌勻漿棒和勻漿管管壁一次，之后將勻漿液轉入之前的離心管中，重復上述操作一次，使加入的RNAiso試劑總體積為1mL。蓋好離心管并顛倒混勻數次后室溫靜置5min。(3)用1000μL微量移液槍往上一步的1.5mL離心管中加入200μL氯仿，蓋緊離心管蓋，混勻至溶液乳化后，再室溫靜置5min。(4)轉移至高速冷凍離心機中12000g，4℃，離心15min。(5)小心從離心機中取出離心管，用1000μL微量移液器吸取500μL上清液至一個新的1.5ml離心管中。(6)然后往新的1.5mL離心管中加入500μL異丙醇，蓋好離心管并充分顛倒混勻，室溫靜置10min。(7)轉移至高速冷凍離心機中12000g，4℃，離心10min。(8)將1.5mL離心管中上清液倒掉，再12000g，4℃，離心1min，用小槍頭(100μL)將上清液吸凈。(9)往離心管中加入現配的預冷的75％乙醇1ml(無水乙醇3：1DEPC水)，蓋好離心管并輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁及RNA，再12000g，4℃，離心1min后小心去除乙醇。(10)在超凈工作臺中打開離心管蓋，室溫干燥沉淀10min，加入50μLDEPC處理水溶解沉淀，靜置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20℃冰箱保存，待用。(11)使用ThermoScientificNanodrop2000c測定總的RNA的含量，獲得測定濃度，RNA含量的計算公式：樣品RNA濃度(μg/mg)＝測定濃度(ng/μl)×50×1000÷M。(12)用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，若測定的OD260/OD280值在1.9～2.1之間，且總RNA電泳條帶清晰呈現為28S，18S和5S三條帶，28S的條帶亮度約為18S的兩倍，說明RNA純度和濃度符合要求，可繼續進行后續實驗；(13)利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈cDNA；a)逆轉錄：用普通PCR儀將RNA反轉錄成首鏈cDNA，按照表2配制反轉錄反應液。表2反轉錄反應液組成反應液配制方法：配置前先根據反轉錄樣品的數量計算出各反應液實際需要量，統一加入無菌離心管中混合均勻，然后分裝到各個反應管中，最后添加樣品并小心點動離心混勻，使反應更加充分并減少誤差。配制過程需在冰浴且無菌體系中進行，反轉錄反應條件：50℃，20min→95℃，5min→5℃，5min→15℃，15min。3、用實時熒光定量PCR檢測目的基因(1)引物設計所述Shh基因的特異性引物為：上游引物為：MSH6-F：5’-AGGAGTCGGAAGTAGAAAGC-3’，(SEQIDNO.1)下游引物為：MSH6-R：5’-TCAGGCGAGACTTTGTGTTC-3’；(SEQIDNO.2)所述魚的內參基因為18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物為：上游引物為：18s-rRNA-F：5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’，(SEQIDNO.3)下游引物為：18s-rRNA-R：5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’；(SEQIDNO.4)(2)PCR檢測目的基因PCR擴增反應用普通PCR儀擴增cDNA，按表3配制PCR反應液：表3PCR反應液組成根據反轉錄樣品數量計算各PCR反應試劑用量，配制反應混合液，點動離心混勻，然后分裝到RT-PCR反應結束后的PCR反應管中，再點動離心混勻。反應結束后，將PCR管保存于4℃冰箱保存，待用。PCR擴增反應條件：95℃，1min→(94℃，30sec→60℃，30sec→72℃，1min40個循環)→72℃，5min→15℃，pause。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，條件為100V，30min。若PCR反應產物的條帶單一，出現位置在100bp-200bp之間，可初步確定PCR產物為目的基因。PCR產物純化與濃縮，PCR產物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測符合實驗要求后，取經純化濃縮后的PCR產物測序，測序結果經BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比對后，確定PCR擴增產物是目的基因片段，方可進行后續的熒光定量實驗。本實驗采用的是TaKaRa公司的PremixExTaqTM(PerfectRealTime)試劑盒，本試劑盒是在PCR擴增合成雙鏈DNA的過程中，熒光分子GreenI與雙鏈DNA結合能夠發出熒光信號，通過連續監測熒光信號出現的先后順序以及信號的強弱變化，來及時分析目的基因MSH6的拷貝數目，從而對目的基因的表達量進行實時準確定量。實時熒光定量PCR的反應體系如表4：表4RTQ-PCR反應體系組成RTQ-PCR反應體系的配制必須在冰浴無菌條件下進行，試劑使用前需點動離心混勻后才能使用，反應液配制、分裝均要使用無菌的新槍頭，以避免污染，而且配制的速度要快，以免其中的反應酶失活。反應試劑添加完成后，使用配有八聯管轉頭的臺式離心機短暫離心，確保試劑沉積在管底。熒光定量反應條件：95℃預變性30s；95℃15s→60℃30s→72℃30s，40個循環；采集熒光信號數值Ct；獲得MSH6基因熒光信號數值CtMSH6和內參基因熒光信號數值Ct18s-rRNA后，采取2-△△Ct法進行數據分析，△Ct＝CtMSH6-Ct18s-rRNA，△△Ct＝(CtMSH6-Ct18s-rRNA)測試組-(CtMSH6-Ct18s-rRNA)空白組，MSH6基因的相對表達量＝2-△△Ct，計算2-△△Ct得出MSH6基因的相對表達量；測定并經數理統計的結果如表5所示：表510組魚樣品的MSH6基因的相對表達量2-△△Ct實驗序號對照組123456789鎘濃度(μg/L)080160240320400480560640720MSH62-△△Ct1.371.451.591.802.172.723.294.084.655.49受到水域中重金屬鎘的污染脅迫，魚樣本生理機能發生變化，通過MSH6基因的相對表達量來監測水污染的程度，2-△△Ct值越大，重金屬鎘濃度大，很直觀的說明水域受污染的程度越大，反之2-△△Ct值越小，重金屬鎘濃度越小，說明水域受污染的程度越小，測試組的2-△△Ct值大于對照組的2-△△Ct值時說明水體已經受鎘污染，而且2-△△Ct值越大污染越嚴重。通過表5的數據結構建立魚的MSH6基因的相對表達量2-△△Ct與鎘濃度關系的標準曲線，獲取與建立標準曲線同類同大小的待測水域的魚，然后將計算得所述待測水域的魚的MSH6基因的相對表達量2-△△Ct與標準曲線比對，獲得鎘濃度大小。實施例21、水污染魚生物樣本飼養準備采用10天齡海水青鳉仔魚作為監測水污染的生物樣本，將仔魚分成2組，每組3個平行進行養魚實驗，這2組分為無污染對照組與待測水域組，將仔魚分別放入無污染水體和待測水域水體中飼養，7天后，每個平行隨機取3尾魚樣品測定，每組測定3x3＝9個數據，將每組9個數據數理統計后得到各組魚的結果；2、利用RNA提取試劑，提取魚樣品總RNA，利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈cDNA；(1)快速稱取冷凍的幼魚100mg左右，記錄實際重量為M，然后放入提前預冷的研缽中倒入液氮，用研杵研磨稱量好的幼魚樣品，直至研磨成粉末狀，然后用不銹鋼小藥匙迅速將樣品粉末移入冰浴中的玻璃勻漿管底部。(2)用移液槍往玻璃勻漿管中加入0.6mLRNAiso試劑，充分勻漿至勻漿液呈無顆粒透明狀后，將勻漿液轉入1.5ml離心管中。然后再向勻漿管中加入0.2mLRNAiso試劑，洗滌勻漿棒和勻漿管管壁一次，之后將勻漿液轉入之前的離心管中，重復上述操作一次，使加入的RNAiso試劑總體積為1mL。蓋好離心管并顛倒混勻數次后室溫靜置5min。(3)用1000μL微量移液槍往上一步的1.5mL離心管中加入200μL氯仿，蓋緊離心管蓋，混勻至溶液乳化后，再室溫靜置5min。(4)轉移至高速冷凍離心機中12000g，4℃，離心15min。(5)小心從離心機中取出離心管，用1000μL微量移液器吸取500μL上清液至一個新的1.5ml離心管中。(6)然后往新的1.5mL離心管中加入500μL異丙醇，蓋好離心管并充分顛倒混勻，室溫靜置10min。(7)轉移至高速冷凍離心機中12000g，4℃，離心10min。(8)將1.5mL離心管中上清液倒掉，再12000g，4℃，離心1min，用小槍頭(100μL)將上清液吸凈。(9)往離心管中加入現配的預冷的75％乙醇1ml(無水乙醇3：1DEPC水)，蓋好離心管并輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁及RNA，再12000g，4℃，離心1min后小心去除乙醇。(10)在超凈工作臺中打開離心管蓋，室溫干燥沉淀10min，加入50μLDEPC處理水溶解沉淀，靜置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20℃冰箱保存，待用。(11)使用ThermoScientificNanodrop2000c測定總的RNA的含量，獲得測定濃度，RNA含量的計算公式：樣品RNA濃度(μg/mg)＝測定濃度(ng/μl)×50×1000÷M。(12)用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，若測定的OD260/OD280值在1.9～2.1之間，且總RNA電泳條帶清晰呈現為28S，18S和5S三條帶，28S的條帶亮度約為18S的兩倍，說明RNA純度和濃度符合要求，可繼續進行后續實驗；(13)利用反轉錄試劑將RNA反轉錄合成首鏈cDNA；a)逆轉錄：用普通PCR儀將RNA反轉錄成首鏈cDNA，按照表2配制反轉錄反應液。表2反轉錄反應液組成反應液配制方法：配置前先根據反轉錄樣品的數量計算出各反應液實際需要量，統一加入無菌離心管中混合均勻，然后分裝到各個反應管中，最后添加樣品并小心點動離心混勻，使反應更加充分并減少誤差。配制過程需在冰浴且無菌體系中進行，反轉錄反應條件：50℃，20min→95℃，5min→5℃，5min→15℃，15min。4、實時熒光定量PCR檢測目的基因(1)引物設計所述Shh基因的特異性引物為：上游引物為：MSH6-F：5’-AGGAGTCGGAAGTAGAAAGC-3’，(SEQIDNO.1)下游引物為：MSH6-R：5’-TCAGGCGAGACTTTGTGTTC-3’；(SEQIDNO.2)所述魚的內參基因為18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物為：上游引物為：18s-rRNA-F：5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’，(SEQIDNO.3)下游引物為：18s-rRNA-R：5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’；(SEQIDNO.4)(2)PCR檢測目的基因PCR擴增反應用普通PCR儀擴增cDNA，按表3配制PCR反應液：表3PCR反應液組成根據反轉錄樣品數量計算各PCR反應試劑用量，配制反應混合液，點動離心混勻，然后分裝到RT-PCR反應結束后的PCR反應管中，再點動離心混勻。反應結束后，將PCR管保存于4℃冰箱保存，待用。PCR擴增反應條件：95℃，1min→(94℃，30sec→60℃，30sec→72℃，1min，40個循環)→72℃，5min→15℃，pause。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，條件為100V，30min。若PCR反應產物的條帶單一，出現位置在100bp-200bp之間，可初步確定PCR產物為目的基因。PCR產物純化與濃縮，PCR產物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測符合實驗要求后，取經純化濃縮后的PCR產物測序，測序結果經BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比對后，確定PCR擴增產物是目的基因片段，方可進行后續的熒光定量實驗。本實驗采用的是TaKaRa公司的PremixExTaqTM(PerfectRealTime)試劑盒，本試劑盒是在PCR擴增合成雙鏈DNA的過程中，熒光分子GreenI與雙鏈DNA結合能夠發出熒光信號，通過連續監測熒光信號出現的先后順序以及信號的強弱變化，來及時分析目的基因MSH6的拷貝數目，從而對目的基因的表達量進行實時準確定量。實時熒光定量PCR的反應體系如表4：表4RTQ-PCR反應體系組成RTQ-PCR反應體系的配制必須在冰浴無菌條件下進行，試劑使用前需點動離心混勻后才能使用，反應液配制、分裝均要使用無菌的新槍頭，以避免污染，而且配制的速度要快，以免其中的反應酶失活。反應試劑添加完成后，使用配有八聯管轉頭的臺式離心機短暫離心，確保試劑沉積在管底。熒光定量反應條件：95℃預變性30s；95℃15s→60℃30s→72℃30s，40個循環；采集熒光信號數值Ct；采用上述參數，多次循環測試，相對其他參數來說采集到的熒光信號數值Ct誤差小；獲得MSH6基因熒光信號數值CtMSH6和內參基因熒光信號數值Ct18s-rRNA后，采取2-△△Ct法進行數據分析，△Ct＝CtMSH6-Ct18s-rRNA，△△Ct＝(CtMSH6-Ct18s-rRNA)測試組-(CtMSH6-Ct18s-rRNA)空白組，MSH6基因的相對表達量＝2-△△Ct，計算2-△△Ct得出MSH6基因的相對表達量，采取2-△△Ct法進行數據分析能減少誤差，能夠準確表述MSH6基因的相對表達量從而精準反映出水污染程度；檢測結果：對照組的2-△△Ct值為2.68，待測組的2-△△Ct值為3.25，結果顯示對照組的2-△△Ct值小于待測組的2-△△Ct值，所述待測水域已經受到了重金屬鎘污染，需及早進行水域治理，并且生物監測水污染的同時也能表達出污染對生物體的危害程度，而化學的方法測試鎘一般采用原子分光光度計法測試，原子分光光度計法先做標準曲線，然后制作樣品再測試樣品的吸光度后，在標準曲線上找去相應濃度，該方法誤差大，并且只適合較大濃度測試，微量級濃度無法測試出。本發明所提到的空白組為所使用的試劑盒的空白對照，目的是為了減小誤差。盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地改作他用，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實施例。當前第1頁1 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