一種偶聯抗體的仿生免疫磁球及其制備方法與流程

本發明涉及一種偶聯抗體的仿生免疫磁球及其制備方法，屬于納米材料技術領域。

背景技術：

根據2014年世界衛生組織發布的《世界癌癥報告》，2012年有1400萬人被診斷患癌，預測到2035年這個數據將增至2400萬。癌癥已成為嚴重威脅人類生命健康的一類疾病，超過90％患者的死亡源于腫瘤轉移。在腫瘤轉移過程中，循環腫瘤細胞(CTC)扮演著非常重要的角色，這類豐度極低的癌細胞從腫瘤原發灶脫落并進入外周血循環。檢測CTC可以為腫瘤轉移、腫瘤預后、療效監控提供參考。然而分離和檢測CTC非常具有挑戰性，CTC在血液中出現概率約為1個CTC/10⁹個血細胞(白細胞：3×10⁶mL^-1～10×10⁶mL^-1，紅細胞：3×10⁹mL^-1～9×10⁹mL^-1，血小板：2.5×10⁸mL^-1～4×10⁸mL^-1)。

CTC富集技術主要包括免疫磁珠富集、密度梯度離心以及膜過濾等，其中，免疫磁珠富集技術應用最為廣泛。與早期的微米磁珠相比，納米磁珠比表面積高、分散性好，并且可以避免細胞活化，無需解離磁珠，可以直接進行后續實驗。其中，超順磁納米磁珠在外加磁場作用下具有磁性，而在外加磁場移除后不具有磁性，這使得其在溶液中呈單分散態、不易團聚。超順磁顆粒分散性好，是超順磁納米磁珠高效捕捉CTC的一大優勢。為了保證磁顆粒的超順磁性，傳統的磁顆粒粒徑小(約10nm)、磁性弱且難操縱，商業化系統如(Veridex公司)和(德國美天旎公司)需要特殊的儀器來提高外加磁場強度，從而實現磁分離。此外，磁富集技術還存在白細胞的非特異性吸附問題。例如：系統是唯一被食品藥品監督局(FDA)批準用于轉移性乳腺癌、結直腸癌或前列腺癌檢測CTC的技術，通過結合特異性抗體的磁流體靶向CTC表面的EpCAM(上皮細胞黏附分子)抗原，然后在特定磁場的作用下分離CTC，但系統對白細胞有明顯的非特異性吸附(1000個～3000個/7.5mL)，不利于下游的CTC分析。

技術實現要素：

針對現有技術存在的缺陷，本發明的目的之一在于提供一種偶聯抗體的仿生免疫磁球，所述仿生免疫磁球能在復雜的血液環境中高效捕捉極低豐度的循環腫瘤細胞、同時降低白細胞背景，為循環腫瘤細胞的檢測、研究提供有力的手段。

本發明的目的之二在于提供一種偶聯抗體的仿生免疫磁球的制備方法。

為實現本發明的目的，提供以下技術方案。

一種偶聯抗體的仿生免疫磁球，所述仿生免疫磁球以水溶性Fe₃O₄納米團簇為核，其外包覆細胞膜，在細胞膜外共價偶聯有具有修飾基團的抗體；

所述Fe₃O₄納米團簇由Fe₃O₄納米單晶和聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)組成，帶正電荷，粒徑為30nm～196nm；

所述抗體為Fc端具有賴氨酸殘基的抗體；

所述修飾基團為DBCO-PEG_n-NHS，n＝1～2000，優選n＝4；

所述修飾基團通過環炔化修飾與抗體上的氨基偶聯。

其中，優選所述Fe₃O₄納米團簇的粒徑為81nm；

優選所述細胞膜為白細胞系J774A.1的細胞膜。

一種本發明所述偶聯抗體的仿生免疫磁球的制備方法，所述制備方法步驟如下：

步驟一、Fe₃O₄納米團簇(簡稱為MNC)的制備

(1)在無氧環境下，將NaOH完全溶解到二乙二醇(Diethylene glycol,DEG)中，制備得到NaOH儲存液；

其中，無氧環境可通過采用惰性氣體脫氧處理和保護實現；

可加熱至100℃～150℃使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解時停止加熱；

可將NaOH儲存液保持在50℃～100℃下儲存備用；

優選加熱至120℃使NaOH完全溶解到DEG中；

優選將NaOH儲存液保持在70℃下儲存備用；

優選NaOH儲存液采用如下方法制備：

將DEG在惰性氣體的環境下做脫氧處理，待氧氣清除完全后，將NaOH溶解到DEG中，同時加熱，升溫至120℃，直到NaOH完全溶解時停止加熱，所述制備過程全程都需惰性氣體保護，得淺黃色溶液為NaOH儲存液，保持在70℃下儲存備。

(2)將鐵源、PEI與溶劑混合均勻后抽真空5min～30min，然后填充氬(Ar)氣保護，加熱至100℃～180℃，加入步驟一(1)所得的NaOH儲存液，至溶液中NaOH的濃度為0.03mol/L～0.4mol/L，待溶液顏色變成黑色后加熱至190℃～230℃，繼續冷凝回流30min～2h，反應結束，得到含有帶正電荷的MNC的反應液；

待含有帶正電荷的MNC的反應液冷卻后，磁分離，移去反應液，將磁分離產物超聲洗滌，再磁分離，移去反應液，得到磁分離終產物為MNC，將MNC懸浮于去離子水中制備得到MNC溶液；

其中，所述溶劑為DEG，或DEG和乙二醇(Ethylene gl ycol,EG)的混合液，所述混合液中EG與DEG的體積比為1:14～1:4，優選為2:13；

所述鐵源為含有Fe²⁺，常溫下穩定、能夠在所述溶劑中溶解且不發生反應的物質，優選為FeSO₄·7H₂O或FeCl₂·4H₂O；

所述PEI作為交聯劑和穩定劑使用；

鐵源與PEI的質量比為1:60～128:60；

優選混合均勻后抽真空25min；

優選加熱至160℃，再加入步驟一(1)所得的NaOH儲存液；

優選加熱至220℃繼續冷凝回流1h，反應結束；

優選將磁分離產物先分散于無水乙醇中超聲洗滌，再分散于去離子水中超聲洗滌；更優選在無水乙醇中反復超聲洗滌3次，在去離子水中反復超聲洗滌5次；

可根據需要，通過調節抽真空的時間或NaOH儲存液加入量制備不同粒徑大小的MNC。

步驟二、修飾有疊氮膽堿的細胞膜碎片(簡稱為M)的制備

將細胞在細胞培養完全培養基中培養20h～28h，換入含有0.1mM～0.4mM疊氮膽堿(N₃)的細胞培養完全培養基中培養22h～28h，收集細胞，重新懸浮于緩沖溶液中，用勻漿機對重新懸浮于緩沖溶液中的細胞進行間歇破碎，采用蔗糖密度梯度離心對所述間歇破碎后的細胞碎片進行分離提取，得到M；將M溶解于Hepes C緩沖液(購于賽默飛世爾科技公司)中，得到M溶液。

其中，優選在37℃，CO₂濃度為5％的恒溫培養箱中培養；

優選在細胞培養完全培養基中培養24h；

優選換入含有N₃的細胞培養完全培養基中培養24h；

優選所述細胞培養完全培養基為內含10％體積分數胎牛血清(FBS)、60μg/mL青霉素和100μg/m鏈霉素的DMEM完全培養基；

優選含有N₃的細胞培養完全培養基中含有0.1mM的N₃；

優選用Dispersers and Shakers勻漿機2檔對收集的細胞進行間歇破碎。

步驟三、偶聯抗體的仿生免疫磁球的制備

(1)將MNC溶液、M溶液和磷酸緩沖鹽溶液(PBS)混合，用混懸儀于恒溫培養箱中反應4h～24h，磁分離，棄掉反應液，將磁分離產物，即仿生磁球重懸在PBS中，得到仿生磁球溶液；

其中，M相對于MNC過量；

優選用混懸儀于4℃恒溫培養箱中反應12h；

仿生磁球溶液可于4℃保存待用。

(2)將修飾基團與抗體在PBS中混合得到混合液，將混合液孵育，除去未反應的修飾基團和抗體小分子，制備得到帶有環炔化修飾基團的抗體的溶液。

其中，修飾基團與抗體摩爾比為10:1～100:1，優選為50:1；

優選混合液在4℃孵育2h～12h；

除去未反應的修飾基團和抗體小分子可采用超濾或透析，優選在4℃，7000r/min下，在超濾管中超濾30min；

帶有環炔化修飾基團的抗體的溶液可于4℃保存。

(3)將仿生磁球溶液和帶有環炔化修飾基團的抗體溶液在PBS中混合，并在4℃～37℃混懸1h～4h，發生點擊化學反應，仿生磁球偶聯上帶有環炔化修飾基團的抗體，得到本發明所述的一種偶聯抗體的仿生免疫磁球。

其中，環炔化修飾基團的抗體相對仿生磁球過量；

優選在37℃混懸1h。

有益效果

1.本發明提供了一種偶聯抗體的仿生免疫磁球，所述仿生免疫磁球分散性好且磁響應迅速，膜流動性賦予其更高的識別效率。將所述仿生免疫磁球加入模擬血樣中，37℃孵育15min，即可抓出約90％的腫瘤細胞且背景中幾乎沒有白細胞，捕捉到的細胞活性好，不需要釋放磁球就可以用于后續培養和進一步研究；

2.本發明提供了一種偶聯抗體的仿生免疫磁球的制備方法，所述制備方法原料來源廣泛，在仿生免疫磁球構建上具有普適性，可以制備針對不同細胞的仿生免疫磁球。

附圖說明

圖1為實施例2中M的共聚焦表征。

圖2為實施例5步驟(1)制備得到的仿生磁球的表征結果：A為MNC的透射電子顯微鏡圖；B為仿生磁球的透射電子顯微鏡圖。

圖3為實施例5步驟(2)中帶有環炔化修飾基團的抗體的MALDI-TOF圖。

圖4為實施例5中的仿生磁球、偶聯抗體的仿生免疫磁球的共聚焦驗證。

圖5為實施例9對實施例5制備得到的IMSs捕捉CTC的反應濃度(A)和時間(B)的優化結果。

圖6為實施例9步驟(3)中IMSs在模擬血樣中捕捉循環腫瘤細胞的免疫染色鑒定結果。

圖7為實施例9步驟(4)中IMSs和商業化磁珠beads背對背比較結果。A捕捉率比較(腫瘤細胞濃度為10⁵個/mL，1ⅹPBS體系)；B靈敏度比較(腫瘤細胞濃度為5-1500個/mL，1ⅹPBS體系)；C白細胞背景比較。

圖8為實施例9步驟(5)中用鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein AM)和紅色乙錠二聚體-1(EthD-1)對捕捉的腫瘤細胞的共聚焦圖片。

具體實施方式

以下實例僅用于進一步說明本發明，但不應理解為本發明的實施只局限于這些說明，對于本發明所屬技術領域的技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干推演或替換。

以下所述磁分離具體采用方法為：使用磁吸附，將反應液用移液槍除去，獲得剩余物質即為磁分離產物。

無定形碳膜銅網為D200，購自北京達濟科儀科技有限公司；

Hepes B緩沖液和Hepes C緩沖液均購自賽默飛世爾科技公司；

蛋白酶抑制劑購自羅氏公司；

所述細胞培養完全培養基為內含10％體積分數胎牛血清(FBS)、60μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養基，購自Gibco；

環炔化的染料DBCO-Fluor-525購自Click Chemistry Tools；

Anti-EpCAM抗體購自Biolegend；

FITC熒光標記的二抗購自Abcam公司；

PE標記的抗人(anti-human)CK18(腫瘤細胞標志物)抗體、FITC標記的抗人(anti-human)CD45(白細胞表面標志物)抗體購自Santa Cruze；

Hoechst 33342購自邁晨科技有限公司；

LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit購自Invitrogen；

透射電子顯微鏡(TEM)采用日本電子株式會社(JEOL)的JEM-2100F或JEM-1400；

能譜儀(EDS)采用牛津儀器公司的Aztec；

X射線衍射(XRD)儀采用XPert PRO MPD,PANalytical，荷蘭；

紅外光譜(FTIR)儀采用JASCO公司的FT/IR660；

勻漿機采用德國IKA公司的Dispersers and Shakers勻漿機，T18；

離心機和離心管均購自美國貝克曼庫爾特有限公司(Beckman Coulter,Inc.)，離心機采用Beckman Coulter L-100XP Ultracentrifuge；

MALDI-TOF采用AXIMA-Pertomance，SHIMADZU，日本；

激光共聚焦顯微鏡采用UltraVIEW VoX，PerkinElmer，美國；

流式細胞儀采用Beckman Coulter,cyan；

beads購自德國美天旎公司。

實施例1MNC的制備

(1)將DEG在Ar氣的環境下，待氧氣清除完全后，將固體NaOH溶解到DEG中，同時加熱，升溫至120℃，直到固體NaOH完全溶解時停止加熱，所述制備過程全程都用Ar氣保護，制備得到淺黃色溶液，為NaOH儲存液，濃度為1g/mL，保持在70℃下儲存備用；

(2)將FeSO₄·7H₂O、PEI與DEG混合均勻后抽真空，之后填充Ar氣保護；加熱升溫至160℃，加入步驟一(1)所得的NaOH儲存液，至溶液中NaOH的摩爾濃度為0.03mol/L，約3min后溶液顏色變成黑色，然后升溫至220℃，繼續冷凝回流1h，反應結束，得到含有帶正電荷的MNC的反應液；

待含有帶正電荷的MNC的反應液冷卻后，磁分離，移去反應液，將磁分離產物分散于無水乙醇中超聲洗滌，反復3次，磁分離，將磁分離產物分散于去離子水中，超聲洗滌5次，得到磁分離終產物，為MNC；將MNC溶解于10mL去離子水中，得到MNC溶液，濃度為0.0128g/mL；其中，FeSO₄·7H₂O與PEI的質量比為1:60。

可根據需要，在其他制備條件不變的情況下，通過調節抽真空的時間制備不同粒徑大小的MNC，如表1所示：

表1

對制備得到的MNC溶液進行測試表征實驗如下：

Ⅰ、分別取實施例1制得的不同粒徑的MNC溶液各10μL，分別分散在1mL去離子水中，得到稀釋后的MNC溶液，取10μL稀釋后的MNC溶液分別滴在無定形碳膜銅網載體，經干燥后，通過透射電子顯微鏡(JEM-2100F)進行觀察，可觀察到在抽真空時間為30min、25min、20min、15min和5min時，獲得MNC平均粒徑依次為31nm、81nm、110nm、140nm和196nm；同時，可觀察到所述MNC的分散性良好且粒徑較均一；對平均粒徑為81nm的MNC進行觀察可知，平均粒徑為81nm的MNC并不是一個完整的單晶顆粒，而是由許多粒徑約為11nm的Fe₃O₄單晶構成的團簇，同時還可以觀察到外部模糊的PEI層，通過測量相鄰晶面的間距為0.29nm，與面心立方結構的Fe₃O₄晶體(220)晶面的晶格間距一致。

Ⅱ、將平均粒徑為81nm的MNC用能譜儀分析，結果可見其元素組成為C、O、Fe，有未標出的峰來源于無定形碳膜銅網載體。

分別取實施例1制得的不同粒徑的MNC各0.5g，分別采用X射線衍射(XRD)儀進行X射線衍射測試，采用波長為0.15406nm的Cu-Kα射線采集數據，衍射角2θ為25°～70°，得到相應的衍射圖譜結果，結果顯示平均粒徑粒徑為31nm、81nm、110nm、140nm和196nm的MNC衍射曲線中出現特征峰的2θ角依次分別為30.4°、35.6°、43.4°、53.4°、57.4°和62.7°，與JCPDS卡片對比后證明該所述特征峰的峰型為Fe₃O₄晶體的特征衍射峰，分別所對應的Fe₃O₄晶面依次為(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)，沒有雜峰，衍射峰較尖銳，表明所述MNC結晶度較高。

Ⅲ、將平均粒徑為81nm的MNC經真空干燥，取少量與KBr晶體研磨，經壓片處理后制得樣品，將樣品采用紅外光譜(FTIR)儀進行紅外光譜分析，由分析結果可知在波數為586.70cm^-1處有吸收峰，峰型尖銳，為Fe-O鍵特征吸收峰；1613.76cm^-1處為氨基中N-H鍵彎曲振動吸收峰，1053.07cm^-1為C-N鍵伸縮振動吸收峰；游離氨基在3500cm^-1～3400cm^-1處應有兩條明顯吸收帶，但是在3418.20cm^-1處只有一個寬而強的吸收峰，證明PEI包裹在MNC表面致使其化變化而導致兩條吸收峰變為一條。

Ⅳ、所述MNC具有很強的磁可操縱性，分別取所述不同粒徑的MNC分散于水中，分別通過磁鐵磁分離，僅約10s即可完全富集分離，溶液由黑色變澄清。

Ⅴ、常溫下(300K)，將所述不同粒徑的MNC，真空干燥后，進行振動樣品磁強計(VSM)測試后得到磁化曲線，平均粒徑為31nm、81nm、110nm、140nm和196nm的MNC所對應的比飽和磁化強度分別依次為61.99emu/g、71.39emu/g、73.05emu/g、76.37emu/g及80.78emu/g，數值隨著平均粒徑的增大而增大；同時可以看出磁化曲線都為“S”型，剩磁和矯頑力都為0，說明，常溫下盡管MNC粒徑在24.8nm以上，但仍表現超順磁性。

實施例2M的制備

將白細胞J774A.1細胞系置于37℃，CO₂濃度為5％的恒溫培養箱中，用細胞培養完全培養基培養24h，分別換入含有0.1mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基中繼續培養24h，收集白細胞，棄掉培養基。

將收集到的白細胞用pH 7.6的Hepes B緩沖液重新懸浮，加入10μL/mL的蛋白酶抑制劑，用勻漿機2檔間歇破碎細胞，破碎2min，停1min，重復10次，然后1000r/min離心3min，收集上清，沉淀用加了10μL/mL蛋白酶抑制劑的Hepes B緩沖液重新懸浮，用勻漿機破碎細胞，破碎2min，停1min，重復10次，然后1000r/min離心3min，收集上清，上清液同樣懸浮于含蛋白酶抑制劑的Hepes B緩沖液中，兩次上清液混入最后一次的細胞破碎液，得到在緩沖溶液中破碎后的白細胞碎片，采用蔗糖密度梯度離心進行分離提取，得到M，將M溶解于Hepes C緩沖液，得到M溶液。

所述蔗糖密度梯度離心具體為：在離心管中，從下到上依次鋪設質量分數分別為55％、40％和30％的蔗糖溶液，4℃靜置4h；加入M溶液，使用離心機在4℃、28000g離心2h，離心管中出現三個梯度的條帶，由上向下依次為質量分數為55％、40％和30％的條帶，分別收集所述條帶，分別用Hepes C緩沖液重新懸浮分離在質量分數為55％、40％和30％的蔗糖溶液中，用離心機在4℃，28000g離心30min進行脫糖處理，得到沉淀為M。

對M采用進行蛋白斑點雜交試驗，具體方法為：將所述三個條帶分別每個取5μL樣品依次點在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，風干后用質量分數為1％的羊血清封閉過夜，將封閉好的PVDF膜浸泡至用PBS稀釋過的一抗CD45溶液中，CD45與PBS的體積比為1:200，震蕩孵育1h后取出，用Tris-Buffered Saline Tween-20(TBST)緩沖液震蕩洗3次，再將PVDF膜浸泡至用PBS稀釋過的辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠二抗溶液中，所述二抗與PBS的體積比為1:2000，震蕩孵育1h后取出，用TBST緩沖液震蕩洗3次，最后將PVDF膜浸泡在DAB溶液中震蕩孵育10min～30min，之后取出PVDF膜，用去離子水沖洗后晾干，在凝膠成像儀上觀察膜上的斑點。PVDF膜出現由上向下三個斑點，依次對應質量分數為55％、40％和30％的條帶，可見質量分數為40％的條帶對應斑點的顏色最深，效果最好，因此選擇40％蔗糖濃度梯度分離提取的M包覆MNC。

對制備得到的M溶液進行測試表征實驗如下：

Ⅰ、利用點擊化學(Click)反應，使環炔化的染料(DBCO-Fluor-525)標記白細胞膜，通過激光共聚焦顯微鏡對所述J774A.1細胞的疊氮化進行表征，具體步驟如下：將白細胞J774A.1細胞系置于37℃，CO₂濃度為5％的恒溫培養箱中，用細胞培養完全培養基培養24h，分別換入含有0.1mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基繼續培養24h。

棄掉培養液，加入1mL的體積分數為4％的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，用PBS洗滌兩次；之后加入10μM的DBCO-Fluor-525染料，37℃孵育1h后，倒掉染料，再PBS洗滌2次后，加入PBS獲得樣品溶液，進行激光共聚焦熒光成像。

含有0.1mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基培養的細胞的細胞膜上的疊氮膽堿可與DBCO-Fluor-525發生點擊化學反應，因此激光共聚焦熒光成像有紅色熒光信號，如圖1中的右圖(N₃-J774A.1+DBCO-Fluor 525)所示。

對照實驗1：將白細胞J774A.1細胞系置于37℃，CO₂濃度為5％的恒溫培養箱中，用細胞培養完全培養基培養48h。

棄掉培養液，加入1mL的體積分數為4％的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，用PBS洗滌兩次，加入PBS獲得樣品溶液，進行激光共聚焦熒光成像及流式細胞儀表征熒光強度檢測，結果顯示，激光共聚焦熒光成像圖無紅色熒光信號，如圖1中的左圖(J774A.1)所示。

對照實驗2：將白細胞J774A.1細胞系置于37℃，CO₂濃度為5％的恒溫培養箱中，用細胞培養完全培養基培養48h。

棄掉培養液，加入1mL的體積分數為4％的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，用PBS洗滌兩次；之后加入10μM的DBCO-Fluor-525染料，37℃孵育1h后，倒掉染料，再PBS洗滌2次后，加入PBS獲得樣品溶液，進行激光共聚焦熒光成像，結果顯示因細胞膜上無疊氮膽堿，不能與DBCO-Fluor-525發生點擊化學反應，但因DBCO-Fluor-525少量非特異吸附在細胞上，因此激光共聚焦熒光成像圖有較弱的熒光信號，如圖1中的中間圖(J774A.1+DBCO-Fluor525)所示。

實施例3M的制備

將白細胞J774A.1細胞系置于37℃，CO₂濃度為5％的恒溫培養箱中，用細胞培養完全培養基培養20h，換入含有0.1mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基中繼續培養22h，收集白細胞，棄掉培養基，其余制備方法及對照實驗同實施例2。

對制備得到的M溶液和M-溶液進行測試表征實驗及結果與實施例2類似。實施例4M的制備

將白細胞J774A.1細胞系置于37℃，CO₂濃度為5％的恒溫培養箱中，用細胞培養完全培養基培養28h，換入含有0.1mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基中繼續培養28h，收集白細胞，棄掉培養基，其余制備方法及對照實驗同實施例2。

對制備得到的M溶液和M-溶液進行測試表征實驗及結果與實施例2類似。實施例5偶聯抗體的仿生免疫磁球的制備

(1)將實施例1制得的平均粒徑為81nm的MNC溶液(其中Fe含量為50μg)、實施例2制得的M溶液200μL和PBS 2mL混合，用混懸儀于4℃恒溫培養箱中反應12h，磁分離，棄掉反應液，將磁分離產物，即仿生磁球重懸在PBS中，得到仿生磁球溶液；

(2)將DBCO-PEG₄-NHS與anti-EpCAM抗體在PBS中混合得到混合液，將混合液在4℃孵育4h，然后在4℃，7000r/min下，在孔徑為30KDa超濾管中超濾30min，除去未反應的DBCO-PEG₄-NHS與anti-EpCAM抗體小分子，制備得到帶有環炔化修飾基團的抗體的溶液。

其中，DBCO-PEG₄-NHS與anti-EpCAM抗體的摩爾比為50:1；

(3)將步驟(1)制得的仿生磁球溶液和步驟(2)帶有環炔化修飾基團的抗體的溶液(其中抗體為6μg)在PBS中混合，并在37℃混懸1h，發生點擊化學反應，仿生磁球偶聯上帶有環炔化修飾基團(DBCO-PEG₄-NHS)的抗體，得到一種偶聯anti-EpCAM抗體的仿生免疫磁球。

對制備得到的偶聯anti-EpCAM抗體的仿生免疫磁球進行測試表征實驗如下:

Ⅰ、利用透射電子顯微鏡JEM-1400對制備得到的仿生免疫磁球進行表征，由圖2A可看出，MNC表面凹凸不平，一旦包裹白細胞膜后，其邊緣變得模糊，且周圍明顯多了一層透明狀物質，如圖2B所示。

Ⅱ、用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)來表征環炔化抗體的分子量，由圖3可以看出，當NHS-PEG₄-DBCO與抗體的比例為50:1時，環炔化修飾的抗體平均分子量增加了840.6246，而DBCO-PEG₄-NHS的相對分子質量為649.68，所以平均每個抗體上連接了1～2個環炔分子，DBCO-Ab表示帶有環炔化修飾基團(DBCO-PEG₄-NHS)的抗體(Ab)。

Ⅲ、將相同濃度(Fe含量：50μg)的仿生磁球、偶聯anti-EpCAM抗體的仿生免疫磁球分別和FITC熒光標記的二抗在室溫避光以40r/min轉速混懸2h，然后用PBS洗2次，磁分離后用200μL PBS重懸，加入共聚焦小皿，靜置30min后在共聚焦顯微鏡下觀察。由圖4可知，只有偶聯anti-EpCAM抗體的仿生免疫磁球才能被FITC熒光標記的二抗識別和標記(圖4右)，而仿生磁球不能和FITC熒光標記的二抗反應(圖4左)，說明環炔化抗體確實偶聯到了仿生磁球表面，偶聯anti-EpCAM抗體的仿生免疫磁球制備成功。

實施例6偶聯抗體的仿生免疫磁球的制備

(1)將實施例1制得的平均粒徑為81nm的MNC溶液(其中Fe含量為50μg)、實施例2制得的M溶液200μL和PBS 2mL混合，用混懸儀于4℃恒溫培養箱中反應12h，磁分離，棄掉反應液，將磁分離產物，即仿生磁球重懸在PBS中，得到仿生磁球溶液；

(2)將DBCO-PEG₇₀-NHS與anti-EpCAM抗體在PBS中混合得到混合液，將混合液在4℃孵育4h孵育，然后在4℃，7000r/min下，在孔徑為30KDa超濾管中超濾30min，除去多余的修飾基團小分子，制備得到帶有環炔化修飾基團的抗體的溶液。

其中，DBCO-PEG₇₀-NHS與anti-EpCAM抗體的摩爾比為50:1；

(3)將仿生磁球溶液和帶有環炔化修飾基團的抗體的溶液(其中抗體6μg)在PBS中混合，并在37℃混懸1h，發生點擊化學反應，仿生磁球偶聯上帶有環炔化修飾基團(DBCO-PEG₇₀-NHS)的抗體，得到一種偶聯anti-EpCAM抗體的仿生免疫磁球。

對制備得到的偶聯抗體的仿生免疫磁球進行測試表征實驗及結果與實施例5類似。

實施例7偶聯抗體的仿生免疫磁球的制備

(1)將實施例1制得的平均粒徑為81nm的MNC溶液(其中Fe含量為50μg)、實施例2制得的M溶液200μL和PBS 2mL混合，用混懸儀于4℃恒溫培養箱中反應12h，磁分離，棄掉反應液，將磁分離產物，即仿生磁球重懸在PBS中，得到仿生磁球溶液；

(2)將修飾基團(DBCO-PEG₇₀-NHS)與anti-Her2在PBS中混合得到混合液，將混合液在4℃孵育4h孵育，然后在4℃，7000r/min下，在孔徑為30KDa超濾管中超濾30min，除去多余的修飾基團小分子，制備得到帶有環炔化修飾基團的抗體的溶液。

其中，修飾基團(DBCO-PEG₇₀-NHS)與抗體(anti-Her2)的摩爾比為50:1；

(3)將仿生磁球溶液(Fe含量：50μg)和環炔化修飾基團(DBCO-PEG₇₀-NHS)的抗體(anti-Her2)的溶液(其中抗體為6μg)在PBS中混合，并在37℃混懸1h，發生點擊化學反應，仿生磁球偶聯上帶有環炔化修飾基團(DBCO-PEG₄-NHS)的抗體(anti-Her2)，得到一種偶聯抗體(anti-Her2)的仿生免疫磁球。

對制備得到的偶聯抗體的仿生免疫磁球進行測試表征實驗及結果與實施例5類似。

實施例8偶聯抗體的仿生免疫磁球的制備

(1)將實施例1制得的平均粒徑為81nm的MNC溶液(其中Fe含量為50μg)、實施例2制得的M溶液200μL和PBS 2mL混合，用混懸儀于4℃恒溫培養箱中反應12h，磁分離，棄掉反應液，將磁分離產物，即仿生磁球重懸在PBS中，得到仿生磁球溶液；

(2)將修飾基團(DBCO-PEG₄-NHS)與抗體(anti-Her2)在PBS中混合得到混合液，將混合液在4℃孵育4h孵育，然后在4℃，7000r/min下，在孔徑為30KDa超濾管中超濾30min，除去多余的修飾基團小分子，制備得到帶有環炔化修飾基團的抗體的溶液。

其中，修飾基團(DBCO-PEG₄-NHS)與抗體(anti-Her2)的摩爾比為100:1；

(3)將仿生磁球溶液(Fe含量：50μg)和環炔化修飾基團(DBCO-PEG₄-NHS)的抗體((anti-Her2))的溶液(其中抗體6μg)在PBS中混合，并在25℃混懸4h，發生點擊化學反應，仿生磁球偶聯上帶有環炔化修飾基團(DBCO-PEG₄-NHS)的抗體(anti-Her2)，得到一種偶聯抗體(anti-Her2)的仿生免疫磁球。

對制備得到的偶聯抗體的仿生免疫磁球進行測試表征實驗及結果與實施例5類似。

實施例9偶聯抗體的仿生免疫磁球捕捉CTC

(1)將實施例5中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球進行反應濃度的優化

向濃度分別為10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL的實施例5制得的偶聯抗體的仿生免疫磁球中投入約1×10⁵個MCF-7細胞(Hoechst 33342染核)，37℃，40r/min混懸1h；磁分離后，收集上清、用1mL PBS重懸底物，分別用細胞計數器計數上清和底物中的細胞。

(2)將實施例5中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球進行反應時間的優化

向50μg/mL實施例5制得的偶聯抗體的仿生免疫磁球中投入約1×10⁵個MCF-7(人乳腺癌)細胞，在37℃，40r/min分別混懸不同時間：5min、15min、30min和60min。磁分離后，收集上清、用1mL PBS重懸底物，分別用細胞計數器計數上清和底物中的細胞。

(3)用實施例5中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球在模擬血樣中捕捉并免疫染色鑒定循環和腫瘤細胞

將1000個MCF-7細胞分別加入1mL人全血中，向以上體系中加入實施例5中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球(Fe含量：50μg)，37℃下混懸孵育15min。磁分選并用PBS洗滌捕獲的CTCs，用4％的多聚甲醛溶液37℃固定細胞10min。磁分選后向底物中加入體積分數0.1％Triton-X 100溶液在37℃通透細胞10min；磁分選后加入質量分數為1％BSA溶液37℃封閉細胞30min。磁分選后加入Hoechst33342、PE標記的抗人CK18抗體、FITC標記的抗人CD45抗體，在37℃下避光孵育30min，進行免疫細胞化學染色；磁分選并用PBS洗滌一次，最后將細胞重懸于300μL PBS中并置于共聚焦小皿中，在共聚焦熒光顯微鏡下對細胞進行觀察。

(4)將實施例5中制備的偶聯抗體仿生免疫磁球和商業化磁珠(beads)進行背對背比較，全面考察偶聯抗體的仿生免疫磁球富集CTC的效果①CTCs捕捉率對比

beads用來捕捉10⁵個MCF-7細胞，具體操作步驟按產品說明書中給出的分選方法及MACS磁珠建議用量。

②CTCs檢測限對比

將5～1500個的Dio標記的MCF-7細胞加入PBS中，分別用實施例5中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球、beads捕捉；磁分離，將捕捉到的細胞加入96孔板，通過轉盤共聚焦對MCF-7進行計數。

③白細胞背景值對比

將大約10⁵個MCF-7細胞加入1mL的健康人裂解血中，用實施例5中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球、beads分別捕捉MCF-7細胞；磁分選并用PBS洗滌捕獲的CTCs，用4％的多聚甲醛溶液在室溫固定細胞20min。然后用0.1％Triton-X 100溶液在37℃通透細胞10min，隨后用FITC標記的抗人CD45抗體和細胞在4℃孵育1h，用PBS洗滌細胞后再和PE標記的抗人CK18抗體在4℃孵育1h，最后將細胞重懸于500μL PBS中進行流式和共聚焦分析。

(5)用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit檢測實施例5中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球捕捉到的MCF-7細胞的活性。先配制Calcein-AM/EthD-1染液：向1mL DPBS中加入4mM的Calcein AM solution 0.5μL和2mM的EthD-1solution 2μL。然后將染液和細胞在37℃作用20min。Calcein AM solution可以使活細胞發出綠色熒光(494/517nm)，EthD-1solution可以使死細胞發出紅色熒光(528/617nm)。

對實施例5制備得到的偶聯抗體的仿生免疫磁球(簡稱IMSs)捕捉CTC效果實驗結果如下:

Ⅰ、由圖5A可知，當IMSs濃度為50μg/mL時，捕捉率已達到90％以上，但當IMSs超過一定濃度時，捕捉率幾乎沒有變化。

Ⅱ、由圖5B可以看出，IMSs和MCF-7反應15min后，捕捉率就達到了95.85％，繼續延長孵育時間，捕捉率并沒有明顯提高，說明IMSs與MCF-7的結合速度非常快。

Ⅲ、CK18是腫瘤細胞標志物、CD45是白細胞表面標志物，只有CK18+/CD45-/Hoechst 33342+的細胞才能認為是CTCs，而CK18-/CD45+/Hoechst33342+的細胞是白細胞(Leukocytes)。將約1000個MCF-7細胞加入1mL人全血中，得到模擬臨床樣品。用IMSs捕捉其中的CTCs并進行ICC(three-color immunocytochemistry)鑒定。如圖6所示，圖6中，由左向右依次為Hoechst、CK18、CD45和Merge；其中，Hoechst圖中有藍色說明有細胞存在；CK18圖中有綠色說明有CTCs存在，CD45中沒有任何顯示，說明沒有白細胞存在，Merge為Hoechst、CK18和CD45的結果疊加顯示，說明IMSs在人全血中能捕捉到CTCs，且視野中幾乎沒有白細胞，說明IMSs能在全血中高效捕捉CTCs并顯著降低對白細胞的非特異性吸附。

Ⅳ、將10⁵個MCF-7細胞分散在PBS溶液中，分別用beads和偶IMSs進行富集，細胞的回收率分別為79.08％、95.85％，顯然，IMSs具有更高的捕捉率，如圖7A所示。

將5個～1500個的Dio標記的MCF-7細胞加入PBS中。分別用IMSs、beads捕捉。磁分離，將捕捉到的細胞加入96孔板，通過轉盤共聚焦對MCF-7進行計數。臨床中癌癥病人血樣中CTCs的數目通常為0～50個/mL。為了檢測IMSs用于臨床樣本的可行性，將被Dio標記的MCF-7細胞加入PBS，制備濃度為5～1500個/mL細胞的系列樣品，再分別用IMSs和beads捕捉其中的MCF-7，結果如圖7B所示，IMSs在PBS中的回歸方程為y＝0.9331x(R²＝1.000)，平均捕捉率為93.31％(范圍：84.62％～100％)；beads在PBS中的回歸方程為y＝0.6069x(R²＝0.9887)，平均捕捉率為60.69％(范圍：25％～90％)，可見IMSs表現出更高的靈敏度。

beads富集細胞的純度可以達到90％。為了更直觀地評估IMSs降低白細胞背景的效果，在1mL健康人裂解血中投入10⁵個MCF-7細胞，分別用beads和IMSs富集，統計抓到相同數目MCF-7細胞時對應背景中的白細胞數目。由圖7C可知，CK18+/CD45-為MCF-7細胞(綠色)，CK18-/CD45+為裂解血中的白細胞(黃色)。從流式定量結果可知，用beads捕捉到10329個MCF-7細胞時，檢出的白細胞個數為340(即約3400個白細胞背景值/1mL裂解血樣)。呈鮮明對比的是，用IMSs捕捉相同數目的MCF-7細胞時，沒有檢測到白細胞背景。共聚焦結果同樣證明了IMSs顯著降低了白細胞的背景。

Ⅵ、Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細胞膜，通過活細胞內的酯酶作用，進而脫去AM基，產生發強綠色熒光的Calcein(鈣黃綠素)，因此Calcein-AM僅對活細胞染色。而紅色乙錠二聚體-1(EthD-1)不能透過活細胞膜，只能進入死細胞，與細胞內的基因片段結合后出現熒光，可用于檢測死細胞。由圖8可知，通過IMSs捕捉到的絕大多數細胞呈綠色熒光，說明細胞活性很好，IMSs對CTCs的機械損傷小。

實施例10偶聯抗體的仿生免疫磁球捕捉CTC

(1)將實施例6中制備的仿生免疫磁球進行反應濃度的優化

偶聯抗體的仿生免疫磁球為實施例6制得的，其余同實施例9步驟(1)

(2)將實施例6中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球進行反應時間的優化

偶聯抗體的仿生免疫磁球為實施例6制得的，其余同實施例9步驟(2)

(3)用實施例6中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球在模擬血樣中捕捉并免疫染色鑒定循環和腫瘤細胞

偶聯抗體的仿生免疫磁球為實施例6制得的，其余同實施例9步驟(3)

(4)將實施例6中制備的偶聯抗體的仿生免疫磁球和商業化磁珠(beads)進行背對背比較，全面考察偶聯抗體的仿生免疫磁球富集CTC的效果

偶聯抗體的仿生免疫磁球為實施例6制得的，其余同實施例9步驟(4)

(5)偶聯抗體的仿生免疫磁球為實施例6制得的，其余同實施例9步驟(4)

對實施例6制備得到的偶聯抗體的仿生免疫磁球進行捕捉CTC效果實驗及結果與實施例9的效果實驗及結果類似。