本發明涉及一種手性3-環己烯-1-甲酸的制備方法，特別涉及一種蛋白酶拆分制備手性3-環己烯-1-甲酸的方法。(二)
背景技術：
：3-環己烯-1-甲酸作為手性化合物是一種重要的化學試劑和有機中間體，廣泛應用于醫藥、化工等多個領域。(S)-3-環己烯-1-甲酸是凝血因子Xa的抑制劑依度沙班中間體3,4-二氨基環己烷羧酸衍生物的重要起始原料。而(R)-3-環己烯-1-甲酸也可以用于合成多種藥物中間體，如抗腫瘤藥物(+)-Phyllanthocin的中間體、FK506(普樂可復：日本藤澤藥品工業株式會社從鏈霉菌屬中分離出來的大環內酯類抗生素)的C24-C34片段、LeustroducsinB(一種具有包括抗感染、抗癌癥轉移、促進血小板形成等多種生物活性的物質)的片段C、磷酸奧司他韋(特敏福：預防及治療流行性感冒藥物)的初始原料及(-)-cis-α-鳶尾酮(鳶尾油的主要成分，和紫羅蘭一樣作為重要香水材料)。目前，關于手性3-環己烯-1-甲酸拆分制備的報導較少，關于蛋白酶水解拆分制備3-環己烯-1-甲酸更是沒有。文獻(Tanyeli,CandE.Turkut,TetrahedronAsymmetry,2004,15(13):2057-2060)描述了一種利用商品化的豬肝酯酶(PLE)，馬肝酯酶(HLE)和豬胰脂肪酶(PPL)水解外消旋3-環己烯-1-甲酸甲酯制備手性3-環己烯-1-甲酸。國內有文獻(徐春秀,石玉,等,現代藥物與臨床,2013,28(2):126-128)報導通過化學拆分法以手性苯乙胺為手性拆分劑，外消旋3-環己烯-1-甲酸在丙酮中形成非對映體異構體并利用它們的溶解度差別來進行拆分。(三)技術實現要素：本發明目的是提供一種蛋白酶拆分制備手性3-環己烯-1-甲酸的方法，解決了化學法拆分產品光學純度只有98％左右(小于99％)，操作繁瑣(往往需要10次以上結晶操作)等問題。本發明采用的技術方案是：本發明提供一種蛋白酶拆分制備手性3-環己烯-1-甲酸的方法，所述方法為：以外消旋3-環己烯-1-甲酸甲酯為底物，以堿性蛋白酶為催化劑，以pH為7.5的磷酸鹽緩沖液為反應介質，在20～60℃條件下進行水解反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得(S)-3-環己烯-1-甲酸和(R)-3-環己烯-1-甲酸甲酯。進一步，所述堿性蛋白酶，活性為5000～10萬U/g，優選購自深圳綠微康生物工程有限公司及湖南利爾康有限公司的蛋白酶，或者購自丹麥NovoNodisk公司的蛋白酶Alcalase2.4LFG。進一步，所述底物體積用量以反應介質體積計為1-5％，所述堿性蛋白酶用量以反應介質體積計為100萬-200萬U/L。進一步，所述水解反應在20～60℃條件下反應0.5～8h。進一步，所述反應液分離純化方法為：(1)反應完全后，將反應液過濾，獲得濾液和濾餅，濾餅回收酶，濾液調節pH值至8-9，再加入有機溶劑A萃取，分液得到有機層A和水層A，將有機層A旋轉蒸發至無液體流出，獲得(R)-3-環己烯-1-甲酸甲酯；將1M氫氧化鈉水溶液的反應瓶中加入(R)-3-環己烯-1-甲酸甲酯，加熱回流攪拌反應5h，反應結束后，反應液加1M鹽酸水溶液調節pH為5-6，加入等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機層B，用無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉蒸發得(R)-3-環己烯-1-甲酸；所述有機溶劑B同有機溶劑A；(2)將水層A調節pH值至3-6，加入等體積有機溶劑B萃取三次，收集有機層C，旋轉蒸發至無液體流出，得到(S)3-環己烯-1-甲酸；所述有機溶劑C同有機溶劑A。進一步，所述有機溶劑A為下列之一：乙酸乙酯、正己烷、甲苯或乙醚。本發明是通過將3-環己烯-1-甲酸甲酯溶于磷酸鹽緩沖液，然后加入酶，在酶的催化作用下，3-環己烯-1-甲酸甲酯發生選擇性水解反應，獲得具有較高光學活性的3-環己烯-1-甲酸，反應選擇性好，轉化率高，通過簡單的萃取獲得產物，拆分路線如圖1所示。本發明所述有機溶劑A、有機溶劑B和有機溶劑C均為有機溶劑，為了辨別不同步驟加入不同溶劑及用量而命名，字母本身沒有含義。同理，所述有機層A-有機層C，水層A中字母本身沒有含義。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：本發明拆分反應條件溫和、操作工藝簡單、設備需求較低、反應不存在副反應、得到的手性化合物光學純度高，(S)-3-環己烯-1-甲酸的ee值從化學拆分法的98％提高到99.5％，得率高達32.8％；(R)-3-環己烯-1-甲酸甲酯的ee值高達74.2％，得率高達41.1％。(四)附圖說明圖1為手性3-環己烯-1-甲酸拆分路線圖。(五)具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此：實施例1：蛋白酶選擇性水解拆分3-環己烯-1-甲酸甲酯反應式如下：向裝有10mLpH為7.5的磷酸鹽緩沖液的反應瓶中加入200μL3-環己烯-1-甲酸甲酯，0.1g堿性蛋白酶(酶活為10萬U/g，購自湖南利爾康生物有限公司)，反應溫度控制在30～40℃，通過添加1MNaOH水溶液來恒定pH值為7.5，攪拌反應3h。反應結束后，反應液通過常規有機溶劑萃取方法：(1)將反應液過濾，獲得濾液和濾餅，濾餅回收酶，濾液調節pH值至9.0，再加入乙酸乙酯萃取，分液得到有機層A和水層A，將有機層A旋轉蒸發至無液體流出，獲得(R)-3-環己烯-1-甲酸甲酯；1mL(R)-3-環己烯-1-甲酸甲酯加入10mL1M氫氧化鈉水溶液的反應瓶中，加熱回流攪拌反應5h。反應結束后，反應液加1M鹽酸水溶液調節pH為5.0，加入3×10mL乙酸乙酯進行萃取，合并有機層，用無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉蒸發得(R)-3-環己烯-1-甲酸。(2)將水層A調節pH值至5.0，加入等體積乙酸乙酯萃取三次，收集有機層，旋轉蒸發至無液體流出，得到(S)-3-環己烯-1-甲酸。最終得到(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值為99.2％，得率28.6％。(R)-3-環己烯-1-甲酸的e.e.值為74.2％，得率41.1％。(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯產品光學純度要高于化學法拆分產品98.0％左右，更有利于產品下游合成應用。3-環己烯-1-甲酸甲酯和3-環己烯-1-甲酸的氣相色譜手性分析檢測條件如下：氣相色譜柱：B-DM(0.25mm×30m)；載氣為N2(70kPa)，進樣口溫度：250℃；空氣流量300mL/min，尾吹氣流量25mL/min；分流比50:1，進樣量1.5μL。柱箱升溫程序：初始溫度100℃保持2min，2℃/min升溫至150℃，保持2min。FID檢測器溫度：250℃。實施例2：堿性蛋白酶選擇性水解拆分3-環己烯-1-甲酸甲酯向裝有10mLpH為7.5的磷酸鹽緩沖液的反應瓶中加入200μL3-環己烯-1-甲酸甲酯，0.1g堿性蛋白酶(酶活為10萬U/g，購自深圳綠微康生物工程有限公司)，反應溫度控制在30～40℃，通過添加1MNaOH水溶液來恒定pH為7.5，攪拌反應3h。反應結束后，反應液按實施例1處理方法分離提取。最終得到(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值為99.1％，得率32.8％。(R)-3-環己烯-1-甲酸的e.e.值為54.2％，得率40.5％。實施例3：堿性蛋白酶選擇性水解拆分3-環己烯-1-甲酸甲酯向裝有10mLpH為7.5的磷酸鹽緩沖液的反應瓶中加入200μL3-環己烯-1-甲酸甲酯，0.1g蛋白酶Alcalase2.4LFG(酶活為10萬U/g，購自丹麥NovoNodisk公司)，反應溫度控制在30～40℃，通過添加1MNaOH水溶液來恒定pH為7.5，攪拌反應4h。反應結束后，反應液按實施例1處理方法分離提取。最終得到(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值為99.5％，得率22.1％。(R)-3-環己烯-1-甲酸的e.e.值為65.2％，得率38.2％。實施例4：不同堿性蛋白酶用量的3-環己烯-1-甲酸甲酯拆分結果向裝有10mLpH為7.5的磷酸鹽緩沖液的反應瓶中加入200μL3-環己烯-1-甲酸甲酯，添加不同質量的堿性蛋白酶(酶活為10萬U/g，購自深圳綠微康生物工程有限公司)，反應溫度控制在30～40℃，通過添加1MNaOH水溶液來恒定pH為7.5，攪拌反應3h。反應結束后，反應液按實施例1處理方法分離提取。最終得到(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值和得率由表1所示。表1不同堿性蛋白酶用量的3-環己烯-1-甲酸甲酯拆分結果序號堿性蛋白酶添加量U/L底物e.e.值得率150萬82.5％45.2％2100萬99.1％32.8％3150萬99.5％31.2％4200萬99.5％30.5％5250萬99.5％25.2％實施例5：其他水解酶對于3-環己烯-1-甲酸甲酯拆分結果向裝有10mLpH為7.5的磷酸鹽緩沖液的反應瓶中加入200μL3-環己烯-1-甲酸甲酯，添加0.1g其他水解酶(蛋白酶、酯酶和脂肪酶)，反應溫度控制在30～40℃，通過添加1MNaOH水溶液來恒定pH為7.5，攪拌反應3h。反應結束后，反應液按實施例1處理方法分離提取。最終得到(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯的e.e.值和得率由表2所示。表2其他水解酶對3-環己烯-1-甲酸甲酯拆分結果序號酶類型底物e.e.值得率1豬肝酯酶40.5％40.2％2木瓜蛋白酶56.1％32.8％3Novozyme435脂肪酶28.4％25.2％4LipozymeTLIM脂肪酶35.5％20.5％5豬胰脂肪酶56.5％45.2％以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明的技術內容作任何形式上的限制。凡是依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均落入本發明的保護范圍內。當前第1頁1 2 3