一種分枝桿菌重組基因工程菌及其應用的制作方法

本發明涉及一種9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的制備，特別涉及一種分枝桿菌重組基因工程菌及其制備9α-OH-AD的應用。

(二)

背景技術：

甾體類藥物具有重要的生理活性，臨床上應用廣泛。目前，研究者在科學研究和工業生產中，微生物降解植物甾醇大多用來生產雄甾-4-烯-3,17-二酮，雄甾-1,4-烯-3,17-二酮和9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)，且都是生產甾體激素藥物的中間體。已發現有2條途徑制備9α-OH-AD：其一為兩步發酵法，即先由分枝桿菌對甾醇斷側鏈生產羥基雄甾烯酮(AD)，再以AD為底物借助其他微生物(例如諾卡氏菌、紅球菌屬或工程大腸桿菌)轉化引入9α-羥基，得到9α-OH-AD，如魏東芝等人重組的大腸桿菌具有將AD轉化得到9α-OH-AD的活性；楊亞力等人報告了第2條技術途徑，即應用篩選出來的分枝桿菌突變株直接發酵催化斷裂甾醇側鏈，積累得到9α-OH-AD產物。

但是，因為大多數植物甾醇側鏈降解后無法積累單一產物，而是同時積累以上三個結構相近和難于分離純化的甾體化合物，所以大多數生物轉化植物甾醇側鏈降解菌不能直接在工業上得到應用。為了能夠獲得高積累量9α-OH-AD產物的植物甾醇側鏈降解菌，需要用基因工程的方法對原始的生物轉化植物甾醇側鏈降解菌進行改造。

植物甾醇生物轉化為9α-OH-AD之間涉及到的關鍵反應之一就是雄甾-4-烯-3,17-二酮在9α位加羥基。9α-OH-AD化學結構上9α-羥基的存在，可借助常規甾體化學合成手段形成C9,11-雙鍵體系，從而很方便地在C₉位引入一個鹵素原子形成糖皮質激素必不可缺少的功能羥基。為了獲 得高產量的9α-OH-AD，則需要強化KshA和KshB活性。根據NCBI上報道3-甾酮-9α-羥基化酶的基因序列，通過構建3-甾酮-9α-羥基化酶的重組表達質粒，電轉化入具有9α-OH-AD轉化能力的分枝桿菌中，強化3-甾酮-9α-羥基化酶的活性，以期提高最終9α-OH-AD產物的積累量。

(三)

技術實現要素：

本發明目的是針對分枝桿菌中的3-甾酮-9α-羥基化酶進行研究，希望通過對其活性的強化來實現轉化植物甾醇高純度積累9α-OH-AD的基因工程菌的構建，提供一種分枝桿菌重組基因工程菌及其制備9α-OH-AD的應用。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種分枝桿菌重組基因工程菌，所述重組基因工程菌是將KshA基因和KshB基因轉入分枝桿菌(Mycobacterium.sp)獲得的。3-甾酮-9α-羥基化酶基因包括3-甾酮-9α-羥基酶基因(kshA)和3-甾酮-9α-羥基化酶還原酶基因(kshB)兩部分亞基，用來表達3-甾酮-9α-羥基化，分枝桿菌本身有3-甾酮-9α-羥基化酶基因，但其所表達的3-甾酮-9α-羥基化酶的酶活性偏低，原始分枝桿菌在發酵培養5d積累9α-OH-AD量達到最大，且最大產量為0.957g/L，則植物甾醇的轉化率為9.57％，隨著發酵催化的時間的延長，9α-OH-AD的積累量會有所降低。所述工程菌是依據GenbanK中KshA與KshB的相似基因設計引物，以分枝桿菌的基因組為模板通過PCR技術手段獲取KshA與KshB基因，以共表達的方式插入pNIT表達質粒中，用來提高3-甾酮-9α-羥基化酶的酶活，加強甾體母核上C_9α位的羥基化作用，提高提高9α-OH-AD的生物轉化率。獲取轉化子pNIT-kshA-kshB后將其電轉化至分枝桿菌得到分枝桿菌重組基因工程菌；所述KshA基因核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示，所述KshB基因核苷酸序列為SEQ ID NO：2所示。

本發明還提供一種所述分枝桿菌重組基因工程菌在制備9α-OH-AD中的應用，具體所述應用以分枝桿菌重組基因工程菌為酶源，以發酵培養基為反應基質，在30～32℃、180～200r/min條件下培養至對數生長初期時，加入終濃度為5～15g/L的誘導劑己內酰胺，繼續培養1～2d，加入植物甾醇，在30～32℃、180～200r/min條件下進行轉化反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得9α-OH-AD；所述植物甾醇以10g/L乳化植物甾醇溶液的形式加入，所述10g/L乳化植物甾醇溶液制備方法為：將植物甾醇加入到吐溫80，再加水至植物甾醇終濃度10g/L，攪拌10min后，超聲(350W)溶解30min，121℃，滅菌1h，獲得10g/L乳化植物甾醇溶液，所述植物甾醇與吐溫80質量比為5:1；所述發酵培養基終濃度組成：MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，K₂HPO₄ 0.25g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖1g/L，溶劑為去離子水，pH 7.0。

進一步，所述10g/L乳化植物甾醇溶液體積加入量以發酵培養基體積計為5％。

進一步，所述酶源以體積濃度1％接種量的種子液形式接種至發酵培養基，所述種子液按如下方法制備：

(1)斜面培養：將分枝桿菌重組基因工程菌接種至斜面培養基，在30℃培養2～3d，獲得斜面菌體；斜面培養基質量終濃度組成：甘油20g/L，檸檬酸2g/L，NH₄NO₃ 2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，2％瓊脂，溶劑為去離子水，pH 7.0；

(2)種子培養：挑取斜面菌體接種至種子培養基，在30℃、180r/min振蕩培養2至3d，獲得種子液；種子培養基終濃度組成為：甘油20g/L，檸檬酸2g/L，NH₄NO₃ 2g/L，檸檬酸鐵銨0.05g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，溶劑為去離子水，pH 7.0。

本發明構建的分枝桿菌重組基因工程菌產3-甾酮-9α-羥基化酶，為提 高甾體類藥物9α-OH-AD生產效率提供一定的基礎。

與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：本發明構建的分枝桿菌重組基因工程菌轉化植物甾醇制備9α-OH-AD的轉化能力比原始菌株提高了50.78％，9α-OH-AD產量在最大值處提高了0.486g/L，最大產量達到1.443g/L。

(四)附圖說明

圖1為PCR產物及重組質粒電泳圖，M為10000bp DNA Marker，1為重組質粒pNIT-KshA；2為重組質粒pNIT-KshA-KshB；3為KshA PCR產物；4為KshB PCR產物。

圖2為重組質粒pNIT-KshA-KshB單雙酶切驗證圖，M：10000DNAMarKer；1：質粒pNIT-KshA-KshB單酶切；2、3：重組質粒pNIT-KshA-KshB雙酶切。

圖3為植物甾醇底物及工程菌M-KsH生物轉化的產物的薄層層析檢測(TLC)圖；條帶1是樣品9α-OH-AD；條帶2是底物植物甾醇；條帶3是工程菌M-ksH生物轉化的產物。

圖4為9α-OH-AD樣品標準曲線。

圖5工程菌M-KsH生物轉化的產物的高效液相色譜(HPLC)圖譜，圖譜1為9α-OH-AD標準樣品的峰譜圖。圖譜2是工程菌M-KsH生物催化植物甾醇的產物，圖譜3是原始分枝桿菌生物轉化植物甾醇的產物。

圖6產物9α-OH-AD的核磁共振氫譜。

圖7產物9α-OH-AD質譜分析圖。

圖8轉化產物9α-OH-AD的產量圖。

(五)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此：

本發明實施例中所用的每升種子培養基組成為：甘油20g，檸檬酸2g，NH₄NO₃ 2g，檸檬酸鐵銨0.05g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，加1L去離子水，pH調至7.0，121℃，滅菌20min。

斜面或平板培養基：種子培養基添加質量終濃度2％瓊脂。

發酵培養基組成：MgSO₄·7H₂O 0.25g，NH₄NO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 0.25g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，酵母粉5g，葡萄糖1g，加去離子水至1L，pH調為7.0。

實施例1分枝桿菌pNIT-kshA-kshB(M-ksH)工程菌的構建方法

以CTAB法獲得從中國微生物菌種庫購買的編號CICC21097分枝桿菌(Mycobacterium.sp)的基因組DNA，擴增得到KshA與KshB目的基因，再將KshA與KshB目的基因導入pNIT質粒中，具體方法如下：

1.分枝桿菌基因組的小量提取

從分枝桿菌甘油管中挑取菌液涂平板，32℃培養2～3d，取單菌落接種于種子培養基，30℃培養24h后，從搖瓶中取2mL的菌液置于管中12000rpm離心1min，去上清液，沉淀用1.5mL質量濃度40％的NaOH水溶液懸浮，置于37℃水浴振蕩30min；12000rpm離心5min，去上清液，收集菌體；加600μL TE緩沖液，吹打混勻，沸水浴中加熱10min，并立即將離心管放入-20℃冰箱當中，放置30min；加入40μL(終濃度20mg/mL，溶劑為雙蒸水)溶菌酶，置于37℃水浴振蕩120min，加入蛋白酶K(終濃度250μg/mL)和SDS(終濃度1％)，水浴65℃震蕩30min；水浴完畢后，加入80μL質量濃度10％的CETAB水溶液(十六烷基三甲基溴化銨，溶劑為雙蒸水)和80μL質量濃度10％的NaCl水溶液，CETAB和NaCl二者終濃度均為1％，水浴中20min；水浴結束之后立即用1～3ml酚:氯仿:異戊醇(25:24:l，v/v/v)混合溶液沉淀蛋白質，并用相對于酚:氯仿:異戊醇(25:24:l，v/v/v)混合溶液兩倍體積的乙醇沉淀，12000rpm離心10 min，取沉淀得到基因組DNA，吹干乙醇，加入5μL RNA酶和45μL ddH₂O，37℃水浴30min。

2.kshA和kshB目的基因的擴增

根據分枝桿菌的基因組DNA序列設計引物：

KshA F:5’-CCGGAATTCGATGACTACCGAGACAG-3’，

KshAR:5’-AGGAAAAAAGCGGCCGCTCAGCTCGGCTGCGCGGACT-3’。

KshB F：5’-GGAAGATCTCATGACGGAGGAACCGCTCG-3’

KshB R：5’-CCGCTCGAGCTAATCGTCATAGGTGACTTCCACCGAAT-3’

以分枝桿菌基因組DNA為擴增模板，KshA F/KshA R、KshB F/KshB R為引物進行PCR擴增KshA與KshB基因。PCR體系：分枝桿菌基因組DNA 5μL，2×KOD Fx buffer 25μL，dNTPs 10μL，上、下游引物各2.5μL，KOD Fx酶1μL，ddH₂O 4μL，總體積50μL。PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃變性45s，67℃退火45s，68℃延伸2min，循環30次，68℃延伸10min，16℃保溫。反應結束取樣10μL，用質量分數為0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以2000bp的DNA Marker為對照。

3.工程菌分枝桿菌pNIT-kshA-kshB(M-ksH)的構建

步驟2得到目的片段KshA(大小1157bp，SEQ ID NO.1所示)和KshB(大小1056bp，SEQ ID NO.2所示)，用EcoR I和Nde I進行雙酶切KshA，將其插入經過同樣酶切處理的表達載體pNIT質粒中，獲得的中間質粒pNIT-KshA，DNA條帶大小為7400bp，大小相符。再經EcoR I和Hind III雙酶切，與經過同樣酶切的KshB連接，即為3-甾酮-9α-羥基化酶基因的表達質粒，命名為pNIT-KshA-KshB，大小為9000bp左右。如圖1所示，經上海生工生物有限公司測序的結果表明與GenBanK中KshA及KshB的序列達到99％的一致性。

通過對載體pNIT-KshA-KshB進行單雙酶切鑒定，結果如圖2所示， 對pNIT-KshA-KshB進行的EcoR I單雙酶切，在9000bp與1000bp左右出現亮條帶，與理論基因線狀條帶大小相似。對pNIT-KshA-KshB進行EcoR I和Nde I雙酶切基因KshA，分別在1200bp與7500bp左右出現亮條帶，與理論KshA基因條帶大小(1157bp)相似。對pNIT-KshA-KshB進行的EcoR I、Nde I和Hind III雙酶切，分別在1200bp、1100bp與6200bp左右出現亮條帶，與理論KshA基因、KshB基因條帶大小相似。

采用細菌電轉化的方法，將上述重組表達質粒pNIT-KshA-KshB轉化入分枝桿菌感受態細胞中，涂布于含0.15mg/L卡那霉素平板中，37℃培養2～3d，挑取單菌落進行菌落PCR擴增，陽性菌落即為構建的重組基因工程菌，記為工程菌M-KsH。

實施例2工程菌M-ksH培養

(1)斜面培養：將工程菌M-KsH接種至斜面培養基，在37℃培養2～3d，獲得斜面菌體；

(2)種子培養：挑取斜面菌體接種至種子培養基，在30℃、180r/min振蕩培養1～2d，獲得種子液；

(3)發酵培養：取種子液以體積濃度1％的接種量接種至發酵培養基，30℃、180r/min振蕩培養2～3d至出現白色渾濁的現象。

實施例3工程菌M-ksH對植物甾醇的生物轉化分析檢測

1.實驗目的：比較工程菌M-ksH對植物甾醇的生物轉化能力。

2.實驗方法：

10g/L乳化植物甾醇溶液：將5g植物甾醇加入到1g吐溫80中，水定容至50mL，攪拌10min后，使用超聲(350W)溶解30min，121℃，滅菌1h，獲得10g/L乳化植物甾醇溶液。

取種子液以體積濃度1％的接種量接種至100mL發酵培養基，30℃、180r/min振蕩培養至對數生長初期時，加入350μL終濃度為10g/L的誘 導劑己內酰胺，繼續培養，誘導表達約1～2d。加入5ml、10g/L乳化植物甾醇溶液，于相同條件繼續振蕩發酵培養，1d取一次樣，每次取1mL樣品，用相對于樣品兩倍體積的乙酸乙酯萃取，漩渦振蕩10min后，10000rmp離心5min，取上清溶液采用薄層層析(TLC)檢測工程菌M-KsH是否有轉化底物產生9α-OH-AD的能力；隨后用高效液相色譜(HPLC)比較原始菌株與工程菌M-KsH的產物產量，以9α-OH-AD標準品為對照，根據9α-OH-AD標準曲線獲取待測樣品中9α-OH-AD含量，同樣條件下以原始菌分枝桿菌(Mycobacterium.Sp)作對照。

薄層層析檢測以石油醚：乙酸乙酯＝3：1，v/v為展開劑，以植物甾醇和9α-OH-AD標準品為對照。

高效液相色譜檢測條件為：色譜柱為島津C₁₈色譜柱，柱溫35℃，檢測波長254nm，流速：1mL/min，進樣量：10μL。流動相為：甲醇(HPLC級100％)：水＝70：30(V：V)，流速1.0mL/min，檢測波長254nm。3.實驗結果：

檢測結果如圖3、圖5。圖3是植物甾醇標準品及生物轉化產物的薄層層析(TCL)檢測結果，條帶1是標準品9α-OH-AD；條帶2是標準品植物甾醇，沒有明顯的條帶，說明植物甾醇在紫外254nm處不顯色；條帶3是工程菌M-KsH生物轉化的產物，與9α-OH-AD標準品的位置對應一致，說明轉化產物有9α-OH-AD積累。

9α-OH-AD標準曲線的測定：分別用乙酸乙酯配制9α-OH-AD濃度為0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、0.9g/L的標準液，采用高效液相色譜法檢測標準液，以峰面積為縱坐標，以9α-OH-AD濃度為橫坐標，利用最小二乘法作回歸曲線，得到標準品9α-OH-AD的標準曲線方程為：y＝20,752,466.000x+505,902.400，R²＝0.997，如圖4。

圖5中曲線2和3是同一條件下發酵催化得到的產物。曲線1為 9α-OH-AD標準品的峰譜圖，可以看見保留時間為5.565min，作為一個參考對照。曲線3是原始分枝桿菌生物轉化植物甾醇的產物，產物保留時間與標樣保留時間一致，可以初步確認產物為9α-OH-AD，根據保留峰面積和樣品9α-OH-AD標準曲線可以計算出產物的產量為0.756g/L。曲線2是工程菌M-KsH生物催化植物甾醇的產物，與標樣和原始菌催化產物保留時間一致，初步確定了工程菌M-KsH能夠生物催化植物甾醇為9α-OH-AD，根據保留峰面積和9α-OH-AD標準曲線可以計算出產物的最高產量為0.966g/L，相比較，重組分枝桿菌M-ksH的轉化率比原始分枝桿菌轉化率提高了50.78％，9α-OH-AD產量在最高點提高了0.486g/L。

4.實驗結論：結果表明，本發明的工程菌M-ksH催化植物甾醇為9α-OH-AD的能力提高。

經過TLC和HPLC檢測，初步確定了工程菌M-KsH能將植物甾醇生物轉化為9α-OH-AD。為了進一步證實，采用制備的TLC，刮取疑似產物色譜帶硅膠粉末，乙酸乙酯復溶萃取，30℃旋轉蒸發干燥，獲得純化的產物樣品，進行光譜學分析以鑒定其化學結構。鑒定結果如圖6、圖7所示。

1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ5.67(s，1H),4.25(s，1H)，2.44–2.36(m，2H)，2.27–2.14(m，2H)，2.09–1.98(m，2H)，1.83–1.74(m，2H)，1.73–1.64(m，1H)，1.62–1.40(m，8H)，1.27(s，3H)，0.83(s，3H)。

TOF-MS譜顯示其[M+H]+處于m/z303.2，說明該產物分子量為302，與9α-OH-AD的分子質量302.4相符合。因此，工程菌M-KsH能夠將植物甾醇生物轉化為9α-OH-AD，且轉化能力有一定的提高，相比較，重組分枝桿菌M-ksH的轉化率比原始分枝桿菌轉化率提高了50.78％，其最大產量最高值為1.443g/L，說明3-甾酮-9α-羥基化酶有一定的表達。

實施例4工程菌M-ksH與原始分枝桿菌對植物甾醇的生物轉化分析 檢測

1.實驗目的：比較工程菌M-ksH和原始菌催化植物甾醇的能力及產物含量。

實驗方法：分別在實施例3同一溫度、轉速條件下，各自加入5ml、10g/L乳化植物甾醇溶液作為底物(該底物與實施例3中的底物相同)，其它操作同實施例3，在發酵催化的過程中，每1d取一次樣。采用HPLC檢測，根據樣品9α-OH-AD標準曲線計算出9α-OH-AD產量，同樣條件下，以原始分枝桿菌為對照，繪制如圖8所示。

3.實驗結論：圖8顯示，2d后發酵轉化液中開始積累9α-OH-AD。原始分枝桿菌在第5d積累9α-OH-AD量達到最大，且最大產量為0.957g/L，則植物甾醇的轉化率為9.57％，隨著發酵催化的時間的延長，9α-OH-AD的積累量會有所降低。工程菌M-KsH差不多在第6d時9α-OH-AD積累量達到最大，產物9α-OH-AD最大產量為1.443g/L，因此植物甾醇的轉化率為14.43％。同樣，隨著發酵催化的時間的延長，9α-OH-AD的積累量會有所降低。相比較而言，工程菌M-KsH的轉化率比原始分枝桿菌轉化率提高了50.78％，9α-OH-AD產量在最大值處提高了0.486g/L，最高產量為1.443g/L。