技術領域：
本發明涉及殼質多糖的制備方法。具體地講，涉及一種以蝦蟹殼為原料，將其溶解在溶液中在溶解狀態同步進行脫蛋白和脫乙酰反應，制備中度脫乙酰水溶性甲殼素的方法，屬于水產品加工廢棄物利用技術領域。
背景技術：
甲殼素是由n-乙酰-2-氨基-2-脫氧-d-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接形成的多糖，是真菌的細胞壁和節肢動物的外骨骼里的主要組成部分，是一類重要的天然高分子材料，在工業、醫藥、服裝、化妝品、環保等領域有一定應用。然而由于存在大量的分子內和分子間的氫鍵，甲殼素的溶解性很差，在水、稀酸、稀堿、常規有機溶劑中均不能溶解，所以更廣的應用受到限制。甲殼素的高度脫乙酰產物叫殼聚糖，在稀酸中能溶解，所以其應用比甲殼素更廣，然而它不能在中性的水中溶解，所以不能應用在酸刺激敏感的場合。脫乙酰度50％左右，且氨基葡萄糖結構單元與n-乙酰氨基葡萄糖結構單元無規連接的甲殼素類高分子，由于分子間氫鍵部分被破壞，所以能在中性水中溶解，可稱為中度脫乙酰水溶性甲殼素，有望應用于酸刺激敏感場合。
現有的中度脫乙酰水溶性甲殼素的制備方法主要有兩種。一種是以殼聚糖和乙酸酐為主要原料，在混合溶劑中進行均相乙酰化反應，控制乙酰化程度，制成中度脫乙酰甲殼素。另一種是以甲殼素為主要原料，將甲殼素溶解在naoh溶液中，在溶解狀態下進行脫乙酰反應，控制脫乙酰程度，制成中度脫乙酰甲殼素。后一種方法稱為均相脫乙酰法，具有原料價格低、操作簡單的特點，所以更具優勢。
現有的以蝦蟹殼為原料制備甲殼素的工藝過程主要包括：脫鈣→脫蛋白→脫色。將現有的制甲殼素的方法和制中度脫乙酰水溶性甲殼素的方法組合，可得到以蝦蟹殼為原料制中度脫乙酰水溶性甲殼素的主要工藝過程：脫鈣→脫蛋白→脫色→均相脫乙酰。
將甲殼素溶解在堿溶液中是均相脫乙酰的前提，現有的溶解技術是通過高濃度naoh溶液中冰凍、融化操作，然后加水稀釋實現(劉廷國.凍融循環制備天然水溶性甲殼素及其特性[j].華中科技大學學報，2001，39(1)：70-74.)。由于溶劑的溶解能力不強，所以凍融操作需交替反復進行，操作周期很長。
溶解后形成的溶液熱穩定性很差，溫度超過30℃時甲殼素就會從溶液中析出變成非均相體系。為保證脫乙酰在均相條件下進行，現有技術是在25℃下進行反應，由于反應溫度低，所以甲殼素的脫乙酰度達50％需耗時長達48～72小時。
技術實現要素：
本發明提供了一種以蝦蟹殼為原料制備中度脫乙酰水溶性甲殼素的方法，主要涉及如下方面：
<1>.一種以蝦蟹殼為原料制備中度脫乙酰水溶性甲殼素的方法，所述方法包括：
(i)使用氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿配成水溶液來溶解蝦蟹殼粉的步驟，其中所述混合苛性堿水溶液中含8～18質量％的naoh，1～4質量％的lioh，其余為不可避免的雜質和水；以及
(ii)將上述(i)制得的溶液在低于所述水溶液的凝固點的溫度進行冰凍操作。
<2>.根據<1>所述的方法，其中：
所述混合苛性堿水溶液中含有10～16質量％的naoh，1～3質量％的lioh，其余為不可避免的雜質和水。
<3>.根據<1>所述的方法，其中：
所述步驟(i)是在比所述水溶液的凝固點高2℃以上的溫度，優選在比所述水溶液的凝固點高2-10℃的溫度進行浸漬并攪拌。
<4>.根據<1>所述的方法，其中：
所述步驟(ii)是在比所述水溶液的凝固點低至少5℃的溫度進行冰凍。
<5>.根據<4>所述的方法，其中所述步驟(ii)包括：
在冰凍前先低溫攪拌處理，然后進行所述冰凍，解凍之后進行淺冷攪拌處理，所述在淺冷攪拌是指在-10℃～10℃的溫度下攪拌，優選為在-6℃～6℃的溫度下攪拌。
<6>.根據<1>至<5>中任一項所述的方法，所述方法還包括：
根據氫氧化鈉和氫氧化鋰的質量濃度，并考慮蝦蟹殼粉溶解率的需要，重復交替進行步驟(i)和步驟(ii)的操作。
<7>.根據<1>所述的方法，所述方法還包括：
在步驟(i)中，95％以上的蝦蟹殼粉發生溶解，獲得粘度大于1000mpa·s-1的固液混合物。
<8>.根據<1>所述的方法，所述方法還包括：
同步脫蛋白脫乙酰，即，將去除雜質之后的溶液在25℃～60℃溫度進行溫和加熱處理，至甲殼素的脫乙酰度約為50％時停止加熱。
<9>.根據<8>所述的方法，所述方法還包括：
采用醇析-中和溶解-酮析法將中度脫乙酰甲殼素從所述溫和加熱處理過的溶液中分離出來，獲得濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
<10>.根據<9>所述的方法，其中所述分離操作包括以下步驟：
醇析：將所述溫和加熱處理過的溶液與乙醇混合，中度脫乙酰甲殼素從乙醇溶液中析出，將析出物分離出來，用乙醇水溶液洗滌，去除析出物上大部分堿，得到的固體為含堿的中度脫乙酰甲殼素；
中和溶解：將所述上述醇析步驟獲得的含堿的中度脫乙酰甲殼素與稀酸水溶液混合，酸堿中和，調節ph為6～7，形成粘性溶液；
酮析：將上述中和溶解步驟獲得的粘性溶液與丙酮混合，中度脫乙酰甲殼素從丙酮溶液中析出，將析出物分離出來，并丙酮水溶液洗滌之，去除析出物上的無機鹽等雜質，得到的固體即為濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
具體實施方式
本發明的目的是提供一種以蝦蟹殼為原料，先將蝦蟹殼粉溶解在堿溶液中形成蝦蟹殼粉的溶液，再對蝦蟹殼粉溶液溫和加熱使之同時發生脫蛋白和脫乙酰反應，以此制備出中度脫乙酰水溶性甲殼素的方法。
在本發明中，脫乙酰度50％左右，且氨基葡萄糖結構單元與n-乙酰氨基葡萄糖結構單元無規連接的甲殼素類高分子，由于分子間氫鍵部分被破壞，所以能在中性水中溶解，可稱為中度脫乙酰水溶性甲殼素。
由于存在大量的分子內和分子間的氫鍵，甲殼素的溶解性很差，在水、稀酸、稀堿、常規有機溶劑中均不能溶解，所以更廣的應用受到限制。為了改善甲殼素溶解后形成的溶液熱穩定性很差，且為了保證脫乙酰在均相條件下進行，本發明方法使用了氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿配成水溶液來溶解蝦蟹殼粉并且輔以冰凍的方法。在本發明所述的混合苛性堿中以naoh為主，因為lioh在此條件下在水中的溶解度有限，所以多用無益。
因此，在本發明所述混合苛性堿水溶液中含有8～18質量％的naoh，1～4質量％的lioh，其余為不可避免的雜質和水。優選地，所述混合苛性堿水溶液中含有10～16質量％的naoh，1～3質量％的lioh，其余為不可避免的雜質和水。更優選地，所述混合苛性堿水溶液中含有14～16質量％的naoh，1～3質量％的lioh，其余為不可避免的雜質和水。
值得指出的是，如果沒有特別指出，在本發明中所涉及的百分比含量均是指質量百分比含量。
蝦蟹殼粉在堿水溶液中在低溫下溶解的可能原因是：堿促進水滲透到蝦蟹殼的體相，冰凍時水發生反常的膨脹而破壞甲殼素、蛋白質致密的結晶結構，使之松散；另外低溫下oh-與蝦蟹殼中的甲殼素、蛋白質形成的氫鍵作用比這些大分子物質自身的氫鍵強，能使大分子物質較好地溶劑化而實現溶解；而lioh的加入能促進溶解，但原因不清楚。
在本發明中，還需要對在堿性水溶液中的蝦蟹殼粉進行在水溶液凝固點以下的冰凍處理。所述凝固點以下的冰凍處理是指冰凍處理時的溫度比溶液凝固點低約5℃以下即可，溫度越低冰凍越快，耗時越短，但過低的溫度導致能耗過高，所以可選擇凝固點以下5-20℃進行冰凍操作，優選凝固點以下5-10℃進行冰凍操作。
在本發明的一個具體實施方案中，所述的冰凍處理還組合采用了在冰凍前低溫攪拌前處理+冰凍+解凍后的淺冷攪拌后處理，即，不是直接進行冰凍，而是在冰凍前先進行低溫攪拌，然后冰凍，接著在解凍之后進行淺冷攪拌處理。采用這種組合方式溶解蝦蟹殼粉的能力要比現有技術中冰凍+溫熱解凍的方式強。即，在本發明中，在略高于溶液凝固點的低溫下浸漬并攪拌，然后置于溶液凝固點以下的低溫下冷凍，使之徹底結冰，再使結冰的混合物解凍，解凍后在淺冷條件下攪拌處理，其中所述解凍后在淺冷下攪拌是指在-10℃～10℃的溫度下攪拌，優選為在-6℃～6℃的溫度下攪拌。徹底結冰是指結冰比率達到或超過99％。
在本發明中，根據氫氧化鈉和氫氧化鋰的質量濃度，并考慮蝦蟹殼粉溶解率的需要，選擇溶解和冰凍(簡稱凍融)交替操作的次數。因為兩種堿的濃度和配比不合適、凍融交替操作次數少時溶解率雖然不高，但也能溶解部分蝦蟹殼粉，這部分溶解的蝦蟹殼形成溶液經加熱處理也能制出中度脫乙酰水溶性甲殼素，只不過操作時間長、目標產物收率低。
關于本發明中所述的水溶液凝固點的說明如下：
1.)水溶液的組成：首輪凍融操作中，冰凍時，水溶液基本是由naoh+lioh+h2o組成，有少量的蝦蟹殼粉溶解在其中，因為首輪冰凍前的低溫浸漬攪拌是為了使水溶液能更好地滲透進入蝦蟹殼粉的內部，利于冰凍時利用反常膨脹效應使蝦蟹殼的結晶結構破壞，該處理并不會使大部分蝦蟹殼粉溶解。二輪及以后凍融操作中，冰凍處理時溶液中溶解的蝦蟹殼粉較多，水溶液主要是由naoh+lioh+溶解的蝦蟹殼粉+h2o組成。
2.)是否溶解蝦蟹殼粉對水溶液的凝固點影響不大。比如，下面提及的實施例2中，15％naoh+2％lioh的水溶液在-35℃就能結冰；加入蝦蟹殼粉，首輪凍融處理，水溶液在-35℃也能結冰；首輪凍融處理后，絕大部分蝦蟹殼粉都已溶解，形成粘性溶液，若進行二輪冰凍，粘性溶液在-35℃也能結冰。是否溶解蝦蟹殼粉對水溶液的凝固點影響不大的可能原因：①蝦蟹殼粉溶解后對水溶液的極性影響小；②蝦蟹殼粉在溶液中的濃度并不高。下面提及的實施例2實際采用的冰凍溫度為-45℃，目的是使結冰時間短些。
3.)水溶液的凝固點數值主要取決于堿的濃度，通常情況下，naoh在20質量％左右時凝固點為最低值，堿濃度太低或太高時凝固點都比最低值高。本發明中的混合苛性堿溶液的凝固點規律與此相似，并且可以參考naoh水溶液的凝固點數據來選擇。本發明中所涉及的各種混合苛性堿水溶液及其與蝦蟹殼粉形成的溶液在-40℃都能結冰。
在本發明中，蝦蟹殼粉在不同堿溶液中的溶解情況，以及蝦蟹殼粉溶解后形成質量分率為1.5％的溶液受熱時發生兩相分離時的臨界溫度見下表1。
表1
從表1可以看出，單純使用10％naoh，蝦蟹殼粉溶解效果差，需凍融操作交替反復6次以上才能使溶解率達98％。10％naoh中蝦蟹殼粉質量分率為1.5％的溶液的分相溫度為28℃，高于此溫度，溶液中會析出絮狀的聚合物，體系變成非均相，不能實現均相脫乙酰反應，非均相體系中是不可能制出水溶性產物的，所以對比文件中只能在25℃左右反應。因為反應溫度低，所以需很長時間才能使脫乙酰度達50％。
15％naoh+2％lioh中蝦蟹殼粉溶解效果好，凍融操作只需1次就能使溶解率達98％以上。15％naoh+2％lioh中蝦蟹殼粉質量分率為1.5％的溶液的分相溫度為62℃，在此溫度以下溶液均能保持為均相。因為反應溫度可提高至60℃，脫乙酰反應速率得到大幅度提高，所以反應時間比對比文件大幅度降低。
單純使用naoh時，其濃度為15％左右時，溶液的溶解能力最強，低于此值或高于此值，溶解效果都不好。單純使用lioh時，蝦蟹殼粉在各種濃度的溶液中均不能溶解。naoh為15％左右時加入少量的lioh溶解能力卻很強。所以兩者之間是有某種協同溶解效應的。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的方法包括以下步驟：
(1)脫鈣步驟。具體地，可以將凈蝦蟹殼粉碎后加入鹽酸脫鈣，得脫鈣蝦蟹殼粉。脫鈣其實是用酸與蝦蟹殼中的碳酸鈣反應，使之溶解脫除，所以除了使用鹽酸之外，也可以使用edta、檸檬酸等其他酸來實現脫鈣。
(2)脫色步驟具體地，可以將步驟(1)所的脫鈣蝦蟹殼粉與濃甲酸溶液混合溶出色素后經固液分離，所得固體為脫色蝦蟹殼粉。脫色操作除用濃甲酸外也可以用高錳酸鉀、雙氧水等氧化脫色，但甲酸與后兩者的脫色原理不同，甲酸主要是將色素溶解出來而實現脫色，后兩者是將色素氧化褪色而實現脫色。
(3)溶解步驟。溶解步驟是本發明最關鍵的步驟。具體地，將步驟(2)所得脫色蝦蟹殼粉與氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿水溶液混合，在略高于溶液凝固點的低溫下浸漬并攪拌，然后置于溶液凝固點以下的低溫下冷凍，使之徹底結冰，再使結冰的混合物解凍，解凍后在淺冷條件下攪拌處理，得粘性溶液。
在本發明中，所述略高于溶液凝固點的低溫是指浸漬處理時的溫度比溶液凝固點高2-10℃，溫度更高些也可以，但需增加冰凍的次數。凝固點以下的冰凍是指冰凍處理時的溫度比溶液凝固點低5℃以下即可，溫度越低冰凍越快，耗時約短，但過低的溫度導致能耗過高，所以可選擇凝固點以下5-20℃進行冰凍操作。徹底結冰是指結冰比率達到或超過99％。
(4)去除不溶雜質的步驟。具體地，可以將步驟(3)所得粘性溶液進行固液分離，去除溶液中少量不溶性雜質，得純凈溶液；
(5)同步脫蛋白脫乙酰的步驟。所述同步脫蛋白脫乙酰中的同步是指脫蛋白的反應和脫乙酰的反應是在同一步驟中同時進行。這也是本發明的一個工藝優點。具體地，將步驟(4)所得純凈溶液在均相條件下進行溫和加熱，通常加熱為2～8小時，至甲殼素的脫乙酰度約為50％時停止加熱。所述溫和加熱是指溫度在25-60℃進行的加熱，特別是指在40～60℃的加熱。
值得指出的是，當前的現有技術中通常只能在25℃及以下的溫度下反應，溫度高于25℃溶解的甲殼素就從溶液中析出，變成非均相體系了。蝦蟹殼以溶解狀態進行脫乙酰對于產品的水溶性至關重要，因為以固體聚集態與堿溶液發生固液非均相反應中即使脫乙酰度是50％的甲殼素也不會在水中溶解。現有技術為保證不使溶解的蝦蟹殼或甲殼素不從溶液中析出，只能在25℃及以下的溫度下反應。本發明優選條件下，能使反應溫度提高到60℃也能溶解的蝦蟹殼或甲殼素不從溶液中析出，從而快速制備出中度脫乙酰水溶性甲殼素。所以本發明解決了現有均相脫乙酰反應時溫度不能高于30℃的難題。
(6)分離：采用醇析-中和溶解-酮析法將中度脫乙酰甲殼素從步驟(5)所得溫和加熱處理過的溶液中分離出來，得濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素；以及
(7)干燥：將分離步驟(6)所得濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素進行干燥處理，所得固體物質即為干態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
在本發明中，步驟(2)脫色中使用的濃甲酸溶液是濃度通常為80％～90％的甲酸水溶液。
將脫乙酰度約為50％的中度脫乙酰甲殼素從均相透明的強堿性溶液中分離出來，得到中性產物，以利于其在生物醫藥上的應用。現有技術是先用將堿性溶液中和調至中性，在加入水溶性有機溶劑比如乙醇或丙酮，使中度脫乙酰甲殼素從均相溶液中析出，從而實現分離。本人也曾試用過該方法，先中和在用乙醇沉淀，由于50％的中度脫乙酰甲殼素在中性條件下溶液性較好，所以即使乙醇的濃度提至很高耗費大量的乙醇，從溶液中析出的中度脫乙酰甲殼素也較少，得率低。由于本發明在優選的實施例中使用的堿濃度還是較高的，所以中和之后溶液中的鹽濃度也較高，加入丙酮發現丙酮與高濃度鹽水溶液不相容，分為兩層，所以先中和再加丙酮也不適合于優選實施例。本人偶然發現，50％的中度脫乙酰甲殼素的堿性水溶液不中和直接加入乙醇卻能輕易將中度脫乙酰甲殼素從溶液中析出，但同時也有堿從水中析出，所以需對析出物洗滌，去除其上附著的大部分堿。再加酸中和，中度脫乙酰甲殼素再次發生溶解，部分的堿已脫除，所以中和耗酸量大幅度降低，且溶液中形成的鹽的濃度也會很低，此時加入丙酮不會再發生不相容的情況，且加入丙酮能較好地將中度脫乙酰甲殼素從溶液中析出，收率較高。此步若加乙醇則中度脫乙酰甲殼素較難從溶液中析出，收率極低。總的來說先乙醇沉析、再中和溶解、再丙酮沉析可高收率地從堿溶液中分離出目標產物中度脫乙酰甲殼素。
在本發明的一個具體實施方案中，步驟(6)分離操作中所提到的醇析-中和溶解-酮析法包含以下步驟：
(6-1)醇析：將步驟(5)所得溫和加熱處理過的溶液與乙醇混合，中度脫乙酰甲殼素從乙醇溶液中析出，將析出物分離出來，并乙醇水溶液洗滌之，去除析出物上大部分堿，得到的固體為含堿的中度脫乙酰甲殼素；
(6-2)中和溶解：將步驟(6-1)所得含堿的中度脫乙酰甲殼素與稀酸水溶液混合，酸堿中和，調節ph為6～7，形成粘性溶液；
(6-3)酮析：將步驟(6-2)所得的粘性溶液與丙酮混合，中度脫乙酰甲殼素從丙酮溶液中析出，將析出物分離出來，并丙酮水溶液洗滌之，去除析出物上的無機鹽等雜質，得到的固體即為濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
在本發明中，上述分離操作步驟(6-1)醇析中溫和加熱處理過的溶液與乙醇混合后乙醇與水的質量比為3∶1～6∶1；洗滌所用的乙醇水溶液中乙醇與水的質量比為4∶1～6∶1。
在本發明中，上述分離操作步驟(6-2)中和溶解中所使用的稀酸為稀鹽酸、稀甲酸、稀乙酸。
在本發明中，上述分離操作步驟(6-3)酮析中粘性溶液與丙酮混合后丙酮與水的質量比為3∶1～7∶1；洗滌所用的丙酮水溶液中丙酮與水的質量比為5∶1～7∶1。
相比于現有技術，本發明能夠獲得如下的有益效果：
1.直接使用蝦蟹殼為原料，使脫蛋白和脫乙酰在同一步中進行，主要工藝過程：脫鈣→脫色→同步脫蛋白脫乙酰。相比現有技術，本發明工藝流程縮短。
2.利用lioh和naoh的協同溶解作用，并配以低溫攪拌浸漬前處理-冰凍-解凍-淺冷攪拌的溶解技術，可以使脫色蝦蟹殼粉僅通過一次冰凍-解凍操作就能實現良好的溶解，無需冰凍、解凍交替反復進行，相比現有技術，本發明大幅度降低溶解操作所需時間。
3.lioh和naoh的協同作用使形成的溶液熱穩定性有較大幅度的提高，均相脫蛋白脫乙酰的操作溫度可達60℃。由于反應溫度提高，反應速度加快，本發明優選的反應體系甲殼素的脫乙酰度達50％耗時僅需2～8小時，比現有技術大幅度降低。
4.所得中度脫乙酰甲殼素產品為棉白色，能溶解于ph為中性的水，且形成溶液的ph也為中性，有望應用于酸堿刺激敏感場合。
實施例
下面，進一步以實施例更具體地描述本發明，但是本發明絕不是僅限于這些實施例。
實施例1
(1)脫鈣：凈蝦蟹殼粉碎后逐步加入6％鹽酸脫鈣，加入鹽酸后固體顆粒不再產生氣泡、體系ph下降至3～4時，停止加入鹽酸，靜置2小時后，分離出固體，得脫鈣蝦蟹殼粉；
(2)脫色：將步驟(1)所的脫鈣蝦蟹殼粉與80％濃甲酸溶液混合，固液質量比為1∶10，攪拌溶出色素后經固液分離、水洗滌、干燥，所得固體為脫色蝦蟹殼粉；
(3)溶解：將步驟(2)所得脫色蝦蟹殼粉與氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿水溶液混合，固液質量比為1∶70，混合苛性堿水溶液的組成為naoh含量14％、lioh含量為3％、其余為不可避免的雜質和水，在-25℃的低溫下浸漬并攪拌2小時，然后置于-40℃的低溫下冷凍，使結冰率達到99％以上，再使結冰的混合物解凍，解凍后在-6～6℃下攪拌處理3小時，經過1輪凍融處理之后，蝦蟹殼粉溶解率達98％，溶液粘度(25℃測定，采用通常的旋轉粘度計測定方法測定)由凍融前的3mpa·s-1大幅提升至凍融處理后的約1300mpa·s-1；
(4)去除不溶雜質：將步驟(3)所得粘度約1300mpa·s-1粘性固液混合物進行固液分離，去除溶液中少量不溶性雜質，得純凈的粘度約1300mpa·s-1溶液；
(5)同步脫蛋白脫乙酰：將步驟(4)所得純凈溶液在均相條件下40℃溫和加熱，反應8小時后至甲殼素的脫乙酰度約為50％時停止加熱；
(6)分離：將步驟(5)所得溫和加熱處理過的溶液與乙醇混合，混合后乙醇與水的質量比為3∶1，中度脫乙酰甲殼素從乙醇溶液中析出，將析出物分離出來，并乙醇水溶液(乙醇水質量比為6∶1)洗滌之，去除析出物上大部分堿，得到的固體為含堿的中度脫乙酰甲殼素；然后將含堿的中度脫乙酰甲殼素與2％的稀乙酸水溶液混合，酸堿中和，攪拌溶解，調節ph為6～7，形成粘性溶液；將所得的粘性溶液與丙酮混合，混合后丙酮與水的質量比為3∶1，中度脫乙酰甲殼素從丙酮溶液中析出，將析出物分離出來，并丙酮水溶液(丙酮水質量比為7∶1)洗滌之，去除析出物上的無機鹽等雜質，得到的固體即為濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
(7)干燥：將步驟(6)所得濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素進行干燥處理，所得固體物質即為干態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
實施例2
(1)脫鈣：凈蝦蟹殼粉碎后逐步加入6％鹽酸脫鈣，加入鹽酸后固體顆粒不再產生氣泡、體系ph下降至3～4時，停止加入鹽酸，靜置2小時后，分離出固體，得脫鈣蝦蟹殼粉；
(2)脫色：將步驟(1)所的脫鈣蝦蟹殼粉與85％濃甲酸溶液混合，固液比為1∶9，攪拌溶出色素后經固液分離、水洗滌、干燥，所得固體為脫色蝦蟹殼粉；
(3)溶解：將步驟(2)所得脫色蝦蟹殼粉與氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿水溶液混合，固液質量比為1∶60，混合苛性堿水溶液的組成為naoh含量15％、lioh含量為2％、其余為不可避免的雜質和水，在-30℃的低溫下浸漬并攪拌2小時，然后置于-45℃的低溫下冷凍，使結冰率達99％以上，再使結冰的混合物解凍，解凍后在-6～6℃下攪拌處理2小時，經過1輪凍融處理蝦蟹殼粉溶解率達98％以上，溶液粘度(25℃測定，測定方法同實施例1)由凍融前的3mpa.s-1大幅提升至凍融處理后的約1600mpa·s-1；
(4)去除不溶雜質：將步驟(3)所得粘度約1600mpa.s-1的高粘性固液混合物進行固液分離，去除溶液中少量不溶性雜質，得純凈的粘度約1600mpas的溶液；
(5)同步脫蛋白脫乙酰：將步驟(4)所得純凈溶液在均相條件下60℃溫和加熱，反應2小時后至甲殼素的脫乙酰度約為50％時停止加熱；
(6)分離：將步驟(5)所得溫和加熱處理過的溶液與乙醇混合，混合后乙醇與水的質量比為6∶1，中度脫乙酰甲殼素從乙醇溶液中析出，將析出物分離出來，并乙醇水溶液(乙醇水質量比為4∶1)洗滌之，去除析出物上大部分堿，得到的固體為含堿的中度脫乙酰甲殼素；然后將含堿的中度脫乙酰甲殼素與2％的稀鹽酸水溶液混合，酸堿中和，攪拌溶解，調節ph為6～7，形成粘性溶液；將所得的粘性溶液與丙酮混合，混合后丙酮與水的質量比為7∶1，中度脫乙酰甲殼素從丙酮溶液中析出，將析出物分離出來，并丙酮水溶液(丙酮水質量比為5∶1)洗滌之，去除析出物上的無機鹽等雜質，得到的固體即為濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
(7)干燥：將步驟(6)所得濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素進行干燥處理，所得固體物質即為干態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
實施例3
(1)脫鈣：凈蝦蟹殼粉碎后逐步加入6％鹽酸脫鈣，加入鹽酸后固體顆粒不再產生氣泡、體系ph下降至3～4時，停止加入鹽酸，靜置2小時后，分離出固體，得脫鈣蝦蟹殼粉；
(2)脫色：將步驟(1)所的脫鈣蝦蟹殼粉與90％濃甲酸溶液混合，固液比為1∶15，攪拌溶出色素后經固液分離、水洗滌、干燥，所得固體為脫色蝦蟹殼粉；
(3)溶解：將步驟(2)所得脫色蝦蟹殼粉與氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿水溶液混合，固液質量比為1∶65，混合苛性堿水溶液的組成為naoh含量16％、lioh含量為1％、其余為不可避免的雜質和水，在-30℃的低溫下浸漬并攪拌2小時，然后置于-40℃的低溫下冷凍，使結冰率達到99％以上，再使結冰的混合物解凍，解凍后在-6～6℃下攪拌處理3小時，經過1輪凍融處理蝦蟹殼粉溶解率達98％，溶液粘度(25℃測定，測定方法同實施例1)由凍融前的3mpa·s-1大幅提升至凍融處理后的約1400mpa·s-1；
(4)去除不溶雜質：將步驟(3)所得粘度約1400mpa·s-1的高粘性固液混合物進行固液分離，去除溶液中少量不溶性雜質，得純凈的粘度約1400mpa·s-1的溶液；
(5)同步脫蛋白脫乙酰：將步驟(4)所得純凈溶液在均相條件下50℃溫和加熱，反應4小時后至甲殼素的脫乙酰度約為50％時停止加熱；
(6)分離：將步驟(5)所得溫和加熱處理過的溶液與乙醇混合，混合后乙醇與水的質量比為4∶1，中度脫乙酰甲殼素從乙醇溶液中析出，將析出物分離出來，并乙醇水溶液(乙醇水質量比為4∶1)洗滌之，去除析出物上大部分堿，得到的固體為含堿的中度脫乙酰甲殼素；然后將含堿的中度脫乙酰甲殼素與1.5％的稀甲酸水溶液混合，酸堿中和，攪拌溶解，調節ph為6～7，形成粘性溶液；將所得的粘性溶液與丙酮混合，混合后丙酮與水的質量比為4∶1，中度脫乙酰甲殼素從丙酮溶液中析出，將析出物分離出來，并丙酮水溶液(丙酮水質量比為6∶1)洗滌之，去除析出物上的無機鹽等雜質，得到的固體即為濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
(7)干燥：將步驟(6)所得濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素進行干燥處理，所得固體物質即為干態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
實施例4
(1)脫鈣：凈蝦蟹殼粉碎后逐步加入6％鹽酸脫鈣，加入鹽酸后固體顆粒不再產生氣泡、體系ph下降至3～4時，停止加入鹽酸，靜置2小時后，分離出固體，得脫鈣蝦蟹殼粉；
(2)脫色：將步驟(1)所的脫鈣蝦蟹殼粉與90％濃甲酸溶液混合，固液比為1∶15，攪拌溶出色素后經固液分離、水洗滌、干燥，所得固體為脫色蝦蟹殼粉；
(3)溶解：將步驟(2)所得脫色蝦蟹殼粉與氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿水溶液混合，固液質量比為1∶80，混合苛性堿水溶液的組成為naoh含量8％、lioh含量為4％、其余為不可避免的雜質和水，在-10℃的低溫下浸漬并攪拌8小時，然后置于-25℃的低溫下冷凍，使結冰率達到99％以上，再使結冰的混合物解凍，解凍后在-6～6℃下攪拌處理4小時，經過2輪凍融處理蝦蟹殼粉溶解率約90％，溶液粘度(25℃測定，測定方法同實施例1)由凍融前的2.5mpa·s-1大幅提升至凍融處理后的約1000mpa·s-1；
(4)去除不溶雜質：將步驟(3)所得粘度約1000mpa·s-1的高粘性固液混合物進行固液分離，去除溶液中少量不溶性雜質，得純凈的粘度約1000mpas的溶液；
(5)同步脫蛋白脫乙酰：將步驟(4)所得純凈溶液在均相條件下30℃溫和加熱，反應30小時后至甲殼素的脫乙酰度約為50％時停止加熱；
(6)分離：將步驟(5)所得溫和加熱處理過的溶液與乙醇混合，混合后乙醇與水的質量比為4∶1，中度脫乙酰甲殼素從乙醇溶液中析出，將析出物分離出來，并乙醇水溶液(乙醇水質量比為4∶1)洗滌之，去除析出物上大部分堿，得到的固體為含堿的中度脫乙酰甲殼素；然后將含堿的中度脫乙酰甲殼素與1.5％的稀乙酸水溶液混合，酸堿中和，攪拌溶解，調節ph為6～7，形成粘性溶液；將所得的粘性溶液與丙酮混合，混合后丙酮與水的質量比為4∶1，中度脫乙酰甲殼素從丙酮溶液中析出，將析出物分離出來，并丙酮水溶液(丙酮水質量比為6∶1)洗滌之，去除析出物上的無機鹽等雜質，得到的固體即為濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
(7)干燥：將步驟(6)所得濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素進行干燥處理，所得固體物質即為干態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
實施例5
(1)脫鈣：凈蝦蟹殼粉碎后逐步加入6％鹽酸脫鈣，加入鹽酸后固體顆粒不再產生氣泡、體系ph下降至3～4時，停止加入鹽酸，靜置2小時后，分離出固體，得脫鈣蝦蟹殼粉；
(2)脫色：將步驟(1)所的脫鈣蝦蟹殼粉與90％濃甲酸溶液混合，固液比為1∶15，攪拌溶出色素后經固液分離、水洗滌、干燥，所得固體為脫色蝦蟹殼粉；
(3)溶解：將步驟(2)所得脫色蝦蟹殼粉與氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿水溶液混合，固液質量比為1∶80，混合苛性堿水溶液的組成為naoh含量18％、lioh含量為1％、其余為不可避免的雜質和水，在-28℃的低溫下浸漬并攪拌4小時，然后置于-45℃的低溫下冷凍，使結冰率達到99％以上，再使結冰的混合物解凍，解凍后在-10～10℃下攪拌處理4小時，經過3輪凍融處理蝦蟹殼粉溶解率約93％，溶液粘度(25℃測定，測定方法同實施例1)由凍融前的3mpa·s-1大幅提升至凍融處理后的約1100mpas；
(4)去除不溶雜質：將步驟(3)所得粘度約1100mpa.s-1的高粘性固液混合物進行固液分離，去除溶液中少量不溶性雜質，得純凈的粘度約1100mpa.s-1的溶液；
(5)同步脫蛋白脫乙酰：將步驟(4)所得純凈溶液在均相條件下38℃溫和加熱，反應10小時后至甲殼素的脫乙酰度約為50％時停止加熱；
(6)分離：將步驟(5)所得溫和加熱處理過的溶液與乙醇混合，混合后乙醇與水的質量比為4∶1，中度脫乙酰甲殼素從乙醇溶液中析出，將析出物分離出來，并乙醇水溶液(乙醇水質量比為4∶1)洗滌之，去除析出物上大部分堿，得到的固體為含堿的中度脫乙酰甲殼素；然后將含堿的中度脫乙酰甲殼素與1.5％的稀乙酸水溶液混合，酸堿中和，攪拌溶解，調節ph為6～7，形成粘性溶液；將所得的粘性溶液與丙酮混合，混合后丙酮與水的質量比為4∶1，中度脫乙酰甲殼素從丙酮溶液中析出，將析出物分離出來，并丙酮水溶液(丙酮水質量比為6∶1)洗滌之，去除析出物上的無機鹽等雜質，得到的固體即為濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
(7)干燥：將步驟(6)所得濕態中度脫乙酰水溶性甲殼素進行干燥處理，所得固體物質即為干態中度脫乙酰水溶性甲殼素。
對比例1
(1)脫鈣：與實施例2相同；
(2)脫色：與實施例2相同；
(3)溶解：將步驟(2)所得脫色蝦蟹殼粉與氫氧化鈉和氫氧化鋰的混合苛性堿水溶液混合，固液質量比為1∶60，混合苛性堿水溶液的組成為naoh含量15％、lioh含量為2％、其余為不可避免的雜質和水，常溫下浸漬8小時，然后置于-45℃的低溫下冷凍，使結冰率達99％以上，再使結冰的混合物在常溫下解凍3小時，經過3輪凍融交替處理蝦蟹殼粉溶解率才能達到98％以上，溶液粘度(25℃測定，測定方法同實施例1)由凍融前的3mpas大幅提升至凍融處理后的約1600mpas；
(4)去除不溶雜質：與實施例2相同；
(5)同步脫蛋白脫乙酰：與實施例2相同；
(6)分離：與實施例2相同；
(7)干燥：與實施例2相同。
對比例2
(1)脫鈣：與實施例2相同；
(2)脫色：與實施例2相同；
(3)溶解：將步驟(2)所得脫色蝦蟹殼粉與氫氧化鈉水溶液混合，固液質量比為1∶60，氫氧化鈉水溶液中naoh含量15％，其余為不可避免的雜質和水，常溫下浸漬8小時，然后置于-45℃的低溫下冷凍，使結冰率達99％以上，再使結冰的混合物在常溫下解凍3小時，經過5輪凍融交替處理蝦蟹殼粉溶解率僅能達到93％，溶液粘度(25℃測定，測定方法同實施例1)由凍融前的約3mpa·s-1提升至凍融處理后的約1300mpa·s-1；
(4)去除不溶雜質：與實施例2操作方法相同；
(5)同步脫蛋白脫乙酰：將步驟(4)所得純凈溶液在均相條件下36℃溫和加熱，反應20小時后至甲殼素的脫乙酰度約為50％時停止加熱；該步若將溫度提升至實施例2相同的60℃，則溶解的甲殼素會從溶液中析出，變成非均相體系，最終得到的產品不能溶解于水；
(6)分離：與實施例2相同；
(7)干燥：與實施例2相同。
從上述可以看出，對于對比例1而言，其他條件都與實施例2相同，只是凍融溶解方法不同，即冰凍前無低溫浸漬攪拌前處理，解凍后無淺冷條件下的攪拌后處理。對比例2中不使用lioh，naoh濃度與實施例2相同，采用常規的凍融處理的方法，即冰凍前無低溫浸漬攪拌前處理，解凍后無淺冷條件下的攪拌后處理。
下表2示出了對比例1和2與實施例2的操作方法以及效果的主要不同點。
表2
工業可應用性
本發明可以適用于以蝦蟹殼為原料來制備中度脫乙酰水溶性甲殼素，由于本發明均相脫乙酰反應通常耗時僅需2～8小時，比現有技術大幅度降低，且所得中度脫乙酰甲殼素產品為棉白色，能溶解于ph為中性的水，且形成溶液的ph也為中性，有望在工業上得到廣泛應用，尤其是可能潛在應用于酸堿刺激敏感場合。