一種篩選海洋微生物菌株降解蝦蟹殼粉制備幾丁質的方法與流程
本發明涉及一種發酵蝦蟹殼粉生產幾丁質的方法，尤其是一種篩選海洋微生物菌株降解蝦蟹殼粉制備幾丁質的方法。
背景技術：
幾丁質，又名甲殼素、殼多糖，是N-乙酰葡萄糖經過β連接聚合而成的結構同多糖。它是類白色的無定形物質，和鈣鹽混合則變得很堅硬。目前，幾丁質絕大部分是利用化學法制取。隨著我國水產業的發展，蟹殼和蝦殼的產生越來越多，目前絕大部分的蝦蟹殼沒有較好的處理方法，對環境產生了很大程度的污染。研究表明，蝦蟹殼類物質的成分是由20-30%的幾丁質、30-40%的蛋白質和礦物類構成，其中礦物類主要是碳酸鈣，含量為30-50%。工業上處理蝦蟹殼制取幾丁質的三步驟：鹽酸除鹽、堿類物質加熱去除蛋白質和其他有機物、利用高錳酸鉀和草酸去除色素；這種制取幾丁質的方法的優點在于過程簡單，處理周期短、效率高，短時間內得到大量幾丁質，有不錯的經濟效益。但也存在諸多弊端：使用大量酸堿和脫色劑類物質，處理不當時會產生嚴重的環境污染；所使用的強酸強堿不論在運輸還是在保存生產上都存在一定的安全風險；在制取的過程中幾丁質需要長時間和NaOH、HCl等接觸，這可能導致幾丁質發生空間結構的變化導致得到的產品結構不一；脫色劑處理可能引入新的雜質。
隨著生物技術的突飛猛進，采用生物法制取幾丁質開始進入人們的視野。就目前來看，生物法制取幾丁質主要有酶法和發酵法兩種方法。利用生物酶，如：蛋白質酶，具有高效、反應條件溫和的特點。這樣制取的產品品質較高，大大降低了污染物的產生，減少了能耗，其他有用的物質也可以得到回收利用。但是該過程首先要制備酶，而且還牽扯到酶的保存及穩定性的問題，無疑增加了制備幾丁質的成本。發酵法生產幾丁質，具有無毒害、污染小、提取工藝簡單等優點，因此受到越來越多的重視。相對于國外研究，國內采用微生物發酵提取甲殼素的研究報道并不多見。目前使用混菌發酵蝦蟹殼粉制備幾丁質報道較多。混菌發酵則可避免上述缺陷，但是過程繁瑣，培養基復雜，增加了染菌的概率，需要更多的人力和時間。所以，使用同時具備產酸和蛋白酶的活力的單一菌株進行發酵蝦蟹殼粉來制備幾丁質，具有更重要的現實意義，但篩選同時高產酸和高產蛋白酶的微生物菌株，提高發酵法生產幾丁質效率的問題成為現研究階段的瓶頸。
由于大多數傳統的從陸地分離到的微生物菌株，自身不具備同時產酸和產蛋白酶的特性或某一性質較弱，需要進行連續的兩步發酵，同時還需要配合其他輔助手段，過程繁瑣、實驗周期較長。而多種菌共同培養發酵，理論上可以得到良好的效果，但多種菌發酵在菌株保存、培育、研究條件上都需要兼顧到，試驗和生產成本高，步驟繁雜。所以要想利用微生物一步發酵法從蝦蟹殼中生產幾丁質，并且進一步提高提取效率，還需要從自然界中篩選能發酵蝦蟹殼粉生產幾丁質的高效菌株。海洋微生物經過了漫長的環境適應過程，而且種類繁多，作為人類寶貴資源具有突出的特點和優勢，而且蝦蟹殼廢棄物主要來自海洋，本著追根溯源的觀點，應該從海洋這個寶藏中篩選能高效降解蝦蟹殼粉生產幾丁質的海洋微生物菌株。因此從海洋中尋找合適的微生物并通過優化其發酵條件提高其生產幾丁質的能力具有重要的理論和現實意義。蝦蟹殼中的幾丁質是非常有用的材料，如果高效利用的話，將產生可觀的經濟和社會效益。
技術實現要素：
由于工業制備幾丁質采用的化學方法容易污染環境、產品結構發生變化并引入新雜質，而現有的生物法制備幾丁質，由于其制備酶的成本高、難保存及易污染，并且培養基的制備復雜，過程繁瑣等諸多問題，本發明提出了一種篩選海洋微生物菌株降解蝦蟹殼粉制備幾丁質的方法，技術方案如下：
一種篩選海洋微生物菌株降解蝦蟹殼粉制備幾丁質的方法，其特征在于：包括如下步驟：產酸微生物菌株的篩選→產酸微生物菌株中產蛋白酶菌株的篩選→同時產酸、產蛋白酶但不產幾丁質酶菌株的篩選→降解蝦蟹殼粉生產幾丁質菌株的篩選→目標菌株16S rDNA的鑒定。
進一步的，所述一種篩選海洋微生物菌株降解蝦蟹殼粉制備幾丁質的方法具體操作步驟如下：
（1）產酸微生物菌株的篩選：
培養基I的制備：蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，碳酸鈣20克，瓊脂15-20克，陳海水1000毫升，pH7.6-7.8。
產酸微生物菌株的篩選：將從不同海域取的海水或海泥使用滅菌的陳海水稀釋10-1、10-2、10-3、10-4倍，分別將不同稀釋度的樣品涂布于篩選培養基I的平板上，然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d，挑選有明顯透明圈的單菌落，在2216E上三次三區劃線，挑取單菌落，即為產酸的微生物菌株。
（2）產酸微生物菌株中產蛋白酶菌株的的篩選：
培養基II的制備：脫脂奶粉5克，蛋白胨5克，酵母膏1克，瓊脂粉20克，陳海水1000mL，pH7.0-7.4。
將步驟（1）中篩選到的單菌落利用滅菌牙簽點接法接到篩選培養基II的平板上，然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d，挑選有明顯透明圈的單菌落，即為產酸微生物菌株中產蛋白酶菌株。
（3）同時產酸、產蛋白酶但不產幾丁質酶菌株的篩選：
培養基III的制備：幾丁質10克，蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，瓊脂15-20克，陳海水1000毫升，pH7.6-7.8。
同時產酸、產蛋白酶但不產幾丁質酶菌株的篩選：將步驟（2）中篩選到的單菌落進一步利用滅菌牙簽點接法接到篩選培養基III的平板上，然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d。挑選沒有明顯透明圈的單菌落，即為同時產酸、產蛋白酶但不產幾丁質酶菌株。
（4）降解蝦蟹殼粉生產幾丁質菌株的篩選：
培養基IV的制備：蝦蟹殼粉10克，蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，瓊脂15-20克，陳海水1000毫升，pH7.6-7.8。
降解蝦蟹殼粉生產幾丁質菌株的篩選：將步驟（3）中篩選到的單菌落利用滅菌牙簽點接法接到篩選培養基IV的平板上，然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d，挑選有明顯透明圈的單菌落，即為降解蝦蟹殼粉生產幾丁質菌株。
（5）目標菌株16S rDNA的鑒定：
目標菌株16S rDNA基因序列的PCR擴增：以菌體為模板，通過細菌通用引物，包括上游引物Eubac 27F：（5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和下游引物Eubac 1492R：（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），在聚合酶的作用下，經預變性、變性、退火、延伸、30個循環、延伸、獲得目標菌株的16S rDNA基因序列。
目標菌株16S rDNA的鑒定：1％的瓊脂糖電泳檢測PCR反應產物，并把所得的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中進行Blastn序列比對。
進一步的，所述PCR反應原料：模板 ：1μL，ddH2O ：35μL， buffer 10×PCR ：5μL，10mmol/L dNTP ：2μL，10μmol/L引物Eubac 27F：2μL，10μmol/L引物Eubac 1492R：2μL， Taq DNA聚合酶：1μL。
進一步的，所述所述PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃變性35s，55℃退火35s，72℃延伸l min，30個循環；72℃延伸10 min。
本發明與現有技術相比，有如下優點：
由于工業制備幾丁質采用的化學方法易污染環境，產品結構發生變化并引入新雜質，而現有的生物法制備幾丁質，由于其制備酶的成本高、難保存及易污染，并且存在培養基的制備復雜，過程繁瑣等諸多問題，本發明提出了一種篩選海洋微生物菌株降解蝦蟹殼粉制備幾丁質的方法，從海水中尋找目標菌株，通過平板微生物菌落發酵篩選，獲取能降解蝦蟹殼粉中礦物質及蛋白質，進一步制備幾丁質的高效目標菌株。此方法操作簡單，篩選效率高，步驟去繁就簡，利用微生物發酵法生產幾丁質，克服了利用化學法從蝦蟹殼中提取幾丁質對環境造成污染等弊端。同時原料采用海水，來源廣，制備的幾丁質品質大大提高，可以產生很好的經濟效益和社會效益。
附圖說明
圖1為從海洋環境篩選的產酸菌株圖片。
圖2為從海洋環境篩選既產酸又產蛋白酶的菌株圖片。
圖3為從既產酸又產蛋白酶菌株中篩選不產幾丁質酶的菌株圖片。
圖4從既產酸又產蛋白酶，但不產幾丁質酶的菌株中篩選能發酵蝦蟹殼粉生產幾丁質的微生物菌株。
圖5得到的目標菌株16S rDNA的電泳圖。
具體實施方式
下面結合附圖1-附圖5對本發明做進一步的闡述：
一種篩選海洋微生物菌株降解蝦蟹殼粉制備幾丁質的方法，其特征在于：包括如下步驟：產酸微生物菌株的篩選→產酸微生物菌株中產蛋白酶菌株的篩選→同時產酸、產蛋白酶但不產幾丁質酶菌株的篩選→降解蝦蟹殼粉生產幾丁質菌株的篩選→目標菌株16S rDNA的鑒定。
所述一種篩選海洋微生物菌株降解蝦蟹殼粉制備幾丁質的方法具體操作步驟如下：
（1）產酸微生物菌株的篩選：
培養基I的制備：蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，碳酸鈣20克，瓊脂15-20克，陳海水1000毫升，pH7.6-7.8。
產酸微生物菌株的篩選：將從不同海域取的海水或海泥使用滅菌的陳海水稀釋10-1、10-2、10-3、10-4倍，分別將不同稀釋度的樣品涂布于篩選培養基I的平板上，然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d，挑選有明顯透明圈的菌落，在2216E上三次三區劃線，挑取單菌落，即為產酸的微生物菌株。
（2）產酸微生物菌株中產蛋白酶菌株的的篩選：
培養基II的制備：脫脂奶粉5克，蛋白胨5克，酵母膏1克，瓊脂粉20克，陳海水1000mL，pH7.0-7.4。
將步驟（1）中篩選到的單菌落利用滅菌牙簽點接法接到篩選培養基II的平板上，然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d，挑選有明顯透明圈的單菌落，即為產酸微生物菌株中產蛋白酶菌株。
（3）同時產酸、產蛋白酶但不產幾丁質酶菌株的篩選：
培養基III的制備：幾丁質10克，蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，瓊脂15-20克，陳海水1000毫升，pH7.6-7.8。
同時產酸、產蛋白酶但不產幾丁質酶菌株的篩選：將步驟（2）中篩選到的單菌落進一步利用滅菌牙簽點接法接到篩選培養基III的平板上，然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d。挑選沒有明顯透明圈的單菌落，即為同時產酸、產蛋白酶但不產幾丁質酶菌株。
（4）降解蝦蟹殼粉生產幾丁質菌株的篩選：
培養基IV的制備：蝦蟹殼粉10克，蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，瓊脂15-20克,陳海水1000毫升，pH7.6-7.8。
降解蝦蟹殼粉生產幾丁質菌株的篩選：將步驟（3）中篩選到的單菌落利用滅菌牙簽點接法接到篩選培養基IV的平板上，然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d，挑選有明顯透明圈的單菌落，即為降解蝦蟹殼粉生產幾丁質菌株。
（5）目標菌株16S rDNA的鑒定：
目標菌株16S rDNA基因序列的PCR擴增：以菌體為模板，通過細菌通用引物，包括上游引物Eubac 27F：（5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和下游引物Eubac 1492R：（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），在聚合酶的作用下，經預變性、變性、退火、延伸、30個循環、延伸、獲得目標菌株的16S rDNA基因序列。
目標菌株16S rDNA的鑒定：1％的瓊脂糖電泳檢測PCR反應產物，并把所得的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中進行Blastn序列比對。
所述PCR反應原料：模板 ：1μL，ddH2O ：35μL， buffer 10×PCR ：5μL，10mmol/L dNTP ：2μL，10μmol/L引物Eubac 27F：2μL，10μmol/L引物Eubac 1492R：2μL， Taq DNA聚合酶：1μL。
所述所述PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃變性35s，55℃退火35s，72℃延伸l min，30個循環；72℃延伸10 min。
實施例1：
將不同地方的海水海泥少量加到裝有100mL陳海水的500mL三角瓶中，瓶中加5-10粒滅菌玻璃珠，按梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9依次稀釋后，分別涂布于產酸鑒定平板上，產酸鑒定平板：蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，碳酸鈣20克，瓊脂15-20克，陳海水1000毫升，pH7.6-7.8，25℃培養箱中培養2-3天。當平板上出現產生透明圈的菌落后，挑取透明圈較大的50個菌落在2216E平板上利用三區劃線法分離單菌落，在25℃培養箱中培養2-3天。將2216E平板上篩選所獲單菌落進一步重復劃線純化2-3次，獲得形態單一的產酸細菌，并給各菌株分別編號S1-S50。
有編號的產酸菌中產蛋白酶菌株的分離：將上述編號為S1-S50的50個菌株分別利用滅菌牙簽點接到蛋白酶篩選平板上，培養基配方為：脫脂奶粉5克，蛋白胨5克，酵母膏1克，瓊脂粉20克，陳海水1000mL，pH7.0-7.4。在25℃培養箱中培養2-3d。挑選透明圈比較大的菌落，即為產蛋白酶的細菌，共篩選到38株。
確定上述篩選38株菌株不產蛋白酶能降解幾丁質：將篩選到的38株細菌進一步利用滅菌牙簽點接法接到加有幾丁質的篩選平板上，培養基配方為：幾丁質10克，蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，瓊脂15-20克,陳海水1000毫升，pH7.6-7.8。在25℃培養箱中培養2-3d。結果沒有明顯透明圈的菌株為26株。
確定所篩選26株菌株能降解蝦蟹殼粉生產幾丁質：將上述篩選到的26株細菌利用滅菌牙簽點接到加有蝦蟹殼粉的篩選平板上，培養基配方為：過80目篩的蝦蟹殼粉10克，蛋白胨5克，酵母膏1克，磷酸高鐵0.01克，瓊脂15-20克,陳海水1000毫升，pH7.6-7.8。然后將平板放入25℃培養箱中培養2-3d。篩選到有明顯透明圈的菌株8個，并對透明圈直徑進行測量，根據直徑大小與菌落的直徑的比值進行排序，對比值較大的3株菌進行16S rDNA鑒定。
目標菌株的16S rDNA鑒定：
目標菌16S rDNA基因序列的PCR擴增：以菌體作為模板，使用前先把菌體加到0.1mL ddH2O中煮沸5分鐘，取1μL作為模板，用細菌通用引物：上游引物Eubac 27F：(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和下游引物Eubac 1492R：(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)，聚合酶鏈反應擴增目標菌株的16S rDNA基因序列；其中，反應條件為35μLddH2O，5μL 10×PCR buffer，2μL dNTP(10mmol/L)，2μL引物Eubac 27F（10μmol/L），2μL引物Eubac 1492R（10μmol/L），1μL Taq DNA聚合酶。PCR反應過程中，先95℃預變性5min，95℃變性35s，55℃退火35s，72℃延伸l min，30個循環；72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖電泳檢測PCR反應產物，得到的目標菌株16S rDNA電泳圖如圖5所示。
目標菌株的16S rDNA基因序列分析：PCR產物送上海生工生物技術公司測序，所得的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中進行Blastn序列比對，最終確定篩選到的3個發酵蝦蟹殼粉生產幾丁質的目標菌株均為弧菌屬Vibrio sp.。
以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。
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