本發明屬于生物技術領域，涉及一種基于環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術的檢測豬人住肉孢子蟲的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
住肉孢子蟲病是一類重要的食源性寄生蟲病，是由復頂亞門、孢子蟲綱、真球蟲目、住肉孢子蟲科、住肉孢子蟲屬原蟲寄生于動物肌肉和各臟器毛細血管內皮細胞內所引起的一類人獸共患原蟲病。目前，豬住肉孢子蟲病的病原有三種：米氏住肉孢子蟲(S.miescheriana)、豬人住肉孢子蟲(S.suihominis)和豬貓住肉孢子蟲(S.porcifelis)。豬人住肉孢子蟲中間宿主是豬，終末宿主是人和非人類的靈長類動物，人食入豬肉中的肉孢子蟲后有一定的危害，可引起人惡心、腹瀉。因此，開展對豬人住肉孢子蟲病的研究對人類健康及養殖業有重要的意義。
目前對豬住肉孢子蟲病的診斷技術主要依賴于臨床癥狀的觀察、流行病學調查、剖檢大體變化等作初步判斷，而確診則依賴顯微鏡檢觀察或組織病理學的染色技術。這些傳統方法存在費時費事、靈敏性和特異性不強、檢測程序繁瑣、工作量大等不足，很難適應現代化食品安全快速檢測的需要。雖然PCR方法雖然較傳統方法擁有操作簡單，靈敏性與特異性強等優點，但仍然需要3個小時左右的時間才能出結果，無法立即確診，并且必須配備專用儀器，且常有非特異性出現。
環介導等溫核酸擴增技術(LAMP)技術是一種新穎的恒溫核酸擴增方法。其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。該方法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，并且反應結果可通過添加SYBR Green I觀察體系顏色變化確定組織中是否感染豬人住肉孢子蟲，若感染，則體系為黃綠色，未感染則為橙黃色。目前，LAMP技術已經廣泛應到病原微生物的檢測上，在寄生蟲診斷方面也有部分報道，如旋毛蟲、牛巴貝斯蟲、胎兒毛滴蟲、賈第蟲、火雞組織滴蟲等，而在豬人住肉孢子蟲方面的研究卻是空白。與上述幾種實驗室診斷方法相比，環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術對儀器設備要求不高，具有操作簡單、臨床上容易做到、檢測時間短的特點。中國專利ZL201210494834.3公開了一種適用于火雞組織滴蟲LAMP檢測試劑盒，包括含有10x等溫反應緩沖液、BstDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、四種引物混合液、甜菜堿和去離子水的反應液A，以及含有1000x的熒光染料SYBR Green I的反應液B，通過肉眼檢測反應液顏色差異，實現至少為1個基因拷貝的檢測靈敏度。然而，基于火雞組織滴蟲與豬人住肉孢子蟲的病原學、寄生部位及各自生活史的不同，該試劑盒不能用于檢測豬人住肉孢子蟲。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，從而快速、準確、而且更加靈敏、高效地檢測豬人住肉孢子蟲。其設計理念是：充分利用LAMP技術特異性強、靈敏度高、快速且成本低等優點，并針對豬人住肉孢子蟲對靶基因的特點設定4種引物，利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。
為了達到上述目的，本發明的技術方案如下：
本發明提供了一種豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒，包括以下成分：
(1)反應液A：
含有10x等溫反應緩沖液、8000U/mL BstDNA聚合酶、0.5mM dNTP、2mM MgCl2、含1.4μM內引物1和1.4μM內引物2的內引物混合液、含0.2μM外引物1和0.2μM外引物2的外引物混合液、1M甜菜堿和去離子水，其中：
10x等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.8)、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％(m/V)曲拉通X-100(pH8.8，25℃)；
內引物1為:TCTACCATAAACTATGCCGACTAGACTTTGATTTCTCATGAGGTGC(SEQ ID No.1)，
內引物2為:ACCCCCTACTGTCGTTCTTGATTGTTAAAGACGAACTACTGCG(SEQ ID No.2)，
外引物1為:CGTATTTAACTGTCAGAGGTGA(SEQ ID No.3)，
外引物2為:TTCAGCCTTGCGACCATA(SEQ ID No.4)；
(2)反應液B：1000x熒光染料SYBR Green I。
本發明還提供了一種使用上述豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒檢測豬人住肉孢子蟲的方法，其主要技術步驟包括：
1)提取待測樣品DNA，制備DNA處理液；
2)豬人住肉孢子蟲的環介導等溫擴增：
將體積比為24:1的反應液A和步驟1)中所得的DNA處理液混勻離心，于60-65℃恒溫放置45-60min；
3)擴增產物的顯色檢測：
在步驟2)中所得的混合液中加入反應液B，其體積比為25:1，反應結束后充分混合，肉眼觀察反應液顏色：如顏色變為綠色，表明樣品中豬人住肉孢子蟲，如顏色為黃色，說明待檢樣品不含有豬人住肉孢子蟲。
本發明還提供了上述豬人住肉孢子蟲LAMP檢測的引物組合、上述豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒、以及上述豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒的檢測方法在檢測豬人住肉孢子蟲方面的應用。
本發明的技術方案達到了如下的有益效果：
a)本發明建立了豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒，該試劑盒根據豬人住肉孢子蟲的18SrRNA基因保守區的6個部位設定了4種引物分別為：兩個特異性內引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為豬人住肉孢子蟲所共有；
b)本發明采用LAMP技術，特異性強，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴箱即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速。可用于豬人住肉孢子蟲的檢測，特別適合于基層現場應用。
LAMP技術具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低等優點，其特點是對靶基因的6個部位設定4種引物，利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。由于其反應是多種引物共同啟動，使得反應結果比PCR更特異，另外，由于實行的是等溫擴增，反應在恒溫水浴箱內便可完成，不僅節約儀器成本，而且操作方法更簡單，適于現場快速檢測。
本發明解決了現有技術中檢測豬人住肉孢子蟲的方法所需周期長、靈敏度較低、成本高、現場應用困難等缺陷，提供的豬人住肉孢子蟲的檢測試劑盒及其檢測方法，對豬人住肉孢子蟲進行LAMP檢測，快速、準確性高、靈敏性好、現場應用方便，可廣泛應用于獸醫、食品、出入境檢疫領域。
附圖說明
圖1是具體實施例1的檢測結果。
圖中，左圖：陽性樣品，中圖：陰性樣品，右圖：空白對照。
具體實施方式
為了闡明本發明的技術方案及技術目的，下面結合附圖及具體實施方式對本發明做進一步的介紹。
下列實例進一步說明本發明，但不應該當作對本發明的限制。
實施例1：
按下列配方制作豬人住肉孢子蟲的環介導等溫擴增檢測試劑盒：
(1)反應液A：
含有10×等溫反應緩沖液、8000U/ml Bst DNA聚合酶、0.5mM dNTP、2mM MgCl2、1.4μM內引物1和1.4μM內引物2混合液、0.2μM外引物1和0.2μM外引物2混合液、1M甜菜堿和去離子水，其中：
10×等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.8)、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％(m/V)曲拉通X-100(pH8.8，25℃)；
內引物1為:TCTACCATAAACTATGCCGACTAGACTTTGATTTCTCATGAGGTGC(SEQ ID No.1)
內引物2為:ACCCCCTACTGTCGTTCTTGATTGTTAAAGACGAACTACTGCG(SEQ ID No.2)
外引物1為:CGTATTTAACTGTCAGAGGTGA(SEQ ID No.3)
外引物2為:TTCAGCCTTGCGACCATA(SEQ ID No.4)
(2)反應液B：1000×的熒光染料SYBR Green I。
LAMP反應液A以每管24μL計，為2.5μL 10×等溫反應緩沖液、1.0μL 8U/μL Bst DNA聚合酶、1.25μL 0.5mM dNTP、3μl 2mM MgCl2、2μL外引物混合液、7μL內引物混合液、2.5μL 1M甜菜堿、4.75μL去離子水。
實施例2：
利用豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒檢測豬人住肉孢子蟲。
待測樣本處理液制備：以樣本取自豬肉為例，感染豬人住肉孢子蟲豬肉作為陽性樣品，正常豬肉作為陰性樣品，同時設立不含樣品的去離子水作為空白對照。
A.取豬肉組織0.5g，置于1.5mL離心管中，研磨后加入1mL的組織裂解液(100mM pH8.0Tris，500mM pH 8.0EDTA，20mM NaCL，10％SDS)；
B.加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)混勻，置于65℃恒溫水浴鍋中水浴30min；
C.12000×g離心5min，將上清移入新離心管中；
D.加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)振蕩渦旋，12000×g離心5min，將上層液入另一離心管中；
E.加入2倍體積預冷的無水乙醇混勻，4℃沉淀20min，12000×g離心10min，去上清；
F.沉淀用800μL預冷的75％乙醇洗滌一次后12000×g，離心5min；
G.棄掉上清液，離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥2-3min；
H.用20μL去離水重新溶解干燥后的沉淀，然后置于-20℃保存備用。
檢測：
(1)豬人住肉孢子蟲的環介導等溫擴增
在裝有24μL反應液A的PCR反應管中分別加入1μL上述制得的待檢陽性樣品的DNA處理液、正常豬肉的DNA處理液或者滅菌去離子水，作為陽性對照、陰性對照以及空白對照，混勻離心，將1μL的反應液B分別滴在PCR管蓋內側中間，蓋緊管蓋(小心操作，以防顯色液墜入反應混合液中)，于60-65℃恒溫水浴箱中放置60min；
(2)擴增產物的顯色檢測
顛倒PCR管數次，使反應混合液與反應液B充分混合，觀察反應液顏色，根據反應液的顏色變化肉眼判斷檢測結果。陽性對照顏色變為綠色，表明樣品中含有豬人住肉孢子蟲。陰性對照以及空白對照顏色為黃色，說明不含有豬人住肉孢子蟲。檢測試驗結果如圖1。
實施例3：豬人住肉孢子蟲檢測方法靈敏度試驗
取含有豬人住肉孢子蟲特異基因的質粒DNA，按10倍比稀釋作為LAMP檢測試驗模板，使每μL稀釋液中含有模板基因拷貝數分別為108，107，106，105，104，103，102，10，1；
在裝有24μL反應液A的PCR反應管中分別加入1μL上述基因組稀釋液，同時設置不加質粒DNA的空白對照，混勻離心，將1μL的反應液B滴在PCR管蓋內側中間，蓋緊管蓋于60-65℃恒溫水浴箱中放置60min；
顛倒PCR管數次，使反應混合液與反應液B充分混合，肉眼觀察反應液顏色，結果顯示加有質粒DNA的反應管變為綠色，對照管顏色為黃色，說明該試劑盒的檢測靈敏度至少為10個基因拷貝。
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，本發明要求保護范圍由所附的權利要求書、說明書及其等效物界定。