本發明屬于診斷領域，更具體地，本發明涉及提高EGFR的T790M突變的診斷效率的方法。
背景技術：
：肺癌是全世界發病率和死亡率均列第一的惡性腫瘤。由于肺癌發生機制的多樣性和治療監控工具的局限性，大多數患者往往不能得益于臨床治療。比如，化學治療肺癌的疾病緩解率僅為15％-20％。大規模的臨床試驗證實，以表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)為代表的靶向藥物，對EGFR突變的非小細胞肺癌患者具有顯著療效，可延長其無疾病進展生存期和總生存期。然而，臨床上對于TKI藥物有效的患者，在用藥后期均會產生耐藥性，研究顯示，其中50％患者在19外顯子缺失或L858R等敏感性突變的基礎上，又發生了第20外顯子790位密碼子的突變(T790M)。最新研究表明，由阿斯利康研發的第三代EGFR抑制劑，對已有EGFR-TKI有抗性和T790M突變的NSCLC患者有較佳的治療效果。因此在臨床用藥選擇時，除敏感突變外，T790M耐藥突變的檢測也尤為重要。用于EGFR基因T790M突變檢測的樣本主要包括腫瘤組織樣本和血液樣本。組織樣本成份復雜，除了腫瘤組織DNA，也含有部分正常組織DNA，加上腫瘤本生的異質性，其待檢測突變在樣本中所占的比例往往低于20％。此外，在臨床實踐中，并非所有患者都能獲得組織標本。尤其對于發病即為中晚期的肺癌患者來說，腫瘤組織標本往往經穿刺獲得，組織量少，難以滿足檢測要求。另一方面，腫瘤的生物學特性在經過一系列治療后會發生改變，再次獲取組織標本比較困難。循環腫瘤DNA(CtDNA)是一種無細胞狀態的胞外游離DNA，由凋亡的腫瘤細胞釋放，存在于腫瘤患者外周血中，具有腫瘤細胞的遺傳特征。由于外周血取樣的方便和及時性，對于EGFR-TKI耐藥的患者，檢測外周血中的CtDNA，即可獲得T790M的突變信息。但是，血液樣本中除了來自于腫瘤組織的含有突變的CtDNA之外，還含有大量來自于正常細胞代謝所產生的野生型DNA，其突變比例往往低于1％。目前常用的檢測EGFR基因T790M突變的方法有測序法和ARMS-PCR法。測序法靈敏度較低約20％，且操作復雜，檢測時間較長。ARMS-PCR方法能夠達到1％的靈敏度，對于突變比例較高的腫瘤組織樣本尚能夠滿足檢測需求，但是對于突變含量低的組織樣本，尤其是血液樣本，難以有效檢測。因此，本領域需要找到解決方法，來克服臨床上檢測EGFR基因T790M突變時檢測效率低下的問題。技術實現要素：本發明的目的在于提供提高EGFR的T790M突變的診斷效率的方法。在本發明的第一方面，提供一種檢測EGFR基因T790M突變的試劑盒，所述試劑盒中包括：(1)特異性擴增EGFR基因T790M突變位點區域的前引物和后引物，所述的前引物和后引物擴增包含基因突變位點在內的擴增產物的長度為50-150bp；后引物與突變型基因位點及鄰近序列完全互補，且其3’末端堿基與EGFR基因T790M突變位點堿基互補；和(2)特異性針對擴增產物的探針，所述的探針攜帶可檢測標記。在一個優選例中，所述的可檢測標記是熒光標記。在另一優選例中，所述的后引物的長度為10-25bp；較佳地為12-20bp。在另一優選例中，所述的試劑盒中還包括：(3)靶向點基因突變位點對應的野生型位點的競爭性Block寡聚核苷酸，其與野生型基因完全互補，與突變基因部分互補。在另一優選例中，所述的競爭性Block寡聚核苷酸包括：SEQIDNO:17所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。在另一優選例中，所述的后引物是選自下組所示核苷酸序列的后引物：SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。在另一優選例中，所述的后引物的核苷酸序列中，還設置一個與EGFR基因中相應位點堿基錯配的堿基，該錯配堿基的位置不位于該后引物的3’末端。在另一優選例中，所述的錯配堿基位于后引物的3’端起算的第2位至5’端堿基的任一位置上，例如位于3’端起算的第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20位；更佳地，位于3’端起算的第4、5或6位。在另一優選例中，所述的錯配堿基對應于EGFR基因中的堿基位點與EGFR基因T790M突變位點之間，間隔至少一個堿基；較佳地，間隔1～6個堿基，如2～5個堿基。在另一優選例中，所述的后引物是選自下組所示核苷酸序列的后引物：SEQIDNO:9，SEQIDNO:10或SEQIDNO:11。在另一優選例中，所述試劑盒中還包括(但不限于)：DNA擴增試劑，PCR擴增緩沖液，說明操作方法的使用說明書。在本發明的另一方面，提供所述的試劑盒的用途，用于檢測EGFR基因T790M突變。在一個優選例中，所述的用途為非診斷性的用途。例如，僅應用于在實驗室中分析EGFR的變異情況。在本發明的另一方面，提供一種檢測EGFR基因T790M突變的方法，所述方法包括：(i)以待測基因為模板，以所述的試劑盒中的試劑進行PCR擴增；(ii)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中EGFR基因T790M突變類型。在本發明的另一方面，提供一種檢測EGFR基因T790M突變的方法，所述方法包括：(i)以待測基因為模板，以所述的試劑盒中的試劑進行PCR擴增；(ii)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中EGFR基因T790M突變類型。在一個優選例中，所述方法中，若經測定發現，對應于EGFR第790位氨基酸，其密碼子由ACG突變為ATG，則判斷為發生T790M突變。在另一優選例中，所述的方法為非診斷性的方法。例如，僅在實驗室中應用該方法分析EGFR的變異情況。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。具體實施方式本發明人前期研發的EGFR基因突變檢測試劑盒，對T790M位點有較好的檢出率，但是在后期大樣本量的檢測中發現，其檢測效率與理想狀態還有一定的距離。因此，本發明人進行了研究分析，發現這是由于T790M位點前存在另一單核苷酸多態位點(SNP：G>A，本文中也稱為“前SNP”)導致的，COSMIC數據庫顯示其變異頻率為41.83％。因此，對于含有該SNP變異的樣本進行檢測時，由于引物中存在不匹配的堿基，會降低檢測效率。根據該發現，本發明人優化了檢測EGFR基因T790M位點突變的檢測試劑。如本文所用，所述的“EGFR基因T790M突變”是指對應于EGFR第790位氨基酸，其密碼子由ACG突變為ATG。如本文所用，所述的“前引物”與“正向引物”可互換使用。通常，利用該“前引物”與“后引物”進行PCR擴增，獲得一個具有合理長度的擴增產物，例如長度為50-150bp；較佳地為50-100bp。如本文所用，所述的“后引物”與“反向引物”可互換使用，是指針對EGFR基因的突變位點的引物，所述后引物與突變型基因位點及鄰近序列完全互補，且其3’末端堿基與EGFR基因T790M突變位點堿基互補。如本文所用，“互補”是指核苷酸的序列之間(如本發明中后引物序列與EGFR基因T790M突變位點及鄰近位點的序列之間)可以以一種可預見的方式發生相互作用，如形成二級結構(如莖環結構)。通常，兩條“基本上互補”的核苷酸序列互相之間至少有70％的核苷酸是互補的；更優選的，至少有80％或90％的核苷酸是互補的。本發明中，兩條足夠互補的分子之間可以具有1-2個(較佳地為1個)不配對的核苷酸。如本文所用，堿基的“匹配”、“配對”或“完全互補”是指兩條核苷酸序列中相應的堿基構成了鍵(如氫鍵)的連接，例如“A”與“T”之間可形成鍵。兩條序列中足夠多核苷酸的“配對”可使得兩條序列發生互補。如本文所用，堿基的“基本上匹配”是指兩條核苷酸序列中絕大多數的堿基構成了鍵(如氫鍵)的連接，存在個別(例如1個)堿基的“錯配”。如本文所用，所述的堿基“錯配”是指兩條核苷酸序列中，存在位置關系相應的兩個堿基，它們之間不構成鍵(如氫鍵)的連接。本發明以EGFR基因T790M突變為檢測對象，將突變檢測位點設計于后引物上，從而避免“前SNP”位點的影響，以提高檢測的靈敏度。在此基礎上，本發明提供了一種檢測EGFR基因T790M突變的試劑盒，其包括：(1)特異性擴增EGFR基因T790M突變位點區域的前引物和后引物，所述的前引物和后引物擴增包含基因突變位點在內的擴增產物的長度為50-150bp；后引物與突變型基因位點及鄰近序列完全互補，且其3’末端堿基與EGFR基因T790M突變位點堿基互補；和(2)特異性針對擴增產物的探針，所述的探針攜帶可檢測標記。所述的后引物的長度可以是10-25bp。在此基礎上，本發明人進一步考察了不同長度的后引物對于突變基因與野生基因的分辨能力，長度為12-20bp的引物長度是更為理想的。作為本發明的優選形式，所述的后引物是選自下組所示核苷酸序列的后引物：SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。組織和血液樣本中，除了突變型DNA，還含有大量野生型DNA，對于檢測的特異性造成了干擾。因此，作為本發明的優選方式，針對EGFR基因T790M突變位點，還應用競爭性Block寡聚核苷酸來排除野生型DNA的干擾，以進一步提高檢測的特異性。Block寡聚核苷酸與野生型基因完全互補，而與突變基因部分互補，在有野生型基因存在的情況下，Block寡聚核苷酸能夠封閉野生型基因，防止野生型基因擴增造成的假陽性。更為優選地，所述的競爭性Block寡聚核苷酸是SEQIDNO:17所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。作為本發明的優選方式，所述的后引物的核苷酸序列中，還設置一個與EGFR基因模板中相應位點堿基錯配的堿基，該錯配堿基的位置不位于該后引物的3’末端，可以位于后引物的3’端起算的第2位至5’端堿基的位置上；較佳地位于后引物的3’端起算的第4、5或6位。錯配堿基的設置有利于進一步提高檢測的特異性。更優選地，包含有錯配堿基的后引物是選自下組所示核苷酸序列的后引物：SEQIDNO:9，SEQIDNO:10或SEQIDNO:11，這些后引物中均引入了錯配的堿基，檢測特異性更好。所述的特異性針對擴增產物的探針可對擴增產物進行特異性檢測。較佳地，所述的探針是帶有可檢測標記的探針，如熒光探針。例如，所述的探針是TaqmanMGB探針，從而便于實時熒光檢測。TaqMan探針法的核心是利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。TaqMan探針根據其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。TaqManMGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-FluorescentQuencher)，本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團。例如，可以選擇FAM熒光信號或ROX熒光信號。本發明所述試劑盒中還包括(但不限于)：DNA擴增試劑，PCR擴增緩沖液，鎂離子等。以及還可包括說明操作方法的使用說明書，從而有利于本領域技術人員方便地實施檢測。本發明還提供了一種檢測EGFR基因T790M突變的方法，所述方法包括：(i)以待測基因為模板，以所述的試劑盒中的試劑進行PCR擴增；(ii)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中EGFR基因T790M突變類型。若經測定發現，對應于EGFR第790位氨基酸，其密碼子由ACG突變為ATG，則判斷為發生T790M突變。本發明所述的方法，可以是臨床診斷方法，也可以是非診斷性的方法。例如，僅在實驗室中應用該方法分析EGFR的變異情況，進行研究分析，這種實施方式不面對患者，不給出診斷結果，屬于非診斷性的方法。本發明結合了一種高分辨引物，競爭性Block寡聚核苷酸和熒光特異探針技術，可以更準確和靈敏地檢測樣本中的T790M突變，檢測靈敏度可達到0.01％，顯著高于測序法和傳統的ARMS-PCR方法，尤其是在對T790M突變含量低的血液樣本的檢測上顯現了極大的優勢，可用于患者耐藥情況的跟蹤檢測，為醫生提供更詳細的信息。本發明的試劑盒，可以適用于絕大多數的復雜樣本，包括血液標本，FFPE樣本；并可用于血液樣本耐藥基因的跟蹤檢測，及時地作出用藥調整。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。材料與方法1、試劑定量PCR檢測試劑RealtimePCRMasterMix購自日本TOYOBO公司。組織基因組抽提試劑QIAampDNAFFPETissueKit與全血基因組抽提試劑QIAampDNAbloodMiniKit均購自QIAGENChina(shanghai)Co.，Ltd.。血漿游離DNA抽提試劑核酸提取純化試劑盒(吸附柱法)購自格諾思博生物科技南通有限公司。熒光定量PCR擴增儀ABI7300購自AppliedBiosystems公司。PCR所用引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。TaqmanMGB探針購自LifeTechnologies公司。其余試劑均購自SigmaAldrich公司。2、寡聚核苷酸序列突變檢測所用引物、TaqmanMGB探針與Block寡聚核苷酸序列見表1。表1、突變檢測所用引物、探針與Block寡聚核苷酸序列注：引物名稱中，首字母F表示正向引物，首字母R表示反向引物，首字母B表示Block寡聚核苷酸，首字母P表示MGB探針。3、質粒構建取健康人抗凝血200微升，用全血基因組抽提試劑盒(QIAampDNAbloodMiniKit)抽提得到基因組，用表2中對應的擴增引物(SEQIDNO:18，SEQIDNO:19)進行擴增，擴增產物與pMD18-TVector連接，再將連接產物加入到100微升的DH5α感受態細胞中，冰中放置30分鐘，加入500微升SOC培養基，37℃培養箱中，培養60分鐘，培養結束后，將培養液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上過夜培養，形成單菌落。挑選白色菌落，進行測序驗證，測序結果證明已成功構建“前SNP”與20外顯子T790M位點均為野生型的質粒，并命名為T-SNP(wt)-790(wt)。其它質粒的構建方法如下：以野生型質粒T-SNP(wt)-790(wt)為模板，用表2中對應的擴增引物(SEQIDNO:20～SEQIDNO:25)進行擴增，將擴增產物用DpnI酶消化2小時后，膠回收酶切產物，再將回收產物加入到100微升的DH5α感受態細胞中，后續方法同上，經測序驗證正確。構建的質粒及所用引物見表2。表2、質粒類型及構建所用引物注：引物名稱中，首字母F表示正向引物，首字母R表示反向引物。4、組織和血漿游離DNA的提取抽提切片樣本的DNA時，使用QIAGEN公司的石蠟組織DNA提取試劑盒。抽提血漿游離DNA時，使用格諾思博生物科技南通有限公司的核酸提取純化試劑盒(吸附柱法)。實施例1、引物的選擇本發明人將檢測位點設計于后引物上，即后引物的3’末端堿基與T790M位點突變型完全互補，因此后引物是區分突變型與野生型基因的關鍵。本實施例考察了不同長度的后引物對于突變基因與野生基因的分辨能力。將T790M位點為突變型質粒[T-790(mut)]共20拷貝，摻入到2.0×104拷貝的對應的野生型質粒[T-790(wt)]中，進行實時熒光PCR檢測，計算兩者Ct的差值，△Ct＝Ct野生型-Ct突變型。本實施例應用的不同長度的后引物序列見表3，前引物是F-790，探針是P-790。表3、不同長度的后引物序列擴增反應體系見表4。表4擴增反應體系組份用量RealtimePCRMasterMix25μL擴增引物300nM探針100nM擴增模板5μL反應程序見表5，在步驟3中60℃退火時檢測熒光信號，檢測熒光選擇FAM與ROX。表5擴增反應程序步驟循環數溫度時間1195℃2min25095℃10sec35060℃30sec結果見表6。表6引物的選擇以上結果顯示，后引物長度對于T790M突變檢測分辨能力有一定的影響，較佳的后引物長度為12-20bp。并且，在后引物中引入一個錯配堿基，可進一步提高檢測的特異性。實施例2、競爭性Block寡聚核苷酸的作用本發明人針對EGFR基因T790M突變位點及鄰近序列的特點，經過分析比較，設計了競爭性Block寡聚核苷酸。Block寡聚核苷酸與野生型基因完全互補，而與突變基因部分互補，在有野生型基因存在的情況下，Block寡聚核苷酸能夠封閉野生型基因，防止野生型基因的擴增造成假陽性，因此可以提高檢測的特異性。將T790M位點為突變型質粒[T-790(mut)]共20拷貝，摻入到2.0×104拷貝的對應的野生型質粒[T-790(wt)]中，進行實時熒光PCR檢測，計算兩者Ct的差值，以考察Block寡聚核苷酸的作用。本實施例應用的后引物是R-790-9，前引物是F-790，探針是P-790，Block寡聚核苷酸是B-790。擴增反應體系和反應程序同實施例1。結果見表7。表7、Block效果以上結果顯示，在加入競爭性Block寡聚核苷酸后，△Ct由4.8增加到6.4。由此可見在有野生型背景存在的情況下，加入本發明人設計的競爭性Block寡聚核苷酸能夠提高突變檢測的特異性。實施例3、靈敏度分析將“前SNP”為變異型、T790M位點為突變型質粒[T-SNP(mut)-790(mut)]梯度摻入到2.0×104拷貝的對應的野生型質粒[T-SNP(mut)-790(wt)]中，摻入比例見表9，分別用將突變位點設計于前引物上與將突變位點設計于后引物上的兩套體系，進行實時熒光PCR檢測，考察兩種引物對于“前SNP”為變異型的T790M突變檢測的靈敏度，結果見表9。本實施例應用的引物及相應的Block寡聚核苷酸與探針見表8。表8、兩種引物及相應的Block寡聚核苷酸、探針表9、靈敏度分析以上結果顯示，當采用突變點設計于后引物的體系進行擴增時，突變比例在0.01％時與野生型質粒[T-SNP(mut)-790(wt)]仍有較好的區分度，說明本發明的檢測體系對于T790M突變的檢測靈敏度可達到0.01％；當采用突變點設計于前引物的體系進行擴增時，由于引物與“前SNP”存在錯配，突變比例在0.01％和0.1％時與野生型質粒的區分度不佳，檢測能力僅為1％。實施例4、對血漿樣本的檢出能力獲取150例臨床肺癌組織樣本及對應的血漿樣本，對組織樣本一一進行測序，確定這些樣本的“前SNP”和T790M位點的突變情況。提取對應血漿樣本的DNA，作為模板，向PCR反應體系中加入5μL模板，分別用將突變位點設計于前引物上與將突變位點設計于后引物上的兩套體系，進行實時熒光PCR檢測，考察兩種引物對于“前SNP”為變異型或野生型的臨床肺癌血漿樣本T790M突變的檢出能力。同時對EGFR基因第4外顯子的保守區域進行檢測，作為對所提取的DNA模板的質量和用量進行質控。通過計算△Ct(突變Ct值與Exon4質控Ct值的差值)進行判斷，△Ct<9，樣本為T790M突變陽性，否則為陰性或低于試劑盒的檢測下限。結果見表10。本實施例對于T790M突變檢測應用的引物及相應的Block寡聚核苷酸與探針見表8；對于保守區域檢測應用的前引物是F-Exon4，后引物是R-Exon4，探針是P-Exon4。表10、對血漿樣本檢出能力的比較結果以上結果顯示，150例組織樣本經測序，發現39例T790M突變陽性，其中21例為“前SNP”野生型，18例為“前SNP”變異型。當采用突變點設計于前引物上的體系進行檢測時，對于“前SNP”為野生型的樣本，檢出21例T790M突變陽性。但是對于“前SNP”為變異型的樣本，僅檢出7例T790M突變陽性，其余11例為陰性，與對應組織樣本測序結果的總體符合率為71.8％，說明由于引物與“前SNP”存在錯配，因而對于T790M突變含量低的樣本檢出能力低。而采用突變點設計于后引物上的體系進行檢測時，避免了“前SNP”位點的影響，擴增效率較高，共檢出38例T790M突變陽性，與測序符合率為97.4％，極大提高了對于血漿樣本檢測的靈敏度和準確性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 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