本發明涉及萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其鹽在制備抗腫瘤藥物上的應用，屬于抗腫瘤藥物領域。
背景技術：
萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮(NFD)是海欖雌屬海欖雌科衍生中重要的活性成分，Chiu等在肝癌細胞HCC、Hep3B、HepG2及Huh-7中，同時測定的抗增殖活性，發現化合物NFD能抑制此類腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡(Cancer Letters,2010,295(1):92-99)；Tsai等在乳腺癌細胞MDA-MB-231中進行活性抑制試驗，發現NFD可能是通過抑制Src介導的細胞通路阻斷MDA-MB-231細胞侵襲與轉移，而不影響細胞凋亡或生長停滯(Molecular and Cellular Biochemistry,2014,387(1-2):101-111)；Tsai等發現NFD抑制HGF誘導的乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷徙與侵襲，可能是抑制酪氨酸激酶c-Met磷酸化，控制PI3K與Akt的活化，負調控(NF)-kB及MMP-9的活性，從而在乳腺癌細胞遷移早期達到干預作用(Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology(2014)41,716–726)。Hsieh等選用表皮生長因子(EGF)作為乳腺癌細胞MDA-MB-231的誘導物，發現NFD能抑制EGF介導的c-Jun與c-Fos的蛋白水平，負調控EFGR、PI3K/Akt的磷酸化水平，降低MMP-9的表達和活性，達到抑制腫瘤細胞侵襲與遷移的作用(Toxicology in Vitro,2013,27(1):1-10)。值得重視的是，在抑制EGF誘導MDA-MB-231侵襲與遷移的過程中，NFD并無明顯細胞毒作用。但是我們在研究中發現NFD的水溶性很差，在水中幾乎不溶，影響其成藥性，而且其活性有待進一步提高活性
技術實現要素：
本發明基于天然產物萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮(NFD)的結構，通過結構修飾，發現一類活性好、水溶性高的萘并[1,2-b]-呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物。
本發明的技術方案是，提供一種萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其在藥學上可接受的鹽，所述萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物的化學結構式如式(I)所示：
其中：
R1、R2、R3、R4分別獨立地選自氫、鹵素；
R5獨立地選自氫、鹵素、1-5個碳烷基、芳基。
進一步地，所述R1、R2、R3、R4均為氫。
進一步地，所述R5為氫或甲基。
進一步地，所述鹽中的陽離子選自堿金屬離子、堿土金屬離子、銨離子。
進一步地，化學結構式為：
本發明進一步地提供萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其在藥學上可接受的鹽的制備方法，其特征在于，萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物的制備方法如下：在萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮衍生物的醋酸和醋酐的混合溶液中，加入濃硫酸的醋酸稀釋液，發生磺化反應，反應時間為0.5-24h，反應溫度為-10℃～100℃；反應完全，調pH至4-5；柱層析分離即可得到的萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物。
進一步地，將萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物與堿發生酸堿中和反應得其相應的磺酸鹽。
進一步地，所述的萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其在藥學上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物上的應用，腫瘤優選為乳腺癌。
本發明的內容涉及萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其在藥學上可接受的鹽，其結構式分別為通式(I)和通式(II)；通式(I)和通式(II)化合物的制備方法。
其制備方法如下反應路線所示
a):alph-鹵代酮或醛,KI,KOH；b):H2SO4,(AcO)2O,AcOH；c):堿
第一步反應：該步反應環化反應，以市售2-羥基萘醌(A)為原料，按照文獻方法 (Toxicology in Vitro,2013,27(1):1-10)和alph-鹵代酮或醛反應，制備得到中間體B，反應中，加入碘化鉀或碘化鈉，可提高反應速度。最終得到化合物B。
第二步反應：該步磺化反應，化合物B在醋酸和醋酐混合溶劑中，發生磺酸化反應，得到相應的磺酸(I)。柱分離得到純品。洗脫液為甲醇和乙酸乙酯的混和體系。醋酸和醋酐的比例1：1～5，濃硫酸和化合物B的比例為1：1～3，反應溫度為0-50℃。醋酸和醋酐的最佳比例1：1～2，濃硫酸和化合物B的比例為1：1～1.5，反應溫度為0度至25度。比例均為體積比。
第三步反應：成鹽反應。在有機溶劑中，磺酸(I)與無機堿或有機堿發生酸堿中和反應，得到通式(II)的磺酸鹽。常用的無機堿有氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鋰、甲醇鈉、甲醇鉀、乙醇鈉、乙醇鉀、叔丁醇鈉、叔丁醇鉀；常用有機堿為一級胺、二級胺、三級胺、氨基酸。無機堿優選為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、。
選取腫瘤細胞株，通過腫瘤活性篩選方法，測定本發明的化合物對腫瘤細胞的抑制活性。本發明的化合物比天然母體化合物具有更好的抗腫瘤細胞增殖活性，其活性是其母體結構萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮(NFD)的3-5倍。
本發明的有益效果是，通過對母體化合物的結構修飾，使得化合物的水溶性顯著提高，其中化合物4,5-二氧代-4,5-二氫-萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸和化合物3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氫萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸的在水中的溶解度大于20mg/mL,化合物4,5-二氧代-4,5-二氫萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸鈉和3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氫萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸的溶解度均大于50mg/mL。同時具有更好的抗腫瘤活性。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述發明。應理解為，這些實施例僅用于說明本發明而不是限制本發明的范圍。
實例1
萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮的制備
單頸瓶中加入氯乙醛3.64mL，濃鹽酸1mL，40℃加熱活化后待用。2-羥基-1,4-萘醌 0.13g(0.75mmol)，氯乙醛0.26mL(1.6mmol)，碘化鉀25mg(0.15mmol)，1mol/L的氫氧化鉀溶液1.5mL部分溶解后，80℃回流，TLC檢測原料完全消失后，停止反應，加入水30mL稀釋，用二氯甲烷萃取反應液(50mL×3)，合并有機層加入無水硫酸鈉干燥，旋干溶劑，過柱純化(PE/EA＝15:1)，得紅色固體B1120mg，產率14％。mp 213-215℃,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝7.7Hz,1H),7.77(dd,J＝11.6,5.9Hz,1H),7.69(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.54(d,J＝2.0Hz,1H),7.51(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),6.90(d,J＝2.0Hz,1H).
實例2
4,5-二氧代-4,5-二氫-萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸的制備
冰浴條件下，單頸瓶中加入化合物萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮20mg(0.1mmol)，混合溶液3mL(醋酸:醋酐＝3:4)溶解完全，加入濃硫酸40μL(0.1mmol)的醋酸稀釋液，室溫反應過夜后，TLC監測反應完全，停止反應，加飽和碳酸鈉溶液調pH值為7.6，旋干溶劑中的水，加入乙醇0.2mL溶解，過柱純化(MeOH/EA＝1:4)，得紅棕色固體12mg，產率40％。mp 229-240℃,1H NMR(400MHz,D2O)δ7.81(d,J＝7.7Hz,1H),7.62–7.57(m,2H),7.42(m,1H),7.02(s,1H)；13C NMR(125MHz,D2O)δ180.3,175.3,161.6,154.2,136.3,131.6,130.1,128.5,126.7,123.2,120.2,108.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd.For C12H6O6S,277.9885,found:279.1597.
實例3
3-甲基萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮的制備
封管中加入2-羥基-1,4-萘醌125mg(0.72mmol)，溴丙酮150mg(1mmol)，醋酸銨56mg(0.72mmol)，甲苯10mL溶解完全，避光條件下，120℃封管回流24h后，停止反應，旋干甲苯，殘渣用1mol/L的鹽酸溶液溶解后，加入水30mL稀釋，加入二氯甲烷萃取 (50mL×3)，合并有機層加入無水硫酸鈉干燥，旋干溶劑，過柱純化(PE/EA＝15:1)，得紅色固體10mg，產率6％。mp 168-169℃1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.72–7.71(m,3H),7.53(td,J＝7.5,1.4Hz,1H),2.19(d,J＝1.1Hz,3H).
實例4
3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氫萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸的制備
冰浴條件下，單頸瓶中加入實例3所得的3-甲基萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮22mg(0.1mmol)，混合溶液3mL(醋酸/醋酐＝1:2)溶解完全，加入濃硫酸40μL(0.1mmol)的醋酸稀釋液，室溫反應過夜后，TLC監測反應完全，停止反應，加飽和碳酸鈉溶液調pH值為7.6，旋干溶劑中的水，加入乙醇0.2mL溶解，過柱純化(MeOH/EA＝1:5)，得紅棕色固體414mg，產率48％。mp 185-186℃,1H NMR(500MHz,D2O)δ7.74(d,J＝7.7Hz,1H),7.58(t,J＝7.5Hz,1H),7.51(d,J＝7.6Hz,1H),7.40(t,J＝7.6Hz,1H),2.26(s,3H)；13C NMR(125MHz,D2O)δ180.0,175.5,159.5,149.4,136.4,131.3,130.0,128.0,126.4,122.9,121.7,120.0,22.4.
實例5
4,5-二氧代-4,5-二氫萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸鈉的制備
冰浴條件下，單頸瓶中加入實例2所得的4,5-二氧代-4,5-二氫萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸28mg(0.1mmol)，加入1mL乙醇溶解，加入0.1mmol乙醇鈉，室溫攪拌1小時，旋干溶劑，加入乙醚，有固體析出，過濾，得產品。EI-MS：277(M-Na)+。
實例6
3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氫萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸鈉的制備
冰浴條件下，單頸瓶中加入實例4所得的3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氫萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸29mg(0.1mmol)，加入1mL乙醇溶解，加入0.1mmol氫氧化鈉，室溫攪拌1小時，旋去部分溶劑，加入乙醚，有固體析出，過濾，得產品。EI-MS：291(M-Na)+。
化合物抗腫瘤活性測試
實驗方法
1.收集對數期乳腺癌MCF-7細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100μL，鋪板使待測細胞調密度至4000個每孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。
2.于5％二氧化碳，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，在前一天下午鋪板，次日上午加藥。5-7個濃度梯度，每孔100μL，設3-5個復孔。
3.于5％二氧化碳，37℃孵育16-48h，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。
4.每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。
5.終止培養，小心吸去孔內培養液。
6.每孔加入100μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
7.同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)
8.將各復孔OD值取平均值，計算細胞成活率和抑制率
成活率＝藥物組OD值取平均值/對照組OD值取平均值×100％
抑制率＝100％－成活率
根據每個化合物的測試濃度及其對應的抑制率，計算出該化合物的IC50值。
測試結果
表1本發明通式I所示化合物結構和對人類乳腺癌MCF-7細胞株的IC50值化合物對MCF-7細胞(乳腺癌)抑制活性如表1所示：
表1化合物的結構及其抗腫瘤活性