本發明涉及分子生物學技術領域，尤其是涉及一種基于CRISPR/Cas9技術消除mecA質粒的方法。
背景技術：
金黃色葡萄球菌是引起人類一系列感染性疾病的主要病原體之一，簡稱金葡菌，可引起皮膚感染、嚴重肺炎、心內膜炎、關節化膿性炎，和食物中毒，嚴重者可以引起中毒性休克綜合征，極易導致患者致死亡。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcμ s aμ reμ s，MRSA)因其更為嚴重的耐藥情況已成為院內外感染及耐藥性監測中的重要病原體。MRSA具有耐藥性的關鍵性原因是mecA基因。mecA基因存在于葡萄球菌的可移動性元件盒式染色體（Staphyloccoccal Cassette Chromosome mec，SCCmec）上。該可移動性元件還可以攜帶其他多種耐藥基因、轉座子、插入子等特殊結構在菌株之間進行水平轉移，從而造成了菌株之間耐藥基因的相互傳播，引起菌株多重耐藥。因此，mecA橫向基因轉移（Horizontal Gene Transfer，HGT）是使許多敏感金葡菌獲得耐藥基因而轉變為多耐藥MRSA菌的重要途徑。
目前，針對MRSA的新藥的研究主要有以下方法，一是在原有抗生素的基礎上改造結構探索新型抗生素，例如特拉萬星（telavancin）就是通過對萬古霉素的改造形成的萬古霉素衍生物，并對MRSA具有良好的抗菌活性，但由于其對耐萬古霉素金葡菌效果較差及其明顯的毒副作用因此應用并不廣泛；二是基于藥物對金葡菌細胞壁高效的水解作用表現出的良好抗菌作用研制出的抗菌蛋白，該方法作用明顯，特異性高，但是作為大分子蛋白質其在體內的代謝半衰期及其免疫原性的問題限制了其發展。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種特異性高、效果明顯、無毒副作用的基于CRISPR/Cas9技術消除mecA質粒的方法。
為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：
一種基于CRISPR/Cas9技術消除mecA質粒的方法，包括以下步驟：
（1）選擇MRSA菌株對mecA基因編碼轉肽酶C末端的DNA序列進行PCR擴增；
（2）mecA基因凝膠回收；
（3）將步驟（2）所得的mecA基因與T-pMD19（simple）載體連接：
（4）制備DH5α感受態細胞；
（5）將步驟（3）所得產物電轉DH5α感受態細胞
取100μl所述 DH5α感受態細胞置于冰上解凍；取11μl步驟（3）所得產物置于離心管中，將離心管和電轉杯一起置于冰上預冷10min；將100μl解凍的所述 DH5α感受態細胞轉移到上述離心管中，冰上混勻后，繼續冰浴10min；
打開電轉儀，將上述混合物轉移至電轉杯中，在2500V電壓下進行電轉，并將1ml 含有抗性的BHI 培養基迅速加入電轉杯中，將其混勻后轉移到10ml離心管中，37℃，250r/min 離心1.5h，進行復蘇處理；取50μl上述混合物和50μl BHI培養基，混合均勻，然后涂在含有100μg/ml 氨芐西林的TSA平板上，置于37℃的保溫箱內，過夜培養；
（6）T-pMD19-mecA質粒的提取與測序驗證；
（7）T-pMD19-mecA質粒的雙酶切處理和mecA基因的凝膠回收
T-pMD19-mecA質粒經BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，進行凝膠電泳驗證和mecA基因凝膠回收；
（8）pET-21a(+) 質粒的雙酶切處理和凝膠回收
pET-21a(+) 質粒采用質粒DNA小量提取試劑盒回收后進行BamHⅠ和Hind Ⅲ內切酶雙酶切處理后，進行凝膠回收；
（9）pET-21a(+) 質粒與mecA基因連接；
（10）oligos 的設計、合成、磷酸化及退火處理；
（11）pCas9∷mecA質粒的構建
pCas9凝膠回收產物與退火的雙鏈oligos連接體系：pCas9凝膠回收產物12μl ，稀釋后的oligos 1.5μl，T4連接酶1μl，T4連接酶buffer 2μl，雙蒸水3.5μl；
連接條件：16℃下過夜連接，之后電轉100μl DH5α感受態細胞，選擇單克隆菌落提取pCas9∷mecA質粒；
（12）電轉pET-21a(+)-mecA質粒到大腸桿菌表達菌株BL21（D3）中；
（13）電轉pCas9∷mecA質粒和pCas9質粒到BL21（D3）+pET-21a(+)- mecA感受態細菌中；
（14）電轉pCas9∷mecA質粒和pCas9質粒到BL21（D3）+pET-21a(+)感受態細菌中。
優選的，步驟（1）中所述PCR擴增過程中所需要的擴增引物為：
F：CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG
R：CCCAAGCTTATTCATCTATATCGTATTTTTTATTA 。
優選的，所述PCR擴增的體系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，擴增引物F 1μl，擴增引物R 1μl，MRSA DNA 2 μl，雙蒸水8.5 μl。
優選的，所述PCR擴增的過程是：
<1> 預變性：94℃下加熱5分鐘；
<2> 變性：94℃下加熱30秒；
<3> 退火：50℃下加熱30秒；
<4> 延伸：72℃下加熱1分鐘；
<5> 循環處理：循環<2>~<4>過程35次；
<6> 再延伸：72℃下繼續延伸10分鐘。
優選的，步驟（10）中所述磷酸化的條件： 37℃水浴1h，再 65℃水浴20min，酶失活。
優選的，步驟（10）中所述的退火處理為：加2.5μl 1M 的Nacl 到磷酸化的oligos 對中，然后將水浴鍋加熱到95℃后將體系放入，5分鐘后關閉水浴鍋電源，使其緩慢降溫至50℃時，緩慢向水浴鍋中添加冰水至溫度降至室溫。
優選的，所述質粒的提取過程是：選擇單克隆菌落，并置于含有100μg/ml 氨芐西林的無菌BHI液體培養基中，進行增菌，然后提取質粒。
本試驗過程中使用的細菌菌株及質粒來源：選擇2014年6月~2014年12月收集的來自鄭州市某綜合醫院臨床標本，其中選MRSA mel-stap-a2014124 /zz菌株對mecA基因編碼轉肽酶的C末端的DNA序列進行PCR擴增，目的片段長度為1046bp；大腸桿菌DH5α菌株由本實驗室保存；大腸桿菌BL21(D3)購自康為世紀有限公司；T載體（PMD-19 simple）購自大連的寶生物工程公司；pCas9質粒購自江蘇吉瑞公司；pET-21a(+) 為本實驗室保存；BsaI 內切酶購自NEB公司；T4 PNK 購自NEB公司；BamHⅠ和Hind Ⅲ 購自NEB公司；T4 DNA 連接酶購自NEB公司。
本試驗過程中使用的主要試劑來源：溴化乙啶（Ethidium Bromide，EB）、氯霉素和TAE購自上海Solarbio公司，瓊脂糖購自西班牙BIOWEST公司，Loading buffer購自碧云天生物技術有限公司，PH精密試紙購自天津市金達化學試劑廠，酵母浸粉、胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，TSA培養基購自青島海博生物技術有限公司，腦心浸液培養基（BHI）購自北京陸橋技術有限責任公司，細菌質粒DNA小提試劑盒、微量DNA回收試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR) 相關試劑、DL2000 DNA maker（DL2000及DL15000）和氨芐西林購自上海萊楓生物科技有限公司，氫氧化鈉、氯化鈉購自洛陽昊華化學試劑有限公司，瓊脂粉購自Sigma公司，丙三醇購自天津市凱通化學有限公司，細菌基因組DNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，溶葡萄球菌酶購自SIGMA-ALDRICH。
本試驗過程中使用的主要試劑的配制：
溶葡萄球菌酶緩沖液：將2mM EDTA和20mM Tris-HCl加到1.2% Triton中，用NaOH調節pH值至8.0，在121℃下滅菌20min，冷卻至室溫后，再加入溶葡萄球菌酶至濃度為200μg/mL，然后分裝為180μl的小份，置于-20℃下保存備用。
1.5 %瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖1.5g加入到100mL 1×TAE工作液體中，攪拌均勻后置于電爐上加熱，直到液體沸騰后變為透明，冷卻到56℃，再加入5μl EB，混合均勻備用。
25mg/ml 的氯霉素溶液：稱取250mg氯霉素粉劑，加入到10ml 無水乙醇中混勻，使用22μm濾膜過濾，得到氯霉素溶液，分裝為1ml的小份于-20℃下保存備用；使用時，將100ml LB、BHI、或BSA培養基置于121℃下滅菌20min，并降溫至60 ℃，然后加入100μl上述所得氯霉素溶液，使最終工作濃度為25μg/ml。
100mg/ml 氨芐西林水溶液：稱取1000 mg 氯霉素粉劑，加入到10ml去離子水中，混勻，使用22μm濾膜過濾，得到氨芐西林水溶液，分裝為1ml的小份于-20℃下保存備用；使用時，將100ml LB、BHI、或BSA培養基置于121℃下滅菌20min，并降溫至60 ℃，然后加入100μl上述所得氨芐西林水溶液， 使最終濃度為100ug/ml。
LB液體培養基：稱取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉和1.0g氯化鈉溶于100mL蒸餾水中，用10mol/L NaOH調節pH值至7.2，并于121℃下滅菌20min，然后置于4℃下保存備用；使用時根據培養菌株所含電轉質粒的抗性添加100μl上述配置好的氯霉素或氨芐西林抗生素溶液，混合均勻后使用。
LB固體培養基：稱取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化鈉和1.5g瓊脂粉，溶于100mL蒸餾水中，用10mol/L NaOH調節pH值至7.2，并于121℃下滅菌20min，冷卻至50℃~60℃，使用時根據培養菌株所含電轉質粒的抗性添加100ul上訴配置好的氯霉素或氨芐西林抗生素溶液傾注平板備用。
TSA培養基：稱4g 購買的TSA培養基加入到100mL去離子水中，在121℃下滅菌20min，并降溫至50℃~60℃，使用時根據電轉質粒的抗性添加100ul上述配置好的氯霉素或氨芐西林抗生素溶液，混合均勻后倒入培養基平板，每板15ml，待晾干后置于4℃下保存備用。
BHI培養基：稱取3.8g購買的BHI培養基加入到100mL去離子水中，在121℃下滅菌20min，降溫至50℃~60℃，使用時根據電轉質粒的抗性添加100μl上述配置好的氯霉素或氨芐西林抗生素溶液，混合均勻后備用。
1M 的NaCl：稱取5.844g NaCl 到100mL 去離子水中，在21℃下滅菌20min，備用。
10%的甘油：取10mL丙三醇加入到80mL的去離子水中，定容至100ml，在21℃下滅菌20min，備用。
本試驗過程中使用的主要儀器設備來源：
LabcyCler basic 梯度PCR儀購自 德國SensoQuest公司，JW-2017H高速離心機購自安徽嘉文儀器裝備有限公司，HVE-50型自動電熱壓力蒸汽滅菌器購自日本Hirayama公司，海爾立式超低溫保存箱購自青島海爾股份有限公司，SK-1型快速混勻器購自 江蘇金壇醫療儀器廠，隔水式電熱恒溫培養箱購自上海新苗醫療器械制造有限公司，DYC31B型水平電泳槽購自北京市六一儀器廠，HH-42S數顯恒溫磁力攪拌循環水箱購自常州國華電器有限公司，ZD-85氣浴恒溫振蕩器購自金壇市精達儀器制造有限公司，Gene pulser XCell 電轉化儀購自Bio-Rad公司，微量可調節移液器購自美國Thermo公司，101-1B型電熱鼓風干燥箱購自上海市實驗儀器總廠，WD—9403C紫外儀購自北京六一儀器廠，Gene-Genius bioimaging system購自基因有限公司，DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠。
未作特別說明的試驗材料和方法均為公知技術，可在常用工具書包括《分子克隆實驗指南》（J.薩姆布魯克、D.W拉塞爾著，第三版，科學出版社，2002）等中查找。
本發明的有益效果是：
本發明通過構建靶向mecA 基因的pCas9∷mecA 質粒及含有mecA 基因的大腸桿菌質粒pET-21a(+)-mecA 質粒，將前者電轉入含有后者的大腸桿菌表達菌株中，從而實現清除mecA 所在質粒的目的。該方法操作簡單，特異性強，針對類似于mecA 基因的傳播方式，不僅可以消除MRSA菌株，同時可以預防敏感菌株接受mecA 基因后轉變為MRSA菌株；同時較傳統的基因編輯手段更為靈活，編輯效率更高。
具體實施方式
以下通過實施例對本發明特征及其它相關特征作進一步詳細說明，以便于同行業技術人員的理解：
本發明提供的基于CRISPR/Cas9技術消除mecA 質粒的方法，包括以下步驟：
（1）DNA模板制備
使用細菌基因組DNA提取試劑盒從MRSA mel-stap-a2014124/zz菌株中提取DNA；
（2）mecA 基因PCR擴增
選擇MRSA菌株對mecA 基因編碼轉肽酶C末端的DNA序列進行PCR擴增；
其中，擴增引物為：
F：CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG
R：CCCAAGCTTATTCATCTATATCGTATTTTTTATTA ；
PCR擴增的體系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μl，擴增引物F 1μl，擴增引物R 1μl，MRSA DNA 2 μl，雙蒸水8.5 μl；
PCR擴增的過程包括：
<1> 預變性：94℃下加熱5分鐘；
<2> 變性：94℃下加熱30秒；
<3> 退火：50℃下加熱30秒；
<4> 延伸：72℃下加熱1分鐘；
<5> 循環處理：循環<2>~<4>過程35次；
<6> 再延伸：72℃下繼續延伸10分鐘；
（3）mecA 基因凝膠回收
將40μL PCR體系加入到凝膠電泳的加樣孔中，再加入DL2000 DNA marker，在90V電壓下處理40分鐘，然后放入WD—9403C紫外成像儀中，將上述所得物的對應1000bp 左右的條帶迅速切割下來，切去多余的膠塊，采用微量DNA快速回收試劑盒回收，并用雙蒸MILLI-Q水洗脫，測量回收的DNA濃度，以便下一步連接實驗計算載體和目的片段比例；
（4）將步驟（3）所得的mecA 基因與T-pMD19（simple）載體連接
連接體系包含：T-pMD19（simple） 載體1μl，mecA 基因5μl，連接Takara Buffer 5μl；將所得連接體系置于隔水式電熱恒溫培養箱中在16℃下的進行過夜連接；
（5）制備DH5α感受態細胞
將DH5α細菌接種到無抗性無菌的LB固體培養基內，在37℃下進行過夜培養；將5ml無抗生素的無菌BHI培養基裝入到20ml滅菌玻璃試管內，選擇DH5α細菌的單克隆菌落，接種到上述無抗生素的無菌BHI培養基內，在37℃下，以250r/min的速率振搖過夜，進行增菌；
將上述所得的DH5α細菌以1:100的比例加入到新的無菌無抗生素的BHI培養基中，在37℃下，以250r/min的速率振搖2.5小時，當細菌的OD值達到0.3~0.4時停止培養，置于冰上進行冰浴預冷，至菌液溫度降至3℃~4℃；
將50ml離心管和10%甘油在在121℃下滅菌處理20min，并冷卻至3℃~4℃，備用；將上述預冷過的菌液倒入離心管內，在4℃下以6000r/min的速率進行離心處理10min，除去上清液；再加入45ml預冷的MILLI-Q水，經槍頭吹打混勻后，在4℃下以6000r/min的速率進行離心處理10min，除去上清液；重復該步驟一次；
再取45ml上述甘油置于離心管內，以6000r/min的速率在4℃下離心10分鐘，棄上清；
冰上操作：在離心管中加入500μl 上述甘油，混勻，得到DH5α感受態細胞，置于-80℃的冰箱內保存備用；
（6）將步驟（4）所得產物電轉DH5α感受態細胞
取100μl DH5α感受態細胞置于冰上解凍；取11μl步驟（4）所得產物置于1.5ml的離心管中，將離心管和0.2cm電轉杯一起置于冰上預冷10min；將100μl解凍的感受態細胞轉移到上述1.5ml離心管中，冰上混勻后，繼續冰浴10min；
打開電轉儀，將上述混合物轉移至電轉杯中，在2500V電壓下進行電轉，并將1ml 含有抗性的BHI 培養基迅速加入電轉杯中，將其混勻后轉移到10ml離心管中，37℃，250r/min 離心1.5h，進行復蘇處理；取50μl上述混合物和50μl BHI培養基，混合均勻，然后涂在含有100μg/ml 氨芐西林的TSA平板上，置于37℃的保溫箱內，過夜培養；
（7）T-pMD19-mecA 質粒的提取與測序驗證
選擇步驟（6）所得產物中的單克隆菌落，并置于含有100μg/ml 氨芐西林的無菌BHI液體培養基中，進行增菌，然后提取T-pMD19-mecA 質粒；
使用質粒DNA小量提取試劑盒，分兩次每次收集1ml菌液，分別離心各1min，棄上清，槍頭吸出殘余菌液，中間步驟按照說明書進行，最后一步經MILLI-Q水洗脫及溶解，加水體積為每柱60μl，第一次洗脫液再次加入柱中進行第二次洗脫，以提高質粒DNA濃度；
（8）將提取的T-pMD19-mecA 質粒送至上海生工生物科技公司測序驗證；
（9）T-pMD19-mecA 質粒的雙酶切處理和mecA 基因的凝膠回收
T-pMD19-mecA 質粒在經BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，進行凝膠電泳驗證和mecA 基因凝膠回收；
酶切體系20μl：質粒DNA5μl，BamHⅠ和Hind Ⅲ內切酶各1μl，Cutsmart buffer 2μl，雙蒸水11μl；
將上述酶切體系在37℃下水浴4小時，完成T-pMD19-mecA 質粒的雙酶切反應，再放入DYY-6C型電泳儀，90V下電泳40min，其中電泳介質為1.5%瓊脂糖凝膠；mecA 基因凝膠回收過程與步驟（3）一致；
（10）pET-21a(+) 質粒的雙酶切處理和凝膠回收
pET-21a(+) 質粒采用質粒DNA小量提取試劑盒回收后進行BamHⅠ和Hind Ⅲ內切酶雙酶切處理后，進行凝膠回收；
酶切體系（20μl）：pET-21a(+) 質粒DNA 15μl，BamHⅠ和Hind Ⅲ內切酶各1.5μl，Cutsmart buffer 2μl ；
酶切過程與步驟（10）一致，凝膠回收的過程與步驟（3）一致；
（11）pET-21a(+) 質粒與mecA 基因連接
pET-21a(+) 質粒雙酶切后凝膠回收片段（10ng/μl），與步驟（9）中凝膠回收的mecA 基因 (12ng/μl)連接；
連接體系（32μl）：pET-21a(+) 質粒雙酶切后凝膠回收片段20μl，凝膠回mecA 基因片段8μl，T4連接酶1μl，T4 連接酶buffer 3μl；
連接反應條件：將連接體系于16℃水浴下進行過夜連接，之后，電轉300μl DH5α感受態細胞，選擇單克隆菌落提取pET-21a(+)-mecA 質粒后送上海生工生物科技公司測序。
（12）oligos 的設計、合成、磷酸化及退火處理
利用sgRNAcas9 軟件設計，挑選出6種對脫靶效率最低的oligos 序列，并參考文獻中的兩對oligos 序列，并參照oligos設計原則添加BsaI酶切位點后由上海生工生物科技公司合成。
oligos 磷酸化體系（50μl）： oligo I (100 μM) 1 μl，oligo II (100 μM) 1μl，10X T4 Ligase buffer (NEB) 5 μl， T4 PNK (NEB) 1 μl，ddH2O 42 μl；
去磷酸化條件： 37℃水浴1h，再 65℃水浴20min，酶失活；
Oligos 退火步驟：
加2.5μl 1M 的Nacl 到磷酸化的oligos 對中，然后將水浴鍋加熱到95℃后將體系放入，5分鐘后關閉水浴鍋電源，使其緩慢降溫至50℃時，緩慢向水浴鍋中添加冰水至溫度降至室溫；
Oligos序列見表1：
表1 Oligos序列
注：“F”代表正義鏈，“R”代表反義鏈。
（13）pCas9∷mecA 質粒的構建
pCas9質粒Bsal內切酶的酶切體系：pCas9質粒15μl，Bsal內切酶1μl，cutsmart buffer 2μl，雙蒸水2μl；
酶切條件：37℃水浴3h，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后凝膠回收；
pCas9凝膠回收產物與退火的雙鏈oligos連接體系：pCas9凝膠回收產物12μl，稀釋后的oligos 1.5μl，T4連接酶1μl，T4連接酶buffer 2μl，雙蒸水3.5μl；
連接條件：16℃下過夜連接，之后，電轉100μl DH5α感受態細胞，選擇單克隆菌落提取質粒并送上海生工生物科技公司測序；
（14）電轉pET-21a(+)-mecA 質粒到大腸桿菌表達菌株BL21（D3）中
采用步驟（7）的方法得到增菌液，將增菌液分為兩份，其中一份菌液直接提取質粒進行單酶切，經過凝膠電泳驗證細菌中是否具有質粒pET-21a(+)-mecA ，另一份直接制作感受態細胞；
（15）電轉pCas9∷mecA 質粒和pCas9質粒到BL21（D3）+pET-21a(+)- mecA 感受態細菌中
電轉質粒pCas9∷mecA 和對照質粒pCas9 各2μl到100μl BL21（D3）+pET-21a(+)-mecA感受態細菌中；
取100μl上述菌液稀釋10倍，再取10μl 稀釋后的菌液涂布含有25μg/ml氯霉素的TSA平板，在37℃下過夜培養，并對平板上所有菌落進行計數編號；
在每個平板上隨機選取10個菌落進行液體增菌，提取質粒；
所提取的質粒利用hind III酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳以判斷Cas9質粒對pET-21a(+)-mecA 的作用；
（16）電轉pCas9∷mecA 質粒和pCas9質粒到BL21（D3）+pET-21a(+)感受態細菌中
取100μl菌液稀釋10倍，再取10μl 稀釋后的菌液涂布含有25μg/ml的氯霉素的TSA平板，在37℃下過夜培養，并對平板上所有菌落進行計數編號；
在每個平板上隨機選取10個菌落進行液體增菌，提取質粒；
所提取的質粒利用BamHⅠ酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳以判斷Cas9質粒對pET-21a(+)的作用。
9種不同Cas9質粒對pET-21a(+)-mecA 質粒和pET-21a(+)質粒的清除效率，如表2和表3：
由表2 可見，9種Cas9質粒對pET-21a(+)-mecA質粒的清除作用總體上存在差異，各組與對照組質粒pCas9的作用通過兩兩對比以后發現每次比較的P 值均為0.00小于調整后的檢驗水準α=0.006，因此除對照組pCas9質粒以外，剩余8組pCas9-mecA 質粒均對質粒pET-21a(+)-mecA 具有明顯的清除作用。由表3可見包括對照組pCas9在內的90個菌落的檢測結果均表明，PCas9-mecA 質粒對于不包含mecA 基因的pET-21a(+)質粒均沒有消除作用。
表2 9種Cas9 質粒對pET-21a(+)-mecA 質粒消除作用效率
注：“*”為經Fisher 確切概率法雙側檢驗水準α=0.05，“^”因樣本量小于40，故采用2×2四格表Fisher確切概率法，經雙側檢驗，校正后檢驗水準α=0.006。
表3 9種Cas9質粒對質粒pET-21a(+)消除作用效率
以上通過實施例對本發明的進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發明的實施范圍。凡依本發明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發明的專利涵蓋范圍之內。