本發明屬于醫藥制品
技術領域：
，涉及一種林可霉素的純化方法，具體涉及利用二元混合萃取劑萃取林可霉素的方法。
背景技術：
：林可霉素(lincomycin)是一種堿性廣譜抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌有效，臨床上用于金黃色葡萄球菌、綠色鏈球菌、肺炎雙球菌等引起的感染治療。以林可霉素為原料藥開發的克林霉素常用于敗血癥、呼吸道系統感染、皮膚軟組織感染等多種疾病的治療。林可霉素主要通過微生物發酵培養分離得到的一種抗生素，其分子結構中有多個手性中心，存在多個異構體，林可霉素在發酵過程中除主要產生林可霉素A組分外，還伴生少量副產物林可霉素B及林可霉素E等組分。相對林可霉素A組分，B組分抗菌活性較低，且毒性較大，這些副產物影響林可霉素為原料合成克林霉素等衍生物的收率和質量(岳曉日.鹽酸林可霉素的萃取與結晶提純，華東理工大學學報，2009，35(5)：673～676)。因此在林可霉素的生產中，需要通過一系列的純化工藝，使得產品中的B組分含量盡可能低。林可霉素傳統的提取工藝是以正丁醇為萃取劑萃取林可霉素實現工業化生產的，但該方法存在萃取效果差，溶劑操作環境差、消耗大、能耗高等缺點。目前國內外也有大量研究者報道采用吸附樹脂純化林可霉素，然而，樹脂工藝純化林可霉素存在的普遍性問題是吸附樹脂再生時所需的酸、堿、水的用量很大、成本較高，因此，難以實現工業化應用。近年來，國內不少研究者研究開發了新型的萃取劑體系，如中性膦類萃取劑、混合醇類萃取劑(主要是癸醇的混合物)、肟類萃取劑、脂類萃取劑等，針對性的解決了林可霉素萃取過程中所遇到的一些問題。但是，這些萃取劑在生產過程中仍存在一些問題，如：中性膦類萃取劑價格高、毒性大；混合醇類萃取劑萃取率低，溫度高，氣味難聞；肟類萃取劑反萃取較難實現等；另外，這些萃取劑普遍存在萃取劑回收困難(盧珂.提取林可霉素的二元萃取劑的研究，中國抗生素雜質，2008,33(6)：338～341)。如專利CN103724380A公布采用仲辛醇作為萃取劑，具有較好的萃取效果及B組分去除效果，但仲辛醇沸點較高，不利于重復回收率用，以致其工藝成本加大。因此，開發新型的萃取劑具有重要的現實意義和應用價值。林可霉素的萃取劑的選擇應滿足萃取率高、選擇性好的基本要求外，仍需兼顧損耗、能耗、安全、是否易回收等多方面因素。以苯甲醇與二氯甲烷為二元萃取體系除具備單一溶劑萃取體系的選擇性高、分離效果好和適應性強的特點外，還具有純化收率高，林可霉素副產物(如B組分等雜質)去除效果好等優點。技術實現要素：本發明針對現有技術的不足，提供了一種林可霉素的純化方法，特別是林可霉素發酵液的純化方法，該方法具有簡單易行，成本較小，雜質成分去除率高的特點，且能夠適用于工業化生產。為解決上述技術問題，本發明提供了一種林可霉素發酵液的純化方法，包含以下步驟：①使用苯甲醇和二氯甲烷混合物為二元萃取劑對發酵液進行萃取，收集有機相；②對步驟①所收集有機相使用酸性純化水進行反萃取，收集水相，得到反萃取液；③將反萃取液濃縮后用丙酮結晶。根據本發明一些實施例，苯甲醇所占二元萃取劑體積比為50％-80％。根據本發明一些實施例，步驟①所述的發酵液經過了過濾、濃縮。根據本發明一些實施例，步驟①所述的發酵液的pH為10-12。根據本發明一些實施例，步驟②所述反萃取時pH為1-3。根據本發明一些實施例，步驟①萃取和步驟②反萃取時發酵液的溫度控制在10-30℃。在一些實施方案中，本發明提供了一種林可霉素發酵液的純化方法，由以下步驟組成：(1)將林可霉素發酵液的pH調節至3-5，過濾，得到濾液；(2)將濾液的pH調節至9-11，超濾，得透過液；(3)將透過液通過納濾膜濃縮5-10倍，得到濃縮液；(4)將濃縮液的pH調節至10-12，加入發酵液體積20％-100％的苯甲醇和二氯甲烷混合物為二元萃取劑對發酵液進行萃取，收集有機相；(5)在步驟(4)得到的有機相中加入純化水，調節溶液的pH為1-3后進行反萃取，收集水相，得到反萃液；(6)對步驟(5)得到的反萃液進行減壓濃縮5-20倍，向濃縮液中加入2-10倍體積的丙酮進行結晶，干燥后即得粗品。根據本發明一些實施例，苯甲醇所占二元萃取劑體積比為50％-80％。根據本發明一些實施例，步驟(4)萃取和步驟(5)反萃取時溫度控制在10-30℃。根據本發明一些實施例，步驟(5)反萃取中純化水的加入量為有機相體積的25％-50％。根據本發明一些實施例，步驟(4)萃取和/或步驟(5)反萃取，可以是一次，也可以重復多次。本發明中所述的“重復多次”是指萃取和/或反萃取過程重復操作2～5次，例如萃取過程重復操作3次，反萃取過程重復操作3次；或萃取過程重復操作4次，反萃取過程重復操作4次；或萃取過程重復操作3次，反萃取過程重復操作4次。本發明所述的“加入發酵液體積20％-100％的苯甲醇和二氯甲烷混合物為二元萃取劑對發酵液進行萃取”，其中“20％～100％”為一次或多次萃取加入的苯甲醇和二氯甲烷混合物的總量為發酵液體積的20％～100％。本發明所述的“純化水的加入量為有機相體積的25％-50％”為一次或多次反萃取加入的純化水的總量為有機相體積的25％-50％。本發明有益效果在于：本發明提供的林可霉素發酵液純化的方法，可以分離發酵液中的菌體殘渣、大分子雜質及大部分的酸性蛋白和堿性蛋白，減少了萃取中易出現的乳化現象產生，具有提取率高，林可霉素副產物B組分等雜質去除效果好、產品回收率高的特點，整套處理工藝無需使用樹脂工藝純化，溶劑也方便回收，可以大大節約生產成本。具體實施方式以下所述的是本發明的優選實施方式，本發明所保護的不限于以下優選實施方式。應當指出，對于本領域的技術人員來說在此發明創造構思的基礎上，做出的若干變形和改進，都屬于本發明的保護范圍。實施例中所用的原料均可以通過商業途徑獲得。本發明中的林可霉素B組分結構及定量檢測均為參考《歐洲藥典7.0》。實施例1取林可霉素發酵液300Kg，加草酸調節pH至3，經板框壓濾，得到濾液；用NaOH調節濾液的pH至11，將堿化液通過陶瓷超濾膜進行超濾，超濾膜的孔徑為0.1μm，回流閥控制入膜壓力≤1.0Mpa，溫度控制在10℃～35℃，得到陶瓷膜透過液；透過液通過納濾膜濃縮10倍，納濾膜的孔徑為0.001μm，得到納濾濃縮液；NaOH調節納濾濃縮液的pH至12，向濃縮液中加入1/10倍濃縮液體積的苯甲醇與二氯甲烷二元萃取劑，苯甲醇的比例為60％，攪拌30min，萃取過程中料液溫度控制為30℃，靜止30min后分相，收集有機相。萃余相繼續加入1/10倍濃縮液體積的上述相同比例的苯甲醇與二氯甲烷二元萃取劑，攪拌30min，靜止30min后分相，收集有機相，重復萃取3次；將3次萃取的有機相合并，加入1/6倍體積的純化水，HCl調節溶液的pH至2，反萃取過程中料液溫度控制為30℃，攪拌30min，靜止30min后分相，收集水相；有機相中繼續加入1/6體積的純化水，HCl調節溶液的pH至2，反萃取過程中料液溫度控制為30℃，攪拌30min，靜止30min后分相，收集水相，重復反萃取3次；將上述3次反萃取的水相合并。對反萃液進行減壓濃縮10倍，向濃縮液中加入5倍體積的丙酮進行結晶、80℃烘箱干燥得到林可霉素粗品。實施例中，料液經酸堿處理、陶瓷膜超濾后的濾液無懸浮物；加入二元萃取劑苯甲醇與二氯甲烷的第1級萃取過程中，出現少量的乳化物，第2、3級萃取過程中幾乎無乳化物；烘干后的粗品經高效液相色譜檢測，林可霉素的含量達到98.67％，B組分含量為0.28％，收率為95.76％。實施例2取林可霉素發酵液350Kg，加鹽酸調節pH至5，經板框壓濾，得到濾液；用NaOH調濾液的pH至9，將堿化液通過陶瓷超濾膜進行超濾，超濾膜的孔徑為0.1μm，回流閥控制入膜壓力≤1.0Mpa，溫度控制在10℃～35℃，得到陶瓷膜透過液；透過液通過納濾膜濃縮10倍，納濾膜的孔徑為0.001μm，得到納濾濃縮液；用NaOH調節納濾濃縮液的pH至10，向林可霉素濃縮液中一次性加入1/5倍濃縮液體積的苯甲醇與二氯甲烷二元萃取劑，苯甲醇的比例為50％，攪拌30min，萃取過程中料液溫度控制為10℃，靜止30min后分相，收集有機相。向萃取后的有機相中一次性加入1/4倍有機相體積的純化水，HCl調節溶液的pH至1，反萃取過程中料液溫度控制為10℃，攪拌30min，靜止30min后分相，收集水相；對反萃液進行減壓濃縮至20倍，向濃縮液中加入2倍體積的丙酮進行結晶、100℃烘箱干燥得到林可霉素粗品。實施例中，料液經酸堿處理、陶瓷膜超濾后的濾液無懸浮物；加入二元萃取劑苯甲醇與二氯甲烷萃取過程中，會出現一些乳化物；烘干后的粗品經高效液相色譜檢測，林可霉素的含量為98.27％，B組分含量為0.25％，收率為95.87％。實施例3取林可霉素發酵液310Kg，加草酸調節pH至3，經板框壓濾，得到濾液；用NaOH調節濾液的pH至11，將堿化液通過陶瓷超濾膜進行超濾，超濾膜的孔徑為0.1μm，回流閥控制入膜壓力≤1.0Mpa，溫度控制在10℃～35℃，得到陶瓷膜透過液；透過液通過納濾膜濃縮5倍，納濾膜的孔徑為0.001μm，得到納濾濃縮液；納濾濃縮液用NaOH調節pH至12，向濃縮液中加入1/4倍濃縮液體積的苯甲醇與二氯甲烷二元萃取劑，苯甲醇的比例為80％，攪拌30min，萃取過程中料液溫度控制為30℃，靜止30min后分相，收集有機相；萃余相繼續加入1/4倍濃縮液體積的上述相同比例的苯甲醇與二氯甲烷二元萃取劑，攪拌30min，靜止30min后分相，收集有機相，重復萃取4次；將4次萃取的有機相合并，加入1/8倍體積的純化水，HCl調節溶液的pH至3，反萃取過程中料液溫度控制為30℃，攪拌30min，靜止30min后分相，收集水相；有機相中繼續加入1/8體積的純化水，HCl調節溶液的pH至3，反萃取過程中料液溫度控制為40℃，攪拌30min，靜止30min后分相，收集水相，重復反萃取4次；將上述4次反萃取的水相合并。對反萃液進行減壓濃縮10倍，向濃縮液中加入10倍體積的丙酮進行結晶、50℃烘箱干燥得到林可霉素粗品。實施例中，料液經酸堿處理、陶瓷膜超濾、納濾后的濃縮液中加入二元萃取劑苯甲醇與二氯甲烷萃取的過程中，出現少量的乳化物；烘干后的粗品經高效液相色譜檢測，林可霉素的含量達到98.87％，B組分含量為0.21％，收率為95.12％。對比實施例如實施例1所述的工藝條件，考察一元萃取劑對最終產品的品質及純化工藝收率的影響。其區別在于所用萃取劑為苯甲醇，正丁醇或二氯甲烷。不同一元萃取劑對產品品質及收率的影響如表1所示。對照實施例可以看出，常見的一元萃取劑(苯甲醇、二氯甲烷及正丁醇)對林可霉素中的B組分去除效果均較差，收率均較低，且在萃取過程中均出現大量的乳化物。表1不同一元萃取劑對產品品質及工藝收率的影響萃取劑種類苯甲醇正丁醇二氯甲烷A組分含量(％)91.2390.2889.29雜質B組分含量(％)2.231.191.06收率(％)92.1290.1385.26當前第1頁1 2 3