2?n?庚基?4?羥基喹啉的制備方法與流程

本發明涉及生物醫藥及農藥領域，具體涉及一種2-n-庚基-4-羥基喹啉的制備方法。

背景技術：

喹啉類衍生物是一類重要的雜環化合物，被廣泛應用于香料、染料和醫藥工業等領域，且喹啉類化合物具有廣泛的生物活性，加之其具有低毒、高效、對環境友好、結構變化多樣等特點，已成為當今新農藥研究的雜環結構之一，因此對喹啉類衍生物的制備也有多種方法，主要為化學合成和非基因工程手段的生物合成。

生物合成中，2-n-庚基-4-羥基喹啉主要是通過從非鏈霉菌來源的微生物如Pseudomonas methanica分離菌株通過發酵產生，尚無通過基因或基因簇異源表達方式在大腸桿菌宿主菌體內產生該化合物的方法，大腸桿菌自身并不產生2-n-庚基-4-羥基喹啉(2-n-heptyl-4-hydroxyquinoline)。

因此利用微生物異源表達生產出2-n-heptyl-4-hydroxyquinoline為今后喹啉類衍生物類生物醫藥及農藥領域發展提供基因工程菌和新的發展方向。

技術實現要素：

本發明意在利用微生物異源表達出喹啉類衍生物，提供一種2-n-庚基-4-羥基喹啉新的的制備方法。

本方案中的2-n-庚基-4-羥基喹啉的制備方法，首先，用基因工程技術對鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2菌株的zunyimycins生物合成基因簇進行克隆與鑒定；然后，將該基因簇整合進原核表達質粒載體pET32a中，構建該基因簇的異源表達質粒載體pET-abx；再次，將表達質粒載體pET-abx轉化大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)Rosetta，最后，通過IPTG誘導合成目的蛋白的菌株，發酵后得到發酵產物，對發酵產物進行產物純化和結構解析，得到2-n-庚基-4-羥基喹啉化合物。

其中，基因異源表達技術是指用生物信息學的方法對基因組序列進行分析，尋找其中某些酶的基因簇的保守序列，預測基因的功能、生物合成途徑和基因簇的產物結構，，通過基因敲除等手段驗證基因簇功能后，將基因簇DNA序列整合進相應表達質粒載體，轉化宿主菌，是的宿主菌生產目的產物。

異源表達即為非本體生產菌中分析基因的表達情況，通過基因工程操作，將原始菌株中的次級代謝產物的基因簇分離出來，經修飾改造后，將整個基因簇導入表達宿主中，發酵分離鑒定化合物，分析得到的新化合物。

其中，對鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2菌株發酵并分離得到鹵化型聚酮化合物zunyimycins，因此zunyimycins生物合成基因簇即為鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2菌株能表達發酵出鹵化型聚酮化合物的基因。

本發明的有益效果為：將鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2菌株來源的的zunyimycin生物合成基因簇在大腸桿菌體內異源表達，首次制備出2-n-庚基-4-羥基喹啉，為通過基因工程手段微生物生產喹啉類衍生物提供新的發展方向。

進一步優化的，：鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2菌株的保藏號為：CGMCC 4.7321，在中國普通菌種保藏中心保存。

進一步優化的，所述zunyimycins生物合成基因簇的NCBI提交序列號為No.KU243130。

進一步優化的，所述IPTG誘導合成的溫度為18～28℃，表達的最適溫度為18℃。

附圖說明

圖1為本發明2-n-庚基-4-羥基喹啉質譜分析圖；

圖2為本發明2-n-庚基-4-羥基喹啉氫譜分析圖；

圖3為本發明2-n-庚基-4-羥基喹啉碳譜分析圖；

圖4為本發明2-n-庚基-4-羥基喹啉HMBC譜圖分析圖；

圖5為本發明2-n-庚基-4-羥基喹啉HSQC譜圖分析圖；

圖6為本發明2-n-庚基-4-羥基喹啉ROESY譜圖分析圖；

圖7為本發明2-n-庚基-4-羥基喹啉COSY譜圖分析圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明：

鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2材料信息

1.生物學命名：

鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2(基因組序列號：PRJNA320463)

2.基本生物學特性：

氣生菌絲發達，米黃色菌落，邊緣粗糙，有皺褶；孢子數目偏少；mol％G+C＝73％。

3.分離培養基：

固體GYM(ISP2)：葡萄糖4g，麥芽抽提物4g，酵母粉10g，碳酸鈣2g，瓊脂粉18g，加水至1000毫升，滅菌。

4.建議培養條件：

固體GYM培養基：最適培養溫度28℃，建議培養時間：4天。

5.分離地點：

貴州省梵凈山自然保護區(海拔高度800m，東經108°47′50″，北緯27°56′32″)。

6.保藏地點：

中科院微生物所中國普通菌種保存中心(菌保號：CGMCC 4.7321)。地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號：中國科學院微生物研究所；郵政編碼：100101。

7.保藏時間：

保藏時間為2016年6月2日。

8.分類依據：

經16S rRNA保守引物(27f/1492r)擴增，測序并在線比對分析和參考菌株Streptomyces sparsogenes strain NBRC 13086的同源性為99％，初步分類為鏈霉菌。

鏈霉菌Streptomyces sp.FJS3-2 16s RNA序列：

TGCAGTCGAACGATGAAGCCGCTTCGGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCTGGTGAGGCATCTTACTGGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTTGTCCGtGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAaGgAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACATCGGAAACATCCAGAGATGGGTGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGAGGGAGTC

鹵化二型聚酮化合物zunyimycins生物合成基因簇信息

對鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2菌株發酵并分離得到鹵化型聚酮化合物zunyimycins。

其中，R1、R2、R3各自獨立的選自H或Cl。

表1：zunyimycins生物合成基因簇信息：

>gi|1022946594|gb|KU243130.1|UNVERIFIED:Streptomyces sp.FJS31-2anthrabenzoxocinones biosynthetic gene cluster,complete sequence

CGACGCCGGGTCAGGAGCGCTTGAGGGGCGCCGGGGAGGTGGCGGGCCGGGAGGCGGAGCGGACCCGCTCGGGCCAGGGCGGGCAGTTCACCAGCTCGGCCCACTCCCGGTCGTAGCGCCCCGGCACGGCCCGGCCCGCGGAGGCCCAGCGCTCGACCAGGGCGGCGTAGATGGGCACACAGGTGCTTTGATGGAGCGTTTCGCCGCCCGCGGTGCTCCGGTCCAGCGCTCTGCTCGGCTGCGAGAGAGAACGGCGTCGCATCGTCGTCGTCATGTCAGGCCAACGCGCCGCGTCCGGTGCGGTCACCGGCTTCCCGCGGAGCTCACCCGGACCGGGGTGGTCTCGCACGTATCATCGACCGCGCCCGAAAGTGAAAAGCACTGCCGAATTCAGAAAGTATTCCGTATCGCTGCAGGCCCTGGTTCACAAACTCCGATTCACAAATGGATACGTCGAACTGATCAGCGATTTGCGGCGGGTAGGGGCGGTCTCGGTTCCGGTCTCCTGGGTGCGTGCTGCTCATGAATCGATTCGCGTATCAGCAGGCACAGATGCGATTGAGCCGAAATATGGTGCGGATCTACTGATCATGCAGGCCGGAGGTATGCTCGGCTGCGACCTGAATACGGGGGAGCGGGCGGGGCCTTGTGGCACCACAACGAGCCGGGGGAGTTCGCGAATGAGGTTTCAGGTTCTGGGAAACTTCGAAGTCCTGAGCGACACCCGCGCCCGGACGCCGAGCGCTCCCAAGCTCCGCCGGGCCCTGGCCCTGCTGATACTGCGGCACAACGAGGTCGTGCCCACCAAGGCCCTCATCGACGAACTCTGGGGAAGCCGGCCCCCGGACAAAGCCATTCGGGCTGTACACACCTACATCTATGAACTCCGCCGCAGCCTGGCCCGCCCGGGCGGTGGCGGAGAGCTGTTCCTCCAGACCCGGCCGAGCGGCTATACCGTTCGCGTACCGGAAAGCGCGATCGACCTCAATTCCTTTCGAGTCCTGGTCAAAGAGGGCAGGGAGGCGCTTGCTGCGGGGGACCCGGGACACGCCCGGGAAGTGCTGAACCGGGCCCTGGGGCTGTGGCAGGGCAGCGCCCTGGCCAATGTGGACTGCGGGGAACTGCTCGAAGCGCATGCGACCGAGCTGGAGGAGAGCCGGCTGCGTGCCCTGGAGATGCGCATCGAAGCCGATTTCCAACTCAGCCGGCACCATGAATTGACCGGTGAGCTCAAGGCGCTGGCCGCCGCCAGGCCCCTGCACGAGGGCATCCACGCCAAACTGATGCTCGCGCTCTACCGTTCGGGGCGGCGCGGCGAGGCGCTCAAGGTCTTCCACGACCTGCGCCGCCATCTGGTCGACGAGCTGGGCCTGGAGCCGGGCCCCGAGCTCCAGCGGCTGCAGCGCTCCATGCTCGCCGGGGACCCCTCGCTCGACCCGCCGACCGCGCCACCGCTCCCGCCGCCCCGCCGCGCGCAGCCCCCGGCACCGCCCGCCCAGCTCCCCCGGGACACCGTCGACTTCACCGGGCGGCAGGCCGTGCTCGACGAGGTCGGCGCCCTGCTCGCGCCCCACGGCGACGGCACGGGCCTGCCCGTGGTGTCGCTGGTCGGCATGCCGGGCGTCGGCAAGACGGCCACCGCCATCCACCTCGCCCACGCGGTCCGCGCCCGCTACCCCGACGGGCAGCTGTACGTACCGCTGGGCGGATCGCAGCCCACTCCGGCGACCGCGGCGGAGGGGATGGAACACATTCTGCGGGGGATCGGTGTGGCGCCGCGCGACATCCCGAGCACGCTGGGCGGGCGGATGGCCCTGTTCCGCACCTGGAGCTCCGACCGCCGGGTGCTGCTGGTACTGGACGACGCCGACTCGCCGCAGCAGGTCGAACCGCTGCTCCCGGGCGGCACCGGCTGCGCCGTGCTGATCACCGGCCGCTCCCTGCTGTACGGGCTGCGCGGGGCGCGGACCATCGCGCTGAGCTGCCTGTCCACCGCGGAGGGCGGGCAGCTGCTCACCCGGCTGATCGGGCGGGAGCGGACGGACGCCGAGCCCGAGGCCGTCGCCGATGTGGTGCGGCTGGCGGACGGTCTGCCGCTGGCCATCACCTTCCTCGGCGAGCGGCTGATGGCGTTGCGGCCGGTCAGTATCGCCTGCGTGCTGGCGAAGATACGATCCGCCAAGGGGCAGCACCGGCTCTCCGAGCTCTCGGCGCTGGGGCTCGACCTGTACGACCGGCTGGACAGCTGCTTCCGCAAGCTCGACGAGAACACGCAGCAGGCCTTTCTGCGGCTGGCCCTGATGCCGCGCCGGCTGTTCACCGCCGGGCAGGGCGCCCGTGCGCTGGGCACCGACACCACCTCGGCCGACGTGGTGCTCATGCGGCTGGTCGACGCCTCACTGGTGGAGGTCGCGGGGGAGCGGGAGGTGGGCGCGAGACACTACCGCTTC CGGGAACTGGTCCGCGAGTACGCGCTGGAGCGGATGGCGTGACCCGTACGGCGCCCGCGGCGCGCCACTTCACGGGCTTGTGCGCCCGCTGCGCCCGGATGGCCGTGGGCCGCGCGTTCAGGTGGTGTCCGCGGCCCGGTGTCCGGCCCGCAGCGCGGGTAGCACCACCTGGTCGACCATGGCCTCGATGGCCCGGTCGTCCGGCGGGGTGCCGTTGAGCAGATAGTGCATCATCACCTGCGCGGGCCCGGTCCGCGCGGCGAACGGGCCGGCCGACTCCCCGGGGATCTCGCCGCGCTCGGCCGCCCGCCGCAGGATCTCCGCGATCGCCTCCAGCCGCGGCTCGATGAACCGGGTGCGGAACACCGCGATCAGCTCGGGGTGGCGCAGCAGATCCCCCAGCAGCACCATCGCGGGCGGGCCGGTGCGGCCGGTGAGCGAGTCGGCCATCCGCCGCAGCGCCGCCACCAGTTCCTCGCGCAGATCGCCCGTCTCGGGCAGTTCCTCGCTGGGCAGCAGGACATGTTCGAAGGCGTCGAGCAGCAGGTCCTGCGGGGTGCTCCAGCGGCGGTACAGCGCCGCCTTACCGGTGCGCGCCCGTTCCGCGACCCCCTTGAGCGTCAGCCTGCCGTAGCCCAGTTCGGCGCACTCGGCGATCGTCGCCTTGTAGATGGCCCGCTCCAGGGCCGCGCCCCTGCGACGGGTCCGTACCGGCGGCGCCGGTGCTTCCTCCGCGCCCATCCGGCCGCCTTCCTCCCGGCAAGCATTGCCCCCAAAAGCCCCGTCAAGCACCTTCGAGCCCCTTTGCGGACTCTATCAGCGGGGTCTACCCTGCCGAATAAGGAACAGATTAGTCTACTATCCGGCCGGCGGCGCATCGCTGCGCCCCCTCCTCACGATGGGCGAAAGAGGGGCGAACGACCATGGACGTCACCCAGGACCCCGCCCCGCCGCCCCGGTTCTGGTGGGCCATTCTGGTGATCGCGGGAGCGCAGCTGATGGTGGTGCTGGACATCAGCATCGTGAACATCGCGCTGCCCAGCATCCGCGACGACCTCGGCTTCACCCGGTCCGGGCTGCAGTGGGTGGTCAACGGCTACACCCTCGCCTTCGGCGGGCTGCTGCTGTTCGGCGGCCGGGTGGGCGATCTCCTGGGCCGCCGCCGGGTGTTCGCCTGCGGAGTCTGCGCGTTCGCACTGATCTCCCTGCTCGGCGGCTTCGCCGACGGGCCCGGCCGGCTCATCGCCGCCCGCGCCGCCCAGGGCGTGGCCGGCGCCCTCGTCGCGCCCACCGCCCTGGCGCTGATCAGCACGACCTTCCCGGAAGGGCGGCAGCGCCGCGCCGCGTTCGGCGTCTACGGGGCGGTGTCCGCGGGCGGCGGGGCTATCGGGCTGCTGCTGGGCGGGCTGCTCACCGACACCCTCTCCTGGCGCTGGGTGCTCTGGGTCAATGTGCCCATCGGCGCCGCGCTCGCCTGTGGCGCCCTGCTGGTGCTGCCCTCCTCCGCGCGCCGGGGCGGCCGGTTCGACCTGCCCGGGGCGCTCTCGGTCACCGGCGGGCTGACCGCGCTGGTGTACGGGCTGGTCCGCGCCCCCCAGCACGGCTGGGCCGACCGCTGGACGCTGACCTCGTTCGCCGCGGCGGCCGGGCTCCTGGTCCTGTTCGTGTTGATCGAGGTGCGCGGCCGGCAGCCGCTGATGCCGTTGCGCGTCTTCGCCGACCGCGACCGCTCCGGTGCCTACGCGGTGACCCTCCTGACCGGCGCGGCGCTGCTGAGCACGCTCTTCTTCCTCGCCCAGTTCGCGCAGGACGTGATGGGCTACTCACCGCTGCGCAACGGCGTGGCGTTCCTGCCCAACGCCGCCTGCGTGCTGCTCTTCTCCGGGCTCGCCGCACGGCTGACCGCCCGCGTCGGCGCCATGCCGCTGATGGCCGCGGGCGCCGCCTCGATGGCCCTCGGCCTGGCCTGGCTGTCGCGGCTCGACGTCGGCGCGAGGTACGCCGCCGACCTGCTGCCGGGCCTGCTGCTGTACGGGTCCGGCCTCGGCCTGCTGTTCGTACCGCTGTCCATGACCGCGGTCGCGACCGTCGCGGACGAGGACTCCGGCCTCGCCTCCGGGCTGCTCAACACCGCCCAGCAGGTGGGCGGTTCGCTGGGCCTGGCCACGCTGAGCACCGTGGCGGCCGACTCCACCCGGGACGCCCTGCCCGCCGGCCGCCCGCCGACCCGCCCGCAGCTCGCCCACGCGCTGGCCGAGGGCTGGGCCACGGCCCTGTCCGTCAGCGTGGCCTTCGTCGGCTGCGCGCTGGTCCTCGTCGTGGCCGTGATCCGCGCCCGGCCGCGCGCCGCCGAGCCCGCCACACGGCAGGAGGCGGTCACCCGCACCCCGGGCTGACCCGGGCCGATGCCCGCCCTTGTGAGAAACCTGTCCGCTTCCTGAGCGTCGATGTGCAGGCTCGCCGCATCGGCTCTTTCCGGTTCCCCGGACGCGACCCGGCCCCGGGCCGCGATGAGCCGAGCGCCGCACACACAGCCGCACACACAGGGGGAGTGGTACGGATGGAGCGGGTCGCGCTGGGACTTCCGGTCGGACCGGGCAACGAAACGCGGGTGGCACGGCTGCTGCGCCGCCTCGCCCCGGCCCAGGCCGGCGAGGTGCGCACCGAGGCGGTGGCGACGTTCACCGCGCCGGGCCGGGTGCTGCACATCGCCGACACCACGGGCGGTCTCGACGGCCTCGTCGCCGACCTCACCGCGCACCCGGACGTCGCGGCCGGGCTGCGCGAGCTGTGCGGCATGCCCCACCGGCTGACGGTGGGCTCGTATCTCATCCGGGCCAGGCTCACCCGCTGGGCCCACTACGCCCGGCCGTACCCCGCGCGCCTCCCGGTGCACCGCCGCGCCCTGCTCTACCCGGTACGGCCGGGCAAGGGCGAGGAACTGCGCCGTCTGCTGGCCGCAGGAATCGCCCCCGGCACCTCCCAGAATCTCGCGTCCGCCCTGATCAGCAGCACCGTCTTCGCCCGCCAGGACCTCGTCGTCCGGTTCTGGGAGGCCACCGCGGACCCGGCCGAGGAGCTCGACAACATCGCCCGCGTCGTCCCGCGTTCCGGCCTGGGGGCCAAGCTCAACCGGCTCCTGGACATCGAGCAGGACCTGACCACCGACGCCGGATTCCGGGCGTTCTTCACGGGTTGCGCGATGTCCCCCGTCCCCGGC 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ACCTGACGCTGCCCGACGACGCCCTCAGTCGGATGCGCACCCCACGGCAGACCGTCTCCGTGGTCAACGCCTGTATCGGAAAAGAGGAGTGAGCCGGCTCATGACCGAAGCGACCGAAGCGACCACAGCGACTGAACCGACTGAGCATGCCCGCACCGACAACTCCATCGTCATCGACGCGCCCCTGGAGCTGGTCTGGGACATCACGAACGACGTCGAGAACTGGCCGCGGCTGTTCAGCGAGTACGAGACGGCCGAGATCCTCCACCGGGACGGCGACACCATACGGTTCCGCCTCACCATGCACCCGGACGAGAACGGCACCAGCTGGAGCTGGGTGTCCGAGCGCACCGCGGACCCGGCCACCCATACCGTCCGCTCCCGCCGCGTCGAGACGGGCCCCTTCGCATTCATGGACATCTTCTGGGAGTTCACCCCGGAGCCCGAAGGGGTGCGCATGCGCTGGGTCCAGGAGTTCCACATGTCGCCCCAGGCCCCCGCCGACGACGCCGCCATGACCGCGCACATCAACCGCAACACCAGGATCCAGATGGCGCTGATCCGCGACCGGATCGAGGCCCGCGCCCGCGCGGCGGCCTCCTGAGCCGGCCCTGTCCCGACCACCGCACCACCACACCGAGGAGATTCCCATGGCCACGACCTTGATCGTCGCCCGGCTGAAGCCCGGCGACCACCACGCCGCGATCAGCAGCCTGTTCGCGGAGTCGGACGCCACCGAACTGCCCGACCTGGTGGGCGTCCAGGAGCGGCGGCTGCTGACCTTCCAGGACCTGTACTTCCACCTCGTCCGCACGGACGAGGCCCTCTCCAAGACCCTCACCCCGCAACACGACAATCCGCTGTTCCGGTCGATCAGCCAGGCGATGGACGAGTACGTCACCCCGTACGAGGGCGCCTGGGGCAGCGTCCAGGAGGCCTCGGCCCGGCAGTTCTACCACTGGAAGCGCGGCATCGGCCAGGTCCAGTCCTGACGGTTCGGAGGGAACACCGTGACACACTCAATGGACACGACAGACACAGGCGACCCCGGTACCTCCTACGACGTCGTTGTGATCGGCGGCGGCCCCGCCGGCTCGAGCACCGCGGCCCAGCTGGCCCGGGCCGGCCACCGGGTGCTGGTGCTGGAGCGGGAGAAGTTCCCCCGCTACCACATCGGCGAGTCCCTCATCCCCGGCTGCCTCGACCTGGTCAGGGACCTGGGCCTGTGGGACCGGCTGGAAGGCCTCGGCTTCACCAAGAAGTACGGCGGCACCCTGCTGTGGGGCGCCACCGAGGGCACCTGGGACTTCCGGTTCGCCGACGGCAGCGACTACGAGTACTCCTTCCAGGTGCGCCGCGCCGACTTCGACGCCCTGCTGCTCACCCGCGCCCGGGAGCTCGGCGCCCGGGTGGTCGAGGAGGCCACGGTCAAGGACGTGGAGTTCGACGGCGACCGCGCCACCGGCCTGGTCTACACCGTCAAGGGCTCGGACGAGCCCGTACGGGTCTCCTCCCGCTTCCTCGTCGACGCCTCCGGACAGCAGCGGCTCCTCGGCCGCCGGCTCGGGCTCGTCGACTGGCACGAGGACCTGCGCAATGTCGCGGTGTGGAGCTACTTCCAGGGCTGCGACTTCATCGAGGGCGAGAACCGGGCCGGCGACGTGGTCGTGGAGAACATGTGGCAGGAGGACCAGCCTCCCGGCTGGTTCTGGTTCATCCCGCTGCACGACGGCACGGTCAGCATCGGCTATGTCACCCGCACCGCTCTGCTGCAGCGCTCCGGTCTGACCCCGGACCAGCTGTTCGAACAGCAGCTGGCCGCCTCGGACGAGGTCAAGCGGCTCACCCGGAACGCCACCAGGACCAGCGCCTACCGCACCCTGCGCGACTGGAGCTATGAGTGCACCCGCTTCCATGGCCCCGGCTGGGCCGTGGTCGGCGACGCCGCGGCCTTTGTCGACCCGCTGTTCTCCACCGGCGTCACCCTGGCCATGCGCGGTGCGCGGGACCTGGCCCCCGCGGTCGACCAGGCGCTGCGCGACCCGGGCCAGGAGGCCGATCTGCTCAAGGCGTACGAGGACGGGTACCGCGAATTCCTCGGCCACGTCCTGACCTTCGTGCGCTTCTTCTACAACATCAAGATGCACAAGGAACAGTACTGGGAGGGCGCCCAGACCATCGTCGACCCGCAGAAGCTCCAGGCGCCGAAGATCGACTTCGCGGTCCTGCTGGCCGGCATGACCGGCATCCGGCCCACGCCCGAGATGCAGGCGGACGCCAGGGCCAAGACCAACGACATCCACTCCCGCTTCGCGACATGAAGACCGCCATGCCGGTGGAGGAGCTGCTGCCGGCCCTCGCGGCGATCGTCCTCGTCGCACGGGGCGTCCACGCCCTGGCCCGGCGCTGCCGCCAGCCGGCGGTCGTGGCCGAGCTGGCCGCGGGCATCCTCCTCGGCCTGGCGCTCACCGACGAGGCACAGGCCGAGATCCTCACCCGCCCGGTGCGCGAGGGGCTCACCGCGCTCGGCGGCCTCGGCCTGCTGCTGTTCCTCTTCGAGACGGGGTGCGGGGCCGATGGCGGCCCGGCGCCCCGGCACGGCCGGCGGGCACCGGCGACGGCCCGGCCGCGGCCCCCCAACCCTCACGAGAGGCGGAAACACTGTGACCGACACCGACTACACCCCCGAGCTGGCGACCGCGGCCCGGGTGAAGGAACTGGCGATGGGCCTGTGGGTCTCCGCCATGATGATGACGGCCGTTCAGCTGCGGATCCCCGACGAGATCGATGACAAGCCGGTCGAGGCGGGCGAGCTCGCCGCCCGGCTGGACCTGCACCCCGAGGCCCTCGCCCGGTTGCTGCGGGCGCTGGCCGCGCACGGCGTCTTCACGGAGGTGGCCGAGGACCGTTTCGGACACACCGAGCTCTCCCGGGTGCTCCGCGAGGACCACCCGAACAGCGTGCGCTACCAGGTGCTGTGGACCGTGGCCCCCTGGACCTGGCAGGCCTGGCCGCACCTGGGGGAGGCGGTGCGCACCGGCGAGCGGGTCTTCCCGCGCCTGTACGGCAAGGAGTTCTTCGCCTATCTCTCCCAGGACGCCCCGCAGTCCGCCGAGGTGTTCAACCGGGCCATGACCCAGTCCTCCGCCTTCACCTCGGCCATGGTCGCCGAGGCCCTGGACATGACCGGCGTACGCGTCGTGGTCGACGTCGGCGGCGG 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ACCGGTCAAGGTCGCTTTTCGCGTGCGCAGCGCCGCGAACAGCCGCGGGCCGAACCGTTCGCGGGCCCCTCACCCGCTCCGCCGGTACGCCGACGGAGCCGGGGAGGGGCCGCGGCCGAGGACCTGGCCGAG

表1：zunyimycins生物合成基因簇信息：

其中，3個骨架合成基因是abxP，abxK，abxS，5個后修飾基因是abxO、abxC、abxD、abxH、abxM，調控基因是abxA，抗性基因是abxR。

制備方法包括：

1、pET-32a質粒的提取實驗步驟

(1)取1～5mL過夜培養的大腸桿菌pET-32a菌液，12000rpm，離心2min，棄去上清；

(2)加入1mL去離子水，吹打混勻，12000rpm，離心2min，棄去上清；

(3)菌體沉淀加入適當溶液P1(已加RNase)，放置1-2min；

(4)加入等體積溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次，放置5min，使菌體充分裂解；

(5)再加入一定量溶液P3(P1:P2:P3＝5:5:7＝V:V:V)，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時將出現白色絮狀沉淀，12000rpm，4℃，離心10min，得到上清液；

(6)將步驟(5)收集的上清液轉移至吸附柱中，盡量不要吸出沉淀，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入300μL去蛋白液PE，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

(8)向吸附柱中加入500μL漂洗液WB，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，重復操作一次；

(9)將吸附柱放入收集管中，12000rpm，離心3min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液除去；

(10)將吸附柱置于1個滅菌的離心管中，50℃烘箱揮盡乙醇，向吸附膜中間部位滴加預熱的50-60℃的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到pET-32a質粒DNA，將質粒DNA收集到離心管中，紫外分光光度計測量濃度及質量。

溶液P1：葡萄糖使細胞懸浮，EDTA可以與Ca²⁺和Mg²⁺蟄和抑制DNase的活性，RNase A降解RNA，避免RNA污染。

溶液P2：NaOH和SDS裂解細菌，變性蛋白質和少量質粒。

溶液P3：中和NaOH，是蛋白質與細菌基因組DNA一起被共沉淀，質粒DNA復性。

去蛋白液PE：去除核酸酶，便于質粒長久保存。

漂洗液WB：去除有機相及無機鹽殘留。

2、pET-32a質粒酶切

(1)在PCR管中配制下列10μL酶切體系：

表2：10μL質粒酶切體系

(2)低速離心，混勻反應體系，將反應管置于37℃恒溫培養箱中，酶切反應3h，得到酶切線性表達載體pET-32a；(質粒DNA是環狀的，限制酶酶切之后變為線性的，才能連接插入的目的基因)

(3)酶切反應產物的檢測：取5μL酶切產物，與DNA上樣緩沖液混勻，點樣，同時取5μL適當的DNA分子量標準于樣品相鄰孔中點樣，瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀照相，根據分子量標準判斷擴增產物大小和大致濃度。

3、合成基因的質粒提取實驗步驟

(1)取1～5mL過夜培養的鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2zunyimycins系列鹵化二型聚酮生物合成基因簇的菌液，12000rpm，離心2min，棄去上清；

(2)加入1mL去離子水，吹打混勻，12000rpm，離心2min，棄去上清；

(3)菌體沉淀加入適當溶液P1(已加RNase)，放置1-2min；

(4)加入等體積溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次，放置5min，使菌體充分裂解；

(5)再加入一定量溶液P3(P1:P2:P3＝5:5:7＝V:V:V)，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時將出現白色絮狀沉淀，12000rpm，4℃，離心10min，得到上清液；

(6)將步驟(5)收集的上清液轉移至吸附柱中，盡量不要吸出沉淀，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入300μL去蛋白液PE，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

(8)向吸附柱中加入500μL漂洗液WB，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，重復操作一次；

(9)將吸附柱放入收集管中，12000rpm，離心3min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液除去；

(10)將吸附柱置于1個滅菌的離心管中，50℃烘箱揮盡乙醇，向吸附膜中間部位滴加預熱的50-60℃的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到合成基因的質粒DNA，將質粒DNA收集到離心管中，紫外分光光度計測量濃度及質量。

溶液P1：葡萄糖使細胞懸浮，EDTA可以與Ca²⁺和Mg²⁺蟄和抑制DNase的活性，RNase A降解RNA，避免RNA污染。

溶液P2：NaOH和SDS裂解細菌，變性蛋白質和少量質粒。

溶液P3：中和NaOH，是蛋白質與細菌基因組DNA一起被共沉淀，質粒DNA復性。

去蛋白液PE：去除核酸酶，便于質粒長久保存。

漂洗液WB：去除有機相及無機鹽殘留。

4、合成基因的質粒酶切

(1)在PCR管中配制下列10μL酶切體系：

表3：10μL質粒酶切體系

(2)低速離心，混勻反應體系，將反應管置于37℃恒溫培養箱中，酶切反應3h，得到合成基因酶切產物；

(3)酶切反應產物的檢測：取5μL合成基因酶切產物，與DNA上樣緩沖液混勻，點樣，同時取5μL適當的DNA分子量標準于樣品相鄰孔中點樣，瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀照相，根據分子量標準判斷擴增產物大小和大致濃度。

5、酶切合成基因產物瓊脂糖凝膠回收

(1)電泳結束后在紫外燈下用干凈刀片切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，盡量快速切膠，輕輕用紙巾吸凈凝膠表面的液體，在無污染的干凈薄膜手套上切碎凝膠；

(2)凝膠碎塊轉移至一個稱量過的干凈的1.5mL離心管中，再次稱量后計算出凝膠的重量，加入3倍凝膠體積的溶液bufferDE-A(紅色)，混合均勻后于75℃加熱，加熱過程中可間斷的上下顛倒混勻，直至凝膠塊完全熔化(約6-8min)；

(3)加入1/2bufferDE-A體積的bufferDE-B(溶液變為黃色)，充分混勻；

(4)用移液器將混合溶液加入DNA制備管中，12000rpm離心30s，棄液體；

(5)將DNA制備管放回2mL離心管中，加入500μLbufferW1，12000rpm離心30s，棄液體；

(6)將DNA制備管放回2mL離心管中，加入700μLbufferW2，12000rpm離心30s，棄液體，該步驟重復一次；

(7)將制備管放回2mL離心管中，12000rpm離心3min；

(8)將制備管放于干凈的1.5mL離心管中，在制備膜中央加入50℃預熱的25-30μLEB洗脫緩沖液，室溫靜置2min，12000rpm離心3min，洗脫DNA；

(9)管底溶液即為所需的酶切合成基因，紫外分光光度計測DNA濃度及質量，將DNA可長期保存于-20℃。

6、目的片段連接

(1)10μL連接反應體系

表4：連接體系

(2)上述混合液短暫離心，然后于16℃室溫連接4～6h得到連接產物；

(3)連接產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4℃冰箱備用。

7、連接產物轉化克隆菌株JM109實驗步驟：

(1)在-80℃冰箱中取出克隆菌株JM109，立即放置于冰上；

(2)在100μL克隆菌株JM109中加入1μL連接產物，靜置于冰上冰浴30min，這個過程中不要動搖離心管；

(3)將離心管置于42℃金屬浴中準確放置90s；

(4)快速將離心管轉移到冰浴中冷卻2～3min，這個過程中不要搖動離心管；

(5)在離心管中加入600μLLB培養基，放置于37℃，200rpm搖床上培養45-60min；

(6)LB固體培養基加熱融化、冷卻到50℃左右(不燙手)，加入終濃度為100ng/mL氨芐青霉素輕輕搖勻，于超凈臺中倒平板備用；

(7)將復蘇好的細胞取出，4000rpm，離心3min，超凈臺中棄上清，將沉淀用槍吹勻、涂布棒鋪平板，每個反應鋪兩個平板，靜置于37℃培養箱培養14-16h，酶切鑒定PCR鑒定測序后得到質粒表達載體pET-abx。

8、質粒表達載體pET-abx轉化表達感受態細胞實驗步驟：

(1)在-80℃冰箱中取出表達菌株BL21(DE3)Rosetta，立即放置于冰上；

(2)在100μL表達菌株BL21(DE3)Rosetta中加入1μL質粒表達載體pET-abx，靜置于冰上冰浴30min，這個過程中不要動搖離心管；

(3)將離心管置于42℃金屬浴中準確放置90s；

(4)快速將離心管轉移到冰浴中冷卻2～3min，這個過程中不要搖動離心管；

(5)在離心管中加入600μLLB培養基，放置于37℃，200rpm搖床上培養45-60min；

(6)LB固體培養基加熱融化、冷卻到50℃左右(不燙手)，加入終濃度為100ng/mL氨芐青霉素輕輕搖勻，于超凈臺中倒平板備用；

(7)將復蘇好的細胞取出，4000rpm，離心3min，超凈臺中棄上清，將沉淀用槍吹勻、涂布棒鋪平板，每個反應鋪兩個平板，靜置于37℃培養箱培養14-16h，酶切鑒定PCR鑒定測序后得到陽性克隆菌。

9、陽性克隆菌誘導合成

(1)陽性克隆菌50μL，接種于4個5mL含終濃度為100ng/μL氨芐青霉素的LB液體培養基中；

(2)37℃恒溫搖床培養，220rpm，培養至OD₆₀₀＝0.3-0.5；

(3)加入終濃度為1.0mM/L的IPTG，分別置于18℃、28℃和37℃誘導培養12h，6h，3h，同時1管不加IPTG作為空白對照。

10、誘導合成產物HPLC檢測

大量誘導合成蛋白的菌株，及其他陰性對照菌株和空白對照菌株，HPLC檢測分析萃取產物。

10.1、發酵產物預處理

等體積乙酸乙酯萃取5h，收集有機相溶劑，37℃旋轉蒸發儀濃縮樣品，得到的浸膏采用甲醇溶解，12000rpm，離心10min，0.2μm微孔濾膜過濾，取200μL上清至樣品瓶中。

10.2、樣品HPLC分析

島津LC-20AHPLC分析條件如表5所示：

表5：島津LC-20AHPLC分析條件

柱系統：

色譜柱：wondaSilC18-WR(5um,1.6×160nm)

進樣體積：50μL

柱溫箱：30℃

洗脫方式：梯度洗脫

分析液相結果，通過陽性及陰性對照，確定目標產物并進行MS分析。

11、產物純化、結構解析

對目標產物進行富集，純化制備出單體化合物，采用多種色譜手段、結晶和高效液相等方法分離純化化合物，利用一維二維譜學信息等解析方法確定化合物的立體構型，最終鑒定得到單體化合物的結構。

11.1、產物純化

誘導產物乙酸乙酯萃取濃縮得浸膏，采用半制備安捷倫Agilent液相純化制備目標化合物。

HPLC分析條件如下：

表6：安捷倫HPLC分析條件

柱系統：

色譜柱：Agilent-C18(5um,9.4×250mm)

進樣體積：100μL

柱溫箱：30℃

洗脫方式：梯度洗脫

11.2產物結構解析

目標產物純度達到95％以上，利用一維核磁共振(1D-NMR)和高分辨質譜技術等確定化合物的平面結構，利用二維核磁共振(2D-NMR)，二維HMBC譜，二維HSQC譜，二維ROESY譜，二維COSY譜解析方法確定化合物的立體構型，得到圖1～圖7，其中圖1為2-n-庚基-4-羥基喹啉質譜分析圖，圖2為2-n-庚基-4-羥基喹啉氫譜分析圖，圖3為2-n-庚基-4-羥基喹啉碳譜分析圖，圖4為2-n-庚基-4-羥基喹啉HMBC譜圖分析圖，圖5為2-n-庚基-4-羥基喹啉HSQC譜圖分析圖，圖6為2-n-庚基-4-羥基喹啉ROESY譜圖分析圖，圖7為2-n-庚基-4-羥基喹啉COSY譜圖分析圖，最終鑒定得到2-n-庚基-4-羥基喹啉結構的結構。

2-n-庚基-4-羥基喹啉結構

白色粉末，m.p.364～408℃，

ESI-MSm/z:244[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,MeOH)δ_H:12.32(1H,brs,OH-4),8.35(1H,t,J＝7.6Hz,H-5),7.58(1H,t,J＝6.8Hz,H-6,H-8),7.32(1H,t,J＝7.6Hz,H-7),6.24(1H,brs,H-3),2.68(2H,brs,H-1′)(1.694H,d,J＝6.4Hz,H-2′,H-6′),1.23(6H,m,H-3′,H-4′,H-5′),0.80(3H,t,J＝7.2Hz,H-7′)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ_C:179.1(C-4),155.5(C-2),140.9(C-8a),132.0(C-5),125.5(C-6),125.2(C-4a),123.8(C-7),118.8(C-8),108.3(C-3),34.6(C-1′),31.8(C-5′), 29.4(C-2′),29.3(C-3′),29.2(C-4′),22.8(C-6′),14.2(C-7′)。

以上所述的僅是本發明的實施例，方案中公知的具體結構及特性等常識在此未作過多描述。應當指出，對于本領域的技術人員來說，在不脫離本發明結構的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發明的保護范圍，這些都不會影響本發明實施的效果和專利的實用性。本申請要求的保護范圍應當以其權利要求的內容為準，說明書中的具體實施方式等記載可以用于解釋權利要求的內容。