一種用于快速檢測Ⅰ型糖尿病的融合蛋白的制作方法

本發明涉及一種用于快速檢測I型糖尿病的融合蛋白，特別是ICA69和GAD2融合表達的ICA-GAD融合蛋白技術領域。

背景技術：

目前，隨著人們生活水平的提高，使人們糖攝入量高，加上運動量少，導致部分人因過度肥胖誘發糖尿病。

糖尿病是一種常見的以高血糖為特征的內分泌代謝疾病，是由于胰島素分泌缺陷或其生物性能受損而導致的血糖過高，出現糖尿，進而引起脂肪和蛋白質代謝紊亂，導致各組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經性的慢性損害、功能障礙。糖尿病分為四種類型，即I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊類型糖尿病。

在I型糖尿病的免疫破壞期間，患者體內會自動產生針對于胰島細胞自身抗原的抗體。目前已經發現多種胰島素自身抗體，如：胰島細胞抗體(ICA)、胰島細胞表面抗體(ICSA)、胰島素抗體(IAA)、熱休克蛋白抗體(HSP)、谷氨酸脫羧酶65抗體(GAD65，哺乳動物中GAD的存在形式之一)、蛋白質酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)等。臨床上在診斷I型糖尿病常用的指標包括ICA、IAA、GAD、IA-2A等。

目前只能對于I型糖尿病病人中ICA、IAA、GAD、IA-2A等多個自身抗體進行單一測定，步驟繁多且花費較高，效率低，特異性不足，時間長等缺點。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是針對現有現狀，提供一種用于快速檢測I型糖尿病的ICA-GAD融合蛋白，這種方法可以一次性檢測出抗ICA69和GAD2任意一種或兩種抗體。這種方法方便、簡捷、高效，降低醫療成本和檢測時長。

本發明是通過以下技術方案實現的，具體包括以下步驟：

(1)合成目的基因(ICA-GAD)，將目的基因插入蛋白表達載體pet28a中，然后轉化到BL21(DE3)宿主菌中，加入IPTG進行目標蛋白的誘導表達；

(2)用Ni柱和透析袋純化分離出表達蛋白；

(3)對ICA-GAD融合蛋白的活性進行檢測。

所述的步驟(1)所述的目標蛋白為ICA69基因和GAD2基因通過融合表達獲得的蛋白質，其特征在于其氨基酸序列：SEQ ID NO：4。

所述的步驟(1)所述目的基因的合成是選自ICA69和GAD2的基因序列直接進行合成的：SEQ ID NO：3 所示。

所述的步驟(1)所述的蛋白表達宿主是BL21(DE3)。

所述的步驟(3)中所述的融合蛋白活性的檢測包括抗原的包被、加樣、加酶標抗體、加底物液顯色、終止反應、結果判定。抗原的包被：用0.05M PH9，碳酸鹽包被緩沖液將融和蛋白ICA-GAD稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘；加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml，37℃孵育0.5～1小時，洗滌。加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB(四甲基聯苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色劑，于410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

附圖說明

圖1.載體構建

圖1中A部分為PET-28a載體圖，其中BamH I和Xho I為酶切位點；B部分為ICA-GAD目標基因圖，其中BamH I和Xho I為酶切位點；C部分為插入ICA-GAD目標基因之后的載體圖。

具體實施方式

實施例一：基因的融合與表達

(1)目的DNA序列進行人工合成。

(2)目標基因的PCR擴增：為確保得到兩者融和表達，利用Primer5.0根據目標基因序列設計特異性擴增引物，引物設計以BamH I和Xho I為酶切位點。引物序列為：

cgggatccat ggcatctccg ggctctggct tttggtct SEQ ID NO：1

ccctcgagtc atgcattgag caattcgtgg ttc SEQ ID NO：2

用高保真DNA擴增系統以合成的DNA序列為模板進行PCR循環獲得產物。

(3)擴增后，按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對目的基因片段進行回收。將目的基因插入載體中：cDNA產物與載體進行連接，轉化到PET-28a載體中，根據重組載體的標志(抗Kan或藍白斑)作篩選，挑取單斑，進行菌液PCR和雙酶切并測序進行陽性驗證。將此重組質粒DNA轉化到表達宿主菌的感受態細胞BL21(DE3)并涂布于LB培養基平板上。

(4)蛋白表達：挑選含重組質粒的菌體單斑至LB(Kan 100ug/ml)液體培養基中37℃過夜培養。按1∶50比例稀釋過夜菌，，37℃振蕩培養至OD600值在0.4-1.0(最好0.6，大約3小時)。取部分菌液作為誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續37℃振蕩培養3小時。

實施例二：蛋白純化

誘導的含有目的蛋白的細菌被離心收集，超聲破菌，離心收集上清。為了提高目的蛋白的純化純度，我們對傳統的純化his融合蛋白的方法進行了相關的改進，在誘導表達后的大腸桿菌上清中加入β-巰基乙醇(使終濃度為5mM)。然后利用含有300mMNacl，20mM Tris-Hcl和40mM的咪唑緩沖液把目的蛋白結合到HIS Trap FF親和柱子上，然后用含有300mM Nacl，20mMTris-Hcl和500mM的咪唑緩沖液把目的蛋白洗脫下來。在PBS緩沖液中4℃透析過夜，BCA法測定蛋白濃度為1mg/ml。

實施例三：利用Elisa檢測來測定免疫活性。

1.包被：用0.05M PH9，碳酸鹽包被緩沖液將融和蛋白ICA-GAD稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。

2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml，37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4.加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB(四甲基聯苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5.終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色劑，于410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

ELISA 試劑盒檢測結果

G.實施效果：本發明提高了I型糖尿病的檢出率，在所測的樣品中，每個樣品只要有抗ICA69和GAD2抗體中的一種或兩種存在，顯著提高I型糖尿病的診斷效率，可用于制作檢測I型糖尿病試劑盒。