一種巨大芽孢桿菌D122及其菌劑和菌劑制備方法與流程

本發明涉及微生物菌劑
技術領域：
，具體涉及一種巨大芽孢桿菌D122及其菌劑和菌劑制備方法。
背景技術：
：農業生產長期依賴化學肥料，不僅大量浪費不可再生資源，還導致土質變差、農產品品質下降和環境污染等問題，極大影響了人類的健康生存。巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）是一種解磷促鉀固氮細菌，能夠很好的降解土壤中不能被植物利用的磷、鉀，提高土壤肥力，同時固定空氣中的氮氣，促進作物增產。但是，我國微生物肥料行業生產的產品表現出很多問題，例如有效活菌數低，雜菌率較高，有效期不長等，嚴重影響了農民使用的積極性和市場的開拓。國內對巨大芽孢桿菌在微生物肥料上的研究主要集中在菌株選育、解磷效果、發酵條件優化及與解鉀菌相互作用等方面，而對巨大芽孢桿菌菌劑保護劑的研究卻不多見。技術實現要素：本發明的目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種巨大芽孢桿菌D122，其具有固氮酶活性和分泌生長素吲哚乙酸的功能。本發明的另一目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種巨大芽孢桿菌D122菌劑，具有較高的固氮酶活性且能分泌生長素，農業應用范圍廣，經濟效益高。本發明的另一目的是針對現有技術中的上述不足，提供一種巨大芽孢桿菌D122菌劑制備方法，工藝簡單成熟，可規模化生產。本發明的目的通過以下技術方案實現。一種巨大芽孢桿菌D122，所述巨大芽孢桿菌D122BacillusmegateriumD122保藏于中國典型培養物保藏中心(ChinaCenterforTypeCollection)，地址為中國武漢大學，分類命名為巨大芽孢桿菌D122BacillusmegateriumD122，保藏日期為2015年12月15日，保藏編號為CCTCCNO:M2015751。所述巨大芽孢桿菌D122具有序列表NO.1的DNA序列。所述巨大芽孢桿菌D122的固氮酶活性為500-600nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量為100-200mg/L。固氮酶活性測定1、試驗方法采用乙炔還原法對各菌株的固氮酶活性進行測定。將保存的各菌株用VM-Ethanol固體培養基活化，用接種環挑取1環菌體于1.5mL的無菌離心管中，用無菌水稀釋，按相同接種量接入裝有5mL半固體培養基的10mL試管中，用反口橡膠塞密封。37℃培養24h后，注入1/10體積的10%乙炔氣體，繼續培養24h，從試管中抽取0.5mL氣體注入氣相色譜儀(北京天普分析儀器廠SP-2100)中，測定乙炔、乙烯的含量。按下列公式計算固氮酶活性大小（北京農業大學微生物專業編，1986）：C=(hx×c×V)/(24.9×hs×t)(2.1)其中，hx為樣品峰面積值；hs為標準C2H4峰面積值；c為標準C2H4濃度(nmol/mL)；V為培養容器體積(mL)；t為樣品培養時間(h)；C為產生的C2H4濃度[nmol/(mL·h)]。2、試驗結果結合公式(2.1)和固氮酶活性測定圖4得知，固氮酶活性為500-600nmol/(mL·h)。由此可以說明，巨大芽孢桿菌D122在代謝過程中可以產生特定的固氮酶，可以自生固定大氣中的氮氣。生長素定性含量測定（1）挑取菌株分別接種（OD600=1.0，0.5mL菌懸液）到盛有50mLKing液體培養基的250mL三角瓶中，每組3個重復。（2）接種完畢后，將三角瓶置于搖床上，28℃，125rpm，培養3d，待測。（3）將上述在King液體培養基上生長3d的菌懸液50μL置于透明離心管中，同時加50μL比色液。（4）設陽性對照和陰性對照，陽性對照中加入50μL濃度為10mg/L的植物生長激素（IAA），同時加50μL比色液。陰性對照中加50μLKing液體培養基，同時加50μL比色液。（5）將陽性對照液、陰形對照液和測定液置于白陶瓷板并置于室溫下15min，觀察其顏色變化，顏色變紅者為陽性，表示能夠分泌IAA，且顏色越深表示分泌IAA的能力越強；若不變色則為陰性，表示該菌株不能分泌IAA，由此作為判斷依據進行判斷分析。培養基及試劑配方為：King培養基(1L)：蛋白胨20g，K2HPO41.725g，MgSO4·7H2O1.5g，丙三醇15mL，色氨酸0.1g，蒸餾水1000mL。生長素定量測定參照Riberio等的方法略加改動。菌株D122接種到含有1g/L色氨酸的LB液體培養基中，30℃，180r/min，振蕩培養48h。將培養液10000r/min離心5min，取100mL上清液加到96孔板中，與100mLSalkowski’s試劑（1mL0.5mol/LFeCl3和49mL35%高氯酸）混勻，室溫靜置30min，在波長530nm下用酶標儀測定吸光度。用不同濃度的IAA標準品制作標準曲線，測定結果見表1。表1菌株D122IAA測定結果菌株D141D52D87D122IAA濃度（mg/L）485.68364.20294.16158.36從表1和圖5可以看出，巨大芽孢桿菌D122的生長素濃度為158.36mg/L，因此，可以判斷巨大草芽孢桿菌D122在生長代謝過程中可以產生IAA，具有促進作物生長的功能。一種巨大芽孢桿菌D122的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有巨大芽孢桿菌D122的固氮菌菌落的土樣，經分離篩選培養基培養得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進行劃線純化，培養分離得到巨大芽孢桿菌D122單菌落，保存該單菌落備用；巨大芽孢桿菌D122單菌落如圖1所示。具體地，在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的菌落進行劃線純化，30℃恒溫培養36-48小時分離得到巨大芽孢桿菌D122單菌落，將平板上出現的單菌落保存在試管中，30℃恒溫培養36-48小時，置于2-5℃冰箱中保存，優選地置于4℃冰箱中保存。（3）培養基培養將活化好的巨大芽孢桿菌D122斜面接種于滅菌的液體培養基中，振蕩培養，得到微生物液體發酵液；（4）D122菌劑制備以氯化鈉、乙酸鈉和水的的混合液作為液體保護劑，加入到已培養好的液體發酵液中混勻，放置24h測定初始菌數為2.0-4.0億/mL，得到巨大芽孢桿菌D122液體菌劑。液體保護劑的篩選實驗在實驗基礎上，選擇蔗糖、氯化鈉、糖蜜、乙酸鈉作為液體保護劑的篩選對象。按一定比例加入到已培養好的液體發酵液中混勻，調水分，放置24h測定初始菌數。陰涼處放置30d，再次測定活菌數，以未添加保護劑的處理為對照(CK)。設7個處理，每處理3次重復，見表2。表2保護劑的篩選(單位:占發酵液體積比/%)蔗糖氯化鈉糖蜜乙酸鈉處理1107處理2103處理3101.5處理473處理571.5處理631.5CK0000添加保護劑對微生物菌劑有效活菌數及保存期的影響：將選定的保護劑按一定比例加入到已制備的菌劑D122中，密封室溫保存。放置24h測定初始菌數，每隔1-2個月測活菌數，同時以未加保護劑的處理為對照(CK)。菌劑保護劑篩選結果：根據添加不同的保護劑對微生物菌劑有效活菌數及保存期的影響結果，確定最佳菌劑保護劑配方為7%氯化鈉+1.5%乙酸鈉。所述步驟（4）中氯化鈉的質量濃度為6-8%，乙酸鈉的質量濃度為1-2%。所述步驟（1）分離、篩選的具體方法為：選取土樣，加入含吐溫80的無菌水，震蕩，靜置，取上清液離心，棄上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的無菌水懸浮，離心，去沉淀，將上清液離心，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液；取上述樣品液與磷酸緩沖液懸浮混合，得到稀釋菌懸液；將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取涂布于無氮培養基，培養獲得固氮菌菌落。更具體地，分離、篩選的方法為：從廣東省東莞市常平鎮黃泥塘農場采取500g土樣，加入3L含0.01%吐溫80的無菌水，震蕩10min，靜置半個小時，取上清液于20℃下4820rpm離心20min。棄上清液，保留沉淀物，加入30-50mL含0.01%吐溫80的無菌水懸浮，液體于20℃下5000rpm離心5s，去沉淀，將上清液倒入一個干無菌離心管中于20℃下6000rpm離心10min，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用10mL的pH7.0磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液；取1mL上述樣品液與9mL磷酸緩沖液懸浮混合，即為10倍稀釋菌懸液。將稀釋的菌懸液置于75℃水浴加熱15min，自然冷卻后吸取100μL涂布于無氮培養基，30℃培養36-48小時獲得含巨大芽孢桿菌D122菌的固氮菌菌落。所述步驟（1）中，分離篩選培養基由以下質量的原料制成：CaCO31.0-1.4g，MgSO4·7H2O0.6-1.2g，K2HPO41.0-2.0g，NaCl0.1-0.4g，FeSO4·7H2O0.001-0.005g，NaMO4·2H2O0.05-0.1g，蔗糖5-10g，瓊脂18-20g，蒸餾水1000ml，該分離篩選培養基的pH為7.1-7.4。本發明的分離篩選培養基屬于改良無氮培養基。所述純化保存的具體方法為：在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的菌落進行劃線純化，30℃恒溫培養36-48小時分離得到枯草芽孢桿菌D122單菌落。將平板上出現的單菌落保存在試管中，30℃恒溫培養36-48小時，置于4℃冰箱中保存。巨大芽孢桿菌D122保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號碼為：CCTCCM2015751。（2）純化保存培養基的配方為：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，純化保存培養基的pH為7.0-7.4。所述步驟（3）培養基培養中，培養基由以下質量的原料制成：CaCO31.0-1.4g，MgSO4·7H2O0.6-1.2g，K2HPO41.0-2.0g，NaCl0.1-0.4g，FeSO4·7H2O0.001-0.005g，NaMO4·2H2O0.05-0.1g，蔗糖5-10g，瓊脂18-20g，蒸餾水1000ml，培養基的pH為7.1-7.4。所述步驟（2）和步驟（3）之間還包括有以下步驟：（S1）革蘭氏染色：將純化后的單菌落進行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌；（S2）芽孢染色：將陽性菌進行芽孢染色，篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽性菌單菌落。芽孢染色及其革蘭氏染色革蘭氏染色和芽孢染色是兩種細菌鑒定的常規方法，染色可以縮小鑒定范圍。未經染色的細菌與周圍環境折光率差別甚小，在顯微鏡下極難觀察。革蘭氏染色后細菌與環境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些菌種屬于革蘭氏陽性（G+）或者革蘭氏陰性菌（G-），用以分類鑒定。革蘭氏陰性菌普遍存在安全隱患，在農業微生物應用過程中直接高溫滅菌后舍棄結構特征。芽孢染色將菌體內的芽孢進行染色，可以直觀觀察芽孢的大小、位置、形狀等特點，進一步縮小其鑒定范圍。芽孢桿菌具有保質期長，易于存放的特點，在農業微生物產品具有廣泛的應用基礎。1、革蘭氏染色（1）涂片：在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落于水滴中，用灼燒過的接種環涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來回過3次，以固定細胞。（2）初染：滴加2-5滴草酸銨結晶紫染液，染1min，傾去染液，流水沖洗至無紫色。（3）媒染：先用新配的碘液（碘1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300.0mL）沖去殘水，再用碘液覆蓋涂面1min，后水洗。（4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15－20秒后，立即用流水沖洗。（5）復染：滴加1滴番紅染色液，染3－5min，水洗后用吸水紙吸干。（6）鏡檢：將載玻片置于光學顯微鏡下觀察染色結果。2、芽孢染色在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落水滴中，用灼燒過的接種環涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來回過3次，以固定細胞。在涂布菌體的區域滴加1-2滴石碳酸堿性復紅染液，染色3min。用蒸餾水沖洗掉染液，風干后，將載玻片置于光學顯微鏡下觀察。如圖2和圖3所示，通過革蘭氏染色和芽孢染色結果可以看出，巨大芽孢桿菌D122為革蘭氏陽性菌，桿狀，含有芽孢。一種巨大芽孢桿菌D122的菌劑，由所述的一種巨大芽孢桿菌D122的菌劑制備方法制備而成。本發明的有益效果：（1）本發明以巨大芽孢桿菌D122為出發菌株，對其固氮酶活性以及分泌生長素能力進行測定，發現菌株D122具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。所述巨大芽孢桿菌D122的固氮酶活性為500-600nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量為100-200mg/L。（2）為了提高巨大芽孢桿菌D122菌劑的芽孢存活率，本發明加入了特定保護劑，降低芽孢在加工及儲藏過程中的死亡率，有效地降低產品的成本，提高經濟效益，為以后微生物肥料的生產提供指導。（3）本發明所涉及巨大芽孢桿菌D122菌劑制備方法中添加一定比例的保護劑，能使菌種存活率維持在較高的水平，能夠有效延長微生物肥料產品的貯存穩定性及產品的貨架壽命。附圖說明利用附圖對發明作進一步說明，但附圖中的實施例不構成對本發明的任何限制，對于本領域的普通技術人員，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據以下附圖獲得其它的附圖。圖1為分離得到的巨大芽孢桿菌D122單菌落在顯微鏡下放大10×100倍的菌落圖。圖2為巨大芽孢桿菌D122革蘭氏染色結果圖。圖3為巨大芽孢桿菌D122芽孢染色結果圖。圖4為巨大芽孢桿菌D122固氮酶活性測定結果圖。圖5為巨大芽孢桿菌D122IAA比色效果圖。具體實施方式結合以下實施例對本發明作進一步描述。實施例1本實施例的一種巨大芽孢桿菌D122，所述巨大芽孢桿菌D122保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCM2015751。所述巨大芽孢桿菌D122具有序列表NO.1的DNA序列。所述巨大芽孢桿菌D122的固氮酶活性為500nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量為100mg/L。一種巨大芽孢桿菌D122的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有巨大芽孢桿菌D122的固氮菌菌落的土樣，經分離篩選培養基培養得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進行純化，培養分離得到巨大芽孢桿菌D122單菌落，保存該單菌落備用；（3）培養基培養將活化好的巨大芽孢桿菌D122斜面接種于滅菌的液體培養基中，振蕩培養，得到微生物液體發酵液；（4）D122菌劑制備以氯化鈉、乙酸鈉和水的混合液作為液體保護劑，按一定比例加入到已培養好的液體發酵液中混勻，放置，測定初始菌數為2.0億/mL，得到巨大芽孢桿菌D122菌劑。所述步驟（4）中氯化鈉的質量濃度為6%，乙酸鈉的質量濃度為1%。所述步驟（1）分離、篩選的具體方法為：選取土樣，加入含吐溫80的無菌水，震蕩，靜置，取上清液離心，棄上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的無菌水懸浮，離心，去沉淀，將上清液離心，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液；取上述樣品液與磷酸緩沖液懸浮混合，得到稀釋菌懸液；將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取涂布于無氮培養基，培養獲得固氮菌菌落。所述步驟（1）中，分離篩選培養基由以下質量的原料制成：CaCO31.0g，MgSO4·7H2O0.6g，K2HPO41.0g，NaCl0.1g，FeSO4·7H2O0.001g，NaMO4·2H2O0.05g，蔗糖5g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，分離篩選培養基的pH為7.1。一種巨大芽孢桿菌D122的菌劑，由所述的一種巨大芽孢桿菌D122的菌劑制備方法制備而成。實施例2本實施例與實施例1的不同之處在于，本實施例的所述步驟（2）和步驟（3）之間還包括有以下步驟：（S1）革蘭氏染色：將純化后的單菌落進行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌；（S2）芽孢染色：將陽性菌進行芽孢染色，篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽性菌單菌落。具體地，革蘭氏染色方法為：（1）涂片：在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落于水滴中，用灼燒過的接種環涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來回過3次，以固定細胞。（2）初染：滴加2-5滴草酸銨結晶紫染液，染1min，傾去染液，流水沖洗至無紫色。（3）媒染：先用新配的碘液（碘1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300.0mL）沖去殘水，再用碘液覆蓋涂面1min，后水洗。（4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15-20秒后，立即用流水沖洗。（5）復染：滴加1滴番紅染色液，染3-5min，水洗后用吸水紙吸干。（6）鏡檢：將載玻片置于光學顯微鏡下觀察染色結果。具體地，芽孢染色方法為：在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落水滴中，用灼燒過的接種環涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來回過3次，以固定細胞。在涂布菌體的區域滴加1-2滴石碳酸堿性復紅染液，染色3min。本實施例的其余內容與實施例1相同，這里不再贅述。實施例3本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述巨大芽孢桿菌D122的固氮酶活性為520nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量為120mg/L。所述巨大芽孢桿菌D122菌劑，測定初始菌數為2.5億/mL。所述步驟（4）中氯化鈉的質量濃度為6.5%，乙酸鈉的質量濃度為1.5%。所述步驟（1）中，分離篩選培養基由以下質量的原料制成：CaCO31.2g，MgSO4·7H2O0.8g，K2HPO41.5g，NaCl0.2g，FeSO4·7H2O0.002g，NaMO4·2H2O0.06g，蔗糖6g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，分離篩選培養基的pH為7.2。本實施例的其余內容與實施例1或2相同，這里不再贅述。實施例4本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述巨大芽孢桿菌D122的固氮酶活性為550nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量為150mg/L。所述巨大芽孢桿菌D122菌劑，測定初始菌數為3億/mL。所述步驟（4）中氯化鈉的質量濃度為7%，乙酸鈉的質量濃度為1.5%。所述步驟（1）中，分離篩選培養基由以下質量的原料制成：CaCO31.3g，MgSO4·7H2O1.0g，K2HPO41.8g，NaCl0.3g，FeSO4·7H2O0.004g，NaMO4·2H2O0.09g，蔗糖8g，瓊脂19g，蒸餾水1000ml，分離篩選培養基的pH為7.3。本實施例的其余內容與實施例1或2相同，這里不再贅述。實施例5本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述巨大芽孢桿菌D122的固氮酶活性為580nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中可以產生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量為180mg/L。所述巨大芽孢桿菌D122菌劑，測定初始菌數為4.0億/mL。所述步驟（4）中氯化鈉的質量濃度為7.5%，乙酸鈉的質量濃度為1.5%。所述步驟（1）中，分離篩選培養基由以下質量的原料制成：CaCO31.4g，MgSO4·7H2O1.2g，K2HPO42.0g，NaCl0.4g，FeSO4·7H2O0.005g，NaMO4·2H2O0.1g，蔗糖10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，分離篩選培養基的pH為7.4。本實施例的其余內容與實施例1或2相同，這里不再贅述。本發明的巨大芽孢桿菌D122的16SrDNA序列菌種鑒定細菌的個體微小，形態簡單，傳統方法鑒定細菌常根據它們在生理生化上的不同反應作為分類鑒定的主要依據。20世紀70年代后期以來，國際上通用的“正式的”或“官方的”細菌分類方法是以《伯杰氏鑒定細菌學手冊》為依據。在生理生化鑒定中，通常會出現一個或者幾個生理指標不符合該菌種所具有的獨特性質，難以明確對該菌株進行鑒定。目前，細菌鑒定的方法通常將菌株的生理生化指標與分子生物學特性相結合，得出較為可靠地結論。其中DNA序列分析的16SrRNA基因進化發育系統已經成為目前國際上細菌多相分類鑒定常用的技術手段(Kimetal，2004；Prapetal，1997)。核糖體16SrDNA基因序列全長約1550bp，是由交替的保守區和可變區組成。利用保守區域設計的通用引物，可以擴增出所有細菌的16SrDNA片段。16SrDNA序列分析技術的基本原理是從微生物樣本中提取16SrDNA片段，通過克隆、測序或酶切、探針雜交獲得16SrDNA的序列信息，再與16SrDNA數據庫的序列數據或者其他數據進行比較，確定其在進化樹中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類。利用16SrDNA片段保守區域設計的通用引物，不會對非細菌的DNA互補，而細菌的16SrDNA可變區的差異可以用來區分不同的菌。因此通過對某菌株16SrDNA序列測定來獲得最終鑒定證明的做法是被普遍認可的。1、方法：（1）PCR反應體系(25μL)：10×PCRBuffer2.5μLdNTP(2.5mM)m2.0μL引物27F（10μM）0.5μL引物1492R（10μM）0.5μLDNA模板100ngTaq酶(5U/μL)0.5μLddH2O19μL（2）PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35個循環，72℃延伸10min。使用ABI3730xlDNA分析儀(應用生物系統公司)進行DNA測序。2、測序結果tcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagtaactgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggagtaaccgtaag3、同源性分析鑒定本細菌為Bacillusmegaterium，巨大芽孢桿菌。本發明由廣東省引進創新創業團隊項目資助研發，制得的巨大芽孢桿菌D122及其菌劑具有廣闊的市場前景，經濟效益高。最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細地說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。<0001>SEQUENCELISTING<110>東莞市保得生物工程有限公司<120>一種巨大芽孢桿菌D122及其菌劑和菌劑制備方法<130>0<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1403<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)D122的16srDNA基因序列<400>1tcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacac60gtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggatag120gatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggc180ccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccga240cctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggca300gcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatg360aaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagtaactgctc420gtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaa480tacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttct540taagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaactt600gagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggag660gaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtg720gggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgt780tagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagta840cggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgt900ggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactcta960gagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagct1020cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgcca1080gcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga1140cgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaa1200agggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgta1260ggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcgg1320tgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacaccc1380gaagtcggtggagtaaccgtaag1403當前第1頁1 2 3