本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種規模化生產高純度烏司他丁的方法。
背景技術：
烏司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制劑(humanurinarytrypsininhibitor，H-UTI)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，表觀相對分子量為66-68kD，等電點為2-3。它是一種糖蛋白，含糖量高達20％-30％。由于結構中的兩個活性功能區均具有很廣的抑酶譜，所以能同時抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明質酸酶、彈性蛋白酶等多種水解酶的活性；而且，烏司他丁分解形成的低分子量成分也具有很強的抑制水解酶的作用。烏司他丁不僅是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，還具有抑制心肌抑制因子的產生、改善休克時的循環狀態、穩定溶酶體膜、抑制炎癥介質的釋放等功能。大量臨床試驗結果顯示，烏司他丁在治療急性胰腺炎、輔助治療休克、改善手術刺激引起的免疫功能下降、尤其是減少體外循環并發癥等方面有重要的作用，加上其本身來源于人體，無免疫原性，安全性高。但由于尿液中烏司他丁的含量較少，其分離及純化工藝成為制約其應用的關鍵因素。目前國內純化尿胰蛋白酶抑制劑的方法主要為氣泡提取法結合親和層析、離子交換法、親和層析法、分子篩層析、金屬螯合層析和疏水層析法等，以及尿胰蛋白抑制劑和尿激肽釋放酶聯產工藝。據檢索，國內已公開的專利申請文獻較少，比如：中國專利CN103073638B公開了一種親和層析純化烏司他丁的方法，該方法是以健康成年男性新鮮尿液為原料，經過甲殼質吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析、吸附柱層析以及親和層析等現代蛋白質高端生化分離技術來制備高純度的烏司他丁，可以將總收率提高到70％以上，比活力不低于5000IU/mg。中國專利申請CN2015108204251《一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復溶性的藥物組合物》和CN2014108077092《一種樹脂再生提高柱效烏司他丁的方法及含有烏司他丁的藥物組合物》均利用陰離子交換柱、親和層析柱及超濾相結合的方法對烏司他丁粗品進行純化的方法。申請人在之前的專利文獻CN2006100002002《純化的烏司他丁及其制備方法和含有該烏司他丁的藥物組合物》中采用陰離子交換柱、超濾和金屬螯合柱、疏水柱和凝膠柱結合對烏司他丁粗品進行純化。但上述方法均需要結合多步層析、工藝步驟復雜不易放大等問題；另外，多步層析使用的純化介質成本昂貴，不利于規模化工業生產。
技術實現要素：
本發明的目的是針對現有技術中存在的上述問題，提供一種規模化生產高純度烏司他丁的方法，在保證烏司他丁的純度和收率的同時，以減化其純化工藝，達到節約成本、減少時間和人力成本的目的。為了實現上述發明目的，本發明提供了一種規模化生產高純度烏司他丁的方法，其具體步驟如下：1)取澄清尿液，調節pH至6-6.5，以硅膠∶尿液＝8-12kg/t的比例加入硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調節濾液pH至4.5-6，以殼聚糖∶尿液＝8-12kg/t的比例加入殼聚糖，以重量比為海藻酸鹽∶殼聚糖＝1-5％的比例加入海藻酸鹽，攪拌，靜置，棄去上清液，得下層沉淀物1；2)向沉淀物1中加水沖洗，棄去上清液，加入硫酸銨緩沖溶液，調節pH至5-7，得混合液1，將混合液1超濾得截留液1，其中，截留液1的體積為混合液1體積的1/10-1/5；3)向截留液1中加入溶液A并調節pH至7-8，攪拌，得混合液2，將混合液2進行二級超濾，得截留液2，其中，溶液A為三乙胺和異丙醇的混合溶液，超濾的壓力為0.1-0.7MPa，溫度為4-30℃，截留分子量為3×104；4)向截留液2中加入其體積1.1-1.9倍體積濃度為95％的乙醇進行分級沉淀，過板框；向上清液中加其體積1.9-4倍相同濃度的乙醇，過板框，得沉淀物2；5)將沉淀物2干燥，即得純烏司他丁。其中，本申請中所用殼聚糖，為甲殼素經脫乙酰作用得到，根據脫乙酰基程度的不同，分為水溶性殼聚糖和非水溶性殼聚糖，優選地，為脫乙酰度為大于90％的殼聚糖，分子量為2萬-5萬。優選地，所述海藻酸鹽為海藻酸鈉或海藻酸鉀，進一步優選為分子量為2萬-5萬的海藻酸鈉。優選地，步驟2)中超濾的條件為：壓力為0.1-0.7MPa，溫度為4-30℃，截留分子量為5×104-7×104。優選地，本申請超濾所用的超濾膜為聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纖維素膜、醋酸纖維素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一種或至少兩種的復合膜；進一步優選為聚醚砜膜與醋酸纖維素膜的復合膜；優選地，超濾膜的結構為中空纖維式、平板式、管式和卷式中的一種；進一步優選為管式。優選地，步驟3)中三乙胺和異丙醇的體積比為1∶(0.1-0.5)。優選地，步驟5)中所述的干燥為板框干燥。優選地，本申請中調節pH所用的溶液為鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、枸椽酸、酒石酸、氫氧化鈉、氨水、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉和乙醇鈉溶液中的一種或任意組合；進一步優選為鹽酸、磷酸、乙酸、氨水和氫氧化鈉溶液中的一種或任意組合。本申請超濾過程中，每隔4-5小時對濾膜進行反洗清潔。本申請中在酸性條件下將殼聚糖與海藻酸鹽通過靜電吸附得到分子量較大的結構，利用殼聚糖與目標蛋白質(烏司他丁)之間的相互作用，增大超濾膜截留分子量，可除去大部分雜質，此步驟可提高超濾的精度。在三乙胺和異丙醇混合溶液存在的情況下，海藻酸鹽、殼聚糖與烏司他丁分離，進一步通過二級超濾以及乙醇沉淀將目標蛋白質與海藻酸鹽、殼聚糖以及其它小分子實現分離。與現有技術相比，本申請所提供的分離純化烏司他丁的方法具有如下優點：(1)采用超濾這種動態過濾方式，操作方便，可控性強；采用不同截留分子量、膜材質不同、多級超濾聯用進行梯度超濾的方式，相比現有技術中每2小時即需對濾膜進行清洗的情況相比，本申請(每隔4-5小時對濾膜進行反洗清潔)延長了清洗所需時間，提高了超濾效率，節約了生產的時間成本。(2)純化工藝簡單，適于大規模生產，而且，烏司他丁的收率高達72％，純化得到的蛋白分子量為67000±200D，抑制胰蛋白酶的活性高達4780IU/mg蛋白(1個IU的定義為：以BAEE為底物，在25度時，每分鐘使△A253增加0.001所需的烏司他丁的量)。(3)縮短了烏司他丁的制備時間，本申請避開了耗時較長的柱純化步驟，僅純化步驟即可至少節約12-24h。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步闡述。這些實施例僅是出于解釋說明的目的，而不限制本發明的范圍和實質。其中，本申請以下實施例中所用超濾膜為非對稱性膜，膜的孔隙率為70-80％；步驟2)中的一級超濾的超濾膜為聚砜膜，超濾膜結構為管式；步驟3)中的二級超濾的濾膜為聚醚砜膜和醋酸纖維素膜的復合膜(聚醚砜膜和醋酸纖維素膜的活化層同向設置)；超濾膜結構為管式；超濾膜的具體結構參數及超濾具體工藝采用本領域常規技術手段。實施例11)取1t澄清尿液，調節pH至6，加入8kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調節濾液pH至4.5，加入8kg殼聚糖(分子量為3萬)和0.4kg海藻酸鈉(分子量為2萬)，攪拌，靜置，棄去上清液，得下層沉淀物1；2)向沉淀物1中加水沖洗，棄去上清液，加入硫酸銨緩沖溶液，調節pH至5，得混合液1，將混合液1超濾得截留液1，其中，截留液1的體積為混合液1體積的1/5，截留分子量為5×104；3)向截留液1中加入溶液A并調節pH至7.5，攪拌，得混合液2，將混合液2進行二級超濾，得截留液2，其中，溶液A為三乙胺和異丙醇的體積比為1∶0.1的混合溶液，超濾的截留分子量為3×104；4)向截留液2中加入1.1倍體積濃度為95％的乙醇進行分級沉淀，過板框；向上清液中加1.9倍相同濃度的乙醇，過板框，得沉淀物2；5)將沉淀物2冷凍干燥，即得純烏司他丁。得到的烏司他丁純品為白色粉末；采用中國藥典(2010)推薦的高效液相色譜法測得分子量為66985D；采用凱氏定氮法測得蛋白含量，其抑制胰蛋白酶的活性為4521IU/mg蛋白；烏司他丁的收率為77％。實施例21)取1t澄清尿液，調節pH至6.5，加入12kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調節濾液pH至6，加入12kg殼聚糖(分子量為3萬)和0.36kg海藻酸鈉(分子量為5萬)，攪拌，靜置，棄去上清液，得下層沉淀物1；2)向沉淀物1中加水沖洗，棄去上清液，加入硫酸銨緩沖溶液，調節pH至6，得混合液1，將混合液1超濾得截留液1，其中，截留液1的體積為混合液1體積的1/5，截留分子量為6×104；3)向截留液1中加入溶液A并調節pH至8，攪拌，得混合液2，將混合液2進行二級超濾，得截留液2，其中，溶液A為三乙胺和異丙醇的體積比為1∶0.5的混合溶液，超濾的截留分子量為3×104；4)向截留液2中加入1.2倍體積濃度為95％的乙醇進行分級沉淀，過板框；向上清液中加4倍相同濃度的乙醇，過板框，得沉淀物2；5)將沉淀物2干燥，即得純烏司他丁。其中，本實施例得到的烏司他丁純品為白色粉末；采用中國藥典(2010)推薦的高效液相色譜法測得分子量為67098D；采用凱氏定氮法測得蛋白含量，其抑制胰蛋白酶的活性為4780IU/mg蛋白；烏司他丁的收率為72％。實施例31)取1t澄清尿液，調節pH至6.5，加入10kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調節濾液pH至5，加入10kg殼聚糖(分子量為5萬)和0.1kg海藻酸鈉(分子量為5萬)，攪拌，靜置，棄去上清液，得下層沉淀物1；2)向沉淀物1中加水沖洗，棄去上清液，加入硫酸銨緩沖溶液，調節pH至7，得混合液1，將混合液1超濾得截留液1，其中，截留液1的體積為混合液1體積的1/5，截留分子量為7×104；3)向截留液1中加入溶液A并調節pH至7，攪拌，得混合液2，將混合液2進行二級超濾，得截留液2，其中，溶液A為三乙胺和異丙醇的體積比為1∶0.2的混合溶液，超濾的截留分子量為3.5×104；4)向截留液2中加入1.5倍體積濃度為95％的乙醇進行分級沉淀，過板框；向上清液中加4倍相同濃度的乙醇，過板框，得沉淀物2；5)將沉淀物2真空干燥，即得純烏司他丁。其中，本實施例得到的烏司他丁純品為白色粉末；采用中國藥典(2010)推薦的高效液相色譜法測得分子量為66898D；采用凱氏定氮法測得蛋白含量，其抑制胰蛋白酶的活性為4667IU/mg蛋白；烏司他丁的收率為79％。對比例11)稱取1tpH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質，并用精密pH試紙測定，調節尿液pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脫1h，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品；2)稱取烏司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；所述洗脫液A為0.01-0.3mol/L的醋酸鹽緩沖液；陰離子交換柱用3.0L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在130mL/mim，所述洗脫液B為0.01-0.5mol/L醋酸鈉和0.1-5mol/LNaCl的緩沖液；用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130mL/min，得洗脫液1；3)將洗脫液1調節pH＝7.5后進行超濾，得截留液1，其中，超濾的壓力為0.1MPa，溫度為30℃，截留分子量為3×104；4)將截留液1冷凍干燥，即得純烏司他丁。其中，本實施例得到的烏司他丁純品為白色粉末；采用中國藥典(2010)推薦的高效液相色譜法測得分子量為75000D；采用凱氏定氮法測得蛋白含量，其抑制胰蛋白酶的活性為4200IU/mg蛋白；烏司他丁的收率為58％。對比例21)取1t澄清尿液，調節pH至6.5，加入12kg硅膠，攪拌，過濾，得濾液，調節濾液pH至6，加入12kg殼聚糖(分子量為3萬)，攪拌，靜置，倒出上清，得下層沉淀物1；2)向沉淀物1中加水沖洗，倒出上清；加入硫酸銨緩沖溶液，攪拌后離心，得上清2，將上清2中加入調節pH至6.5，進行超濾，壓力為0.1-0.3MPa，溫度為30℃，截留分子量為3×104；然后加入1.1-1.9倍體積濃度為95％的乙醇進行分級沉淀，過板框；向上清液中加1.9-4倍相同濃度的乙醇，過板框，得沉淀物2；3)將沉淀物2干燥，即得純烏司他丁。其中，本實施例得到的烏司他丁純品為白色粉末；采用中國藥典(2010)推薦的高效液相色譜法測得分子量為66889D；采用凱氏定氮法測得蛋白含量，其抑制胰蛋白酶的活性為4012IU/mg蛋白；烏司他丁的收率為52％。上述實施例僅作為解釋本發明的目的，本發明的范圍不受此限制。對本領域的技術人員來說所做的修改是顯而易見的，本發明僅受所附權利要求范圍的限制。