雙重刺激響應型膠原蛋白多肽聚合物及其制備方法與流程

本發明涉及一種膠原蛋白多肽聚合物及其制備方法，特別是一種雙重刺激響應型膠原蛋白多肽聚合物及其制備方法。

背景技術：

膠原蛋白肽(collagen)是在哺乳動物體內大量存在的一種蛋白質多肽，其種類共有28種之多，它主要分布于皮膚、筋腱、血管、內臟和骨骼中，在這些組織中，膠原蛋白主要提供了結構穩定性，并參與許多代謝過程。在空間結構上，其顯示出特殊的三股螺旋纏繞的結構，被稱為膠原蛋白三螺旋結構。該三螺旋結構是由三條多肽鏈相互纏結緊密組裝的右手超螺旋結構，而每一條多肽鏈又是左手螺旋的、延伸的聚脯氨酸第二型(polyprolinetypeII,PPII)螺旋結構。最典型的重復序列單元是由Pro-Hyp-Gly(脯氨酸-羥脯氨酸-甘氨酸)組成，其結構如下所示。

與其它聚合物相比，多肽類聚合物具有有序的二級結構，其在生物體內的功能性也都與其二級結構緊密相關，目前對膠原蛋白肽的研究主要集中于合成膠原蛋白多肽及其構象的穩定性方面，對其智能行為的研究還不多見。所以將多肽類聚合物進行化學改性，賦予其刺激響應性，可以豐富其在作為生物材料、藥物負載等領域的應用。誘導智能多肽聚合物改變的外部因素是多方面的，例如pH值，溫度，金屬離子，光或輻射，離子濃度等，pH敏感型多肽聚合物就是其中一類，可以通過改變溶液的pH值，來控制多肽聚合物的空間構象。2008年，Chmielewski等人利用多肽固相合成手段，設計合成了含有羧酸鹽組分的具有pH刺激響應行為的膠原蛋白多肽聚合物(J.Chmielewski,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,8429-8432)，當環境pH值為中性時，由于羧酸根之間的靜電排斥作用，不利于膠原蛋白肽三螺旋結構的穩定性；而當改變pH值處于酸性環境下后，羧酸根質子化，消弱靜電排斥作用，有利于三螺旋結構的穩定。2006年，Moroder等人設計合成膠原蛋白肽具有光響應性的偶氮苯單元的膠原蛋白肽(L.Moroder,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,7015-7018.)，賦予膠原蛋白光敏性，通過改變光照條件來控制偶氮苯單元的順反構型，從而影響膠原蛋白肽的有序構象。

綜上，已有的對于膠原蛋白肽的研究，都還集中于單一的刺激因素，具有雙重刺激響應性的膠原蛋白肽還沒有報道。

技術實現要素：

為了擴大只具有單一刺激響應行為的膠原蛋白多肽聚合物的應用范圍，拓展其在新型生物材料、醫學及藥物緩釋等方面的應用，本發明通過有效的合成方法，制備一種具有pH和溫度雙重響應型膠原蛋白肽聚合物，我們可以通過改變該聚合物所處的pH值環境，來改變動態鍵聯的成鍵率，來實現其pH響應性；通過改變溫度，來實現其隨溫度變化脫水聚集和再吸水溶解的相變過程，來實現其溫度響應性。該類具有雙重響應特性的膠原蛋白多肽聚合物，在藥物的控制釋放領域具有潛在的應用價值。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種雙重刺激響應型膠原蛋白多肽聚合物，其特征在于該聚合物是以膠原蛋白多肽為主鏈，該膠原蛋白多肽側鏈上的氨基通過動態鍵聯反應接枝烷氧醚樹枝化基元側鏈，從而得到雙重刺激響應型膠原蛋白多肽聚合物，

其結構式為：

n＝60～80；

所述的膠原蛋白多肽的結構式為：

所述烷氧醚樹枝化基元側鏈G1的結構式為：

上述的動態鍵聯反應為：肟鍵、烯胺鍵或酰腙鍵。

一種制備上述的雙重刺激響應型膠原蛋白多肽聚合物的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.在冰浴和惰性氣氛下，將N-(叔丁氧羰基)-4-羥基-L-脯氨酸和NaH按1:(1.5～2.5)的摩爾比溶于四氫呋喃中，攪拌反應15～30分鐘后，然后回復至室溫，逐滴滴加自制的TsOH保護的2-疊氮基乙醇(制備方法參考文獻：M Wang，etal.,J.Org.Chem.,2010,75,8604–8614.)的THF溶液；滴加完畢后，攪拌反應20～24小時，而后滴加甲醇終止反應；將溶劑通過旋轉蒸發儀蒸出，殘留物溶于二氯甲烷DCM，先經10wt％KHSO₄水溶液洗滌，再用飽和食鹽水洗滌，DCM萃取分液后，干燥，有機相并過濾；再經分離提純即得化合物A；所述的N-(叔丁氧羰基)-4-羥基-L-脯氨酸與2-疊氮基乙醇：1：(1.5～2)；

b.在冰鹽浴和惰性氣體保護下，將步驟a所得化合物A和1-羥基苯并三唑按1：(1.1～1.2)的摩爾比溶于N，N-二甲基甲酰胺DMF中，然后攪拌10～15分鐘，再加入溶有甘氨酸甲酯鹽酸鹽HCl-Gly-OMe與N,N-二異丙基乙胺DiEA的DCM溶液，然后繼續攪拌5～7分鐘，最后緩慢滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽EDC·HCl的DCM溶液；在冰浴下攪拌4～6小時后，室溫繼續攪拌6～8小時至反應完全；蒸干溶劑后殘留物用DCM溶解，先后用10wt％KHSO₄水溶液和飽和食鹽水洗滌，萃取分液后，干燥有機相并過濾；再經分離提純得淡黃色油狀的化合物B；所述的化合物A、甘氨酸甲酯鹽酸鹽、N,N-二異丙基乙胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為：1：(1.5～2)：(2.5～3)：(1.2～1.5)；

c.將步驟b所得化合物B溶于二氯甲烷DCM中，在冰浴下緩慢滴加三氟乙酸TFA的DCM溶液，攪拌至反應完全，加入甲醇蒸干溶劑得到化合物C；所述的化合物B與三氟乙酸的摩爾比為：1：(6～10)；

d.在惰性氣氛和冰鹽浴下，將步驟c所得化合物C和N，N-二異丙基乙胺DiEA按1：(1.2～1.5)的摩爾比溶于二氯甲烷DCM溶液中，再緩慢滴加溶有脯氨酸活性酯的DCM 溶液；在室溫下攪拌至反應完全；蒸干溶劑后殘留物用DCM溶解，先后用10wt％KHSO₄水溶液和飽和食鹽水洗滌DCM相，萃取分液后，干燥有機相并過濾；再經分離提純即得淡黃色結晶化合物D；所述的化合物C和脯氨酸活性酯的摩爾比為：1：(1.5～2)；

e.將步驟d所得化合物D溶于甲醇和水以3:1的體積比的混合溶劑中，冰浴下加入一水合氫氧化鋰，攪拌0.5～1h后，在室溫下，再反應2～3h，在室溫下蒸干溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯后，用10wt％KHSO₄水溶液調節pH至5～6，用飽和食鹽水洗滌有機相后，萃取，干燥，過濾，再經分離提純，即得淡黃色結晶化合物E；所述的化合物D和一水合氫氧化鋰的摩爾比為：1：(2～2.5)；

f.將步驟e所得化合物E與五氯苯酚按1：(1～1.2)的摩爾比溶于DMF中，在冰鹽浴和惰性氣體保護下，加入溶有(1.2～1.5)倍量的EDC·HCl的DMF，室溫下繼續攪拌至反應完全，蒸干溶劑，分離提純，即得淡黃色結晶化合物F；

g.將步驟f所得化合物F溶于乙酸乙酯EA中，在冰浴下緩慢滴加2mol/L(8～10)倍量的氯化氫的乙酸乙酯溶液HCl/EA溶液，攪拌反應完全，室溫下蒸出溶劑后即得大單體G；

h.在惰性氣體保護下，將步驟g所得大單體G溶于DMF中，加入N,N-二異丙基乙胺DiEA后，攪拌反應至粘度不再增加后，再加入三苯基膦PPh₃的DMF溶液，在48～50℃，反應24～30小時后，用乙醚沉淀得到目標聚合物P。

i.將步驟h所得聚合物P在酸性水溶液中溶解，加入(0.6～2)倍量的烷氧醚樹枝化基元G1，然后將其pH值用1mol/L的NaOH水溶液調至10.5～12.1，常溫下攪拌10～15分鐘即得雙重刺激響應型膠原蛋白肽。

本發明通過液相合成法合成了側鏈帶有疊氮基團的膠原蛋白三肽大單體，然后通過活性酯縮合聚合反應得到側鏈帶有疊氮基團的膠原蛋白肽聚合物，然后把聚合物側鏈上疊氮基團還原得到端基為氨基基團的上述聚合物。該類聚合物在水溶液中可通過溶液pH值的改變來調控膠原蛋白肽特有的三股螺旋構象的穩定性；側鏈的氨基基團可以通過亞胺鍵動態鍵聯接枝烷氧醚樹枝化基元側鏈，賦予其溫度敏感性；從而得到具有pH與溫度雙重刺激響應行為的膠原蛋白肽聚合物。這一發明為我們設計制備其他具有多重響應行為的膠原蛋白肽材料提供了新的思路，膠原蛋白本身作為一種人體組織中重要的結構蛋白，其本身所具有的生物相容性使其在生物骨骼、人造血管等仿生材料領域具有潛在的應用價值。

附圖說明

圖1為本發明中的大單體合成路線以及目標聚合物的聚合方法。

圖2為本發明大單體化合物G的核磁氫譜表征(重水25℃，500MHz)。由圖可知，¹H NMR(D₂O):δ＝1.89-2.63(m,6H,CH₂),3.14-3.58(m,4H,CH₂),3.58-3.84(m,4H,CH₂), 3.85-4.09(m,2H,CH₂),4.28-4.43(m,1H,CH),4.54-4.63(m,1H,CH),4.64-4.70(m,1H,CH)。證明得到了大單體化合物G。

圖3為本發明的目標聚合物P的核磁氫譜表征(重水25℃，500MHz)。由圖可知，¹H NMR(D₂O):δ＝1.69-2.42(m,6H,CH₂),2.96-3.08(m,2H,CH₂),3.29-3.50(m,2H,CH₂),3.51-3.67(m,2H,CH₂),3.68-4.15(m,4H,CH₂),4.15-4.27(m,1H,CH),4.27-4.43(m,1H,CH),4.43-4.59(m,1H,CH)。證明得到了聚合物P。

圖4為一系列加入不同比例烷氧醚側鏈的動態鍵聯接枝的膠原蛋白聚合物在水溶液中的濁度曲線。

圖5為膠原蛋白肽聚合物P與接枝了烷氧醚側鏈的雙響應型聚合物在不同pH值水溶液中的圓二色光譜圖，由該圖可知，目標聚合物能夠通過pH的改變來控制其三螺旋結構的形成。

具體實施方式

下面結合具體實例對本發明作進一步闡述，但這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明闡述的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例一：本發明的雙重刺激響應型膠原蛋白多肽聚合物P的合成方法

1、參見圖1，本發明的膠原蛋白多肽大單體化合物G的制備方法為：

化合物A的合成：將N-(叔丁氧羰基)-4-羥基-L-脯氨酸(1當量,11.59g)溶于干燥THF(50mL)中，然后在冰浴和氮氣保護下，加入NaH(2.5當量,3.02g)，冰浴下攪拌半小時，然后回復至室溫，逐滴滴加自制的TsOH保護的2-疊氮基乙醇(1.8當量,21.7g)的THF(100mL)溶液；滴加完畢后再將反應體系放置于室溫下攪拌反應24小時，而后滴加甲醇終止反應；將溶劑通過旋轉蒸發儀蒸出，殘留物溶于二氯甲烷DCM，先經KHSO₄(10％)水溶液洗滌兩次，再用飽和食鹽水洗滌一次，DCM萃取分液后，用MgSO₄干燥有機相并過濾。再用硅膠柱層析提純，淋洗劑為Hex/EA(5：1，v/v)，蒸干溶劑，即得化合物淡黃色油狀化合物A。

化合物B的合成：將化合物A(1當量,0.67g)、1-羥基苯并三唑(HOBt)(1.1當量,0.332g)、溶于干燥N，N-二甲基甲酰胺DMF(4mL)中，然后在冰鹽浴和氮氣保護下攪拌10分鐘，再將溶有甘氨酸甲酯鹽酸鹽HCl-Gly-OMe(2當量,0.56g)與N,N-二異丙基乙胺DiEA(3當量,0.86g)的DCM(4mL)溶液，然后在冰鹽浴和氮氣氣氛下繼續攪拌5分鐘，最后緩慢滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽EDC·HCl(1.5當量，0.63g)的DCM(4mL)溶液；在冰鹽浴中攪拌4小時后去除冰鹽浴，回復至室溫繼續攪拌8小時至反應完全。蒸干溶劑后殘留物用DCM溶解，先后用KHSO₄(10％)水溶液和飽和食鹽水洗滌DCM相，萃取分液 后，用MgSO₄干燥有機相并過濾。再用硅膠柱層析提純，淋洗劑為Hex/EA(5:1,v/v)，；經分離提純得淡黃色油狀的化合物B。

化合物C的合成：將化合物B(1當量,0.55g)溶于二氯甲烷DCM(4mL)中，在冰浴下緩慢滴加三氟乙酸TFA(6當量,1.007g)的DCM(4mL)溶液，攪拌4小時反應完全，加入甲醇蒸干溶劑得到化合物C。

化合物D的合成：將化合物C(1當量,0.68g)和N,N-二異丙基乙胺DiEA(1.5當量,0.35g)溶于二氯甲烷DCM(8mL)溶液中,在惰性氣氛和冰鹽浴下，緩慢滴加溶有脯氨酸活性酯(1.2當量,0.82g)的DCM溶液(3mL)；在室溫下攪拌8小時反應完全；蒸干溶劑后殘留物用DCM溶解，先后用KHSO₄(10％)水溶液和飽和食鹽水洗滌DCM相，萃取分液后，用MgSO₄干燥有機相并過濾。再用硅膠柱層析提純，淋洗劑為DCM/MeOH(20:1,v/v)，蒸干溶劑，即得淡黃色結晶化合物D。

化合物E的合成：將化合物D(1當量,0.76g)溶于MeOH/H2O(3:1)的混合溶劑中，0℃冰浴下加入一水合氫氧化鋰(2當量,0.14g)，攪拌1h后回復至室溫，再反應3h后，在室溫下蒸干溶劑。殘留物溶于EA后，用10％KHSO₄水溶液調節pH至5～6，用飽和食鹽水洗滌有機相后，萃取，MgSO₄干燥，過濾，再用硅膠柱層析提純，淋洗劑為DCM/MeOH(5:1,v/v)，蒸干溶劑，即得淡黃色結晶化合物E。

化合物F的合成：化合物E(1當量,0.47g)與五氯苯酚(1.1當量,0.31g)溶于干燥DMF(4mL)中，置于-15℃冰鹽浴和N₂氣保護下，加入4mL溶有EDC·HCl(1.2當量,0.24g)的DMF，回復至室溫后繼續攪拌24小時后至反應完全，蒸干溶劑，用硅膠柱層析提純，淋洗劑為DCM/MeOH(40:1,v/v)，蒸干溶劑，即得淡黃色結晶化合物F。

大單體G的合成：將所得化合物F(1當量,0.51g)溶于乙酸乙酯EA(1mL)中，在冰浴下緩慢滴加2M的氯化氫的乙酸乙酯溶液HCl/EA(10當量,3.6mL)溶液，攪拌4小時至反應完全，室溫下蒸出溶劑后即得大單體G。

2、“一鍋法”制備膠原蛋白多肽聚合物P：

本發明采用“一鍋法”實現了大單體的縮聚及側鏈疊氮基團的還原，得到目標產物P。

聚合物P的合成：大單體G(1當量,0.213g)溶于DMF(0.25mL)中，加入DiEA(2當量,86mg)后在N₂保護下攪拌4天，待粘度不再增加后，補加少許DMF(0.1mL)溶劑，并加入三苯基膦PPh₃(2.5當量,220mg)，油浴加熱至50℃，反應24小時后，用乙醚沉淀析出兩次后得到目標聚合物，凍干機抽干溶劑得到淡黃色粉末狀目標聚合物，由附圖2可知： ¹H NMR(D₂O)：δ＝1.69-2.42(m,6H,CH₂),2.96-3.08(m,2H,CH₂),3.29-3.50(m,2H,CH₂),3.51-3.67(m,2H,CH₂),3.68-4.15(m,4H,CH₂),4.15-4.27(m,1H,CH),4.27-4.43(m,1H,CH), 4.43-4.59(m,1H,CH).證明得到了目標聚合物P：P-PO(NH₂)G

實施例二：本發明中膠原蛋白肽聚合物刺激響應行為的表征

1、本發明雙重刺激響應型膠原蛋白肽聚合物的pH敏感行為按照如下方法進行測試：

通過圓二色光譜對聚合物P-PO(NH₂)G的二級結構進行了表征，如附圖5所示，常溫下，在pH為12.2的堿性水溶液中，其CD信號譜圖在225nm處顯示出一個正的吸收峰，膠原蛋白肽主鏈表現為規整的三股螺旋構象；同樣溫度下，在pH為3.1的酸性水溶液中，其在225nm出的正吸收峰消失，表示其三股螺旋構象遭到破壞。我們也可以先在酸性水溶液中溶解聚合物，然后再通過加入堿液(NaOH等)使其pH到堿性范圍，可以通過其科頓信號來判斷其主鏈構象由無規線團到有序的三股螺旋的轉變。

在酸性條件下加入了烷氧醚側鏈后，其在225nm處仍為負的吸收峰，表明此時處于無規構象；而將其pH值調節至堿性，其在225nm處出現了一個正的吸收峰，說明其構象由無規轉為了膠原蛋白肽的三螺旋構象。

2、本發明雙響應型膠原蛋白肽的溫度敏感行為按照如下方法進行測試：

采用具有溫控裝置的紫外-可見光譜儀對改性膠原蛋白肽水溶液的相變過程進行跟蹤，溫度范圍設置為30～80℃，測試過程為先加熱，后冷卻，測試了一系列加入不同比例烷氧醚側鏈的樣品。最終分別得到加熱和冷卻過程的濁度曲線，如圖4所示，證明了聚合物的溫敏行為過程。